本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及蛋白質(zhì)pplea3-3在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)受的環(huán)境脅迫多種多樣，主要有干旱和高鹽等。運(yùn)用基因工程技術(shù)改良農(nóng)作物可以提高其對(duì)逆境的抵抗能力，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，這是現(xiàn)在現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)話(huà)題。近年來(lái)人們從生理、生化、代謝、生態(tài)、遺傳等角度對(duì)于植物響應(yīng)各種非生物脅迫做了大量研究。隨著后來(lái)分子生物學(xué)的發(fā)展，人們從分子水平上對(duì)于植物抗逆機(jī)制有了更進(jìn)一步研究，在基因組成、表達(dá)調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)等方面都積累了豐富的資料，為基因工程改良植物的抗脅迫性能開(kāi)拓了新的途徑，其中最關(guān)鍵的技術(shù)瓶頸問(wèn)題是有效抗逆基因的篩選與功能發(fā)現(xiàn)。苔蘚植物是5億年前古奧陶紀(jì)出現(xiàn)的陸地先鋒植物，其中“莖葉體”的配子體在其生活史中是主要營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段。“莖葉體”葉片由單層細(xì)胞組成，僅在其“中肋”處由少數(shù)幾層細(xì)胞組成，缺乏輸導(dǎo)組織和氣孔等調(diào)控水分代謝的組織結(jié)構(gòu)，保留著明顯的水生植物的特征。當(dāng)原始“苔蘚植物”離水登陸時(shí)，由于缺乏水分輸導(dǎo)和調(diào)控系統(tǒng)，水分虧損和溫度驟變會(huì)成為主要的兩大脅迫。巨大的選擇壓力迫使苔蘚植物進(jìn)化出不同于維管植物(如蕨類(lèi)、種子植物)的逆境應(yīng)對(duì)機(jī)制，如存在于苔蘚植物細(xì)胞內(nèi)的一些抗逆基因可以保護(hù)細(xì)胞免于逆境傷害。小立碗蘚是一種苔蘚植物，是研究水生植物向陸生植物進(jìn)化過(guò)程的理想物種。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提高植物的抗逆性。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了蛋白質(zhì)pplea3-3在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用；所述蛋白質(zhì)pplea3-3為a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2可由554個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個(gè))rrrrrpoly-his2-10(通常為6個(gè))hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a3)中的蛋白質(zhì)pplea3-3，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白質(zhì)pplea3-3可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述a3)中的蛋白質(zhì)pplea3-3的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗逆性具體可為增加植物抗逆性。編碼所述蛋白質(zhì)pplea3-3的核酸分子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述編碼所述蛋白質(zhì)pplea3-3的核酸分子可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)編碼區(qū)是序列表中序列1所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的dna分子；b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列表中序列1由1665個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)pplea3-3的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的蛋白質(zhì)pplea3-3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼蛋白質(zhì)pplea3-3且具有蛋白質(zhì)pplea3-3的功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述應(yīng)用中，所述植物可為如下c1)至c5)的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)十字花科植物；c4)擬南芥；c5)野生型擬南芥columbia。上述應(yīng)用中，所述抗逆性可為抗鹽性和/或抗旱性。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種培育抗逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括使所述蛋白質(zhì)pplea3-3在受體植物中表達(dá)或過(guò)表達(dá)、或提高受體植物中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的活性，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；與所述受體植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性提高。上述方法中，所述“使所述蛋白質(zhì)pplea3-3在受體植物中表達(dá)或過(guò)表達(dá)、或提高受體植物中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的活性”可通過(guò)多拷貝、改變啟動(dòng)子、調(diào)控因子、轉(zhuǎn)基因等本領(lǐng)域熟知的方法，達(dá)到表達(dá)或過(guò)表達(dá)所述蛋白質(zhì)pplea3-3、或提高所述蛋白質(zhì)pplea3-3的活性的效果。上述方法中，所述“使所述蛋白質(zhì)pplea3-3在受體植物中表達(dá)或過(guò)表達(dá)、或提高受體植物中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的活性”具體可為向受體植物中導(dǎo)入所述蛋白質(zhì)pplea3-3的編碼基因。上述方法中，所述蛋白質(zhì)pplea3-3的編碼基因可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)編碼區(qū)是序列表中序列1所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的dna分子；b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的dna分子。其中，序列表中序列1由1665個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。上述方法中，所述受體植物可為如下c1)至c5)的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)十字花科植物；c4)擬南芥；c5)野生型擬南芥columbia。上述方法中，所述“向受體植物中導(dǎo)入所述蛋白質(zhì)pplea3-3的編碼基因”可通過(guò)向受體植物中導(dǎo)入重組載體實(shí)現(xiàn)；所述重組載體可為將所述蛋白質(zhì)pplea3-3的編碼基因插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp。所述重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp具體可為將載體ppzp111的限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ識(shí)別序列間的片段(載體ppzp111被限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中序列1自5’末端起第1至1662位所示的dna分子，得到中間載體；將中間載體的限制性?xún)?nèi)切酶sacⅰ和xhoⅰ識(shí)別序列間的片段(中間載體被限制性?xún)?nèi)切酶sacⅰ和xhoⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列3自5’末端起第7位至第726位所示的dna分子。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp。所述重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp具體可為將重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp的限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ識(shí)別序列間的片段(重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp被限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的dna分子。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3。所述重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3具體可為將載體ppzp111的限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ識(shí)別序列間的片段(載體ppzp111被限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列1所示的dna分子，得到中間載體；將該中間載體的限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ識(shí)別序列間的片段(中間載體被限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的dna分子。所述“與受體植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性提高”具體體現(xiàn)為如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)和/或(c4)和/或(c5)和/或(c6)：(c1)逆境條件下，轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)長(zhǎng)于所述受體植物；(c2)逆境條件下，轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于所述受體植物；(c3)逆境條件下，轉(zhuǎn)基因植物葉片中的葉綠素含量高于所述受體植物；(c4)逆境條件下，轉(zhuǎn)基因植物葉片中的丙二醛含量低于所述受體植物；(c5)逆境條件下，轉(zhuǎn)基因植物葉片中的脯氨酸含量高于所述受體植物；(c6)逆境條件下，轉(zhuǎn)基因植物葉片中的sod含量高于所述受體植物。所述存活率具體可為在組織培養(yǎng)的條件下或營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)的條件下的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種植物育種方法，包括如下步驟：增加植物中所述蛋白質(zhì)pplea3-3的含量和/或活性，從而提高植物的抗逆性。上述任一所述方法中，所述抗逆性可為抗鹽性和/或抗旱性。所述抗逆性為抗旱性時(shí)，所述逆境條件具體可在干旱環(huán)境中生長(zhǎng)。所述干旱環(huán)境具體可為mannitol含量為100mm以上的環(huán)境。所述抗逆性為抗鹽性時(shí)，所述逆境條件具體可為在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)。所述高鹽環(huán)境具體可為nacl含量為50mm以上的環(huán)境。上述任一所述的方法在植物育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)pplea3-3能提高植物的抗逆性：與野生型擬南芥相比，t3代純合擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥株系line1、t3代純合擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3:egfp擬南芥株系line4和t3代純合擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3擬南芥株系line7的抗鹽性和抗旱性顯著增加。因此，可以利用蛋白質(zhì)pplea3-3調(diào)控植物抗逆性。本發(fā)明對(duì)植物抗逆性的新材料的選育具有重要應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為不同逆境脅迫下pplea3-3基因的表達(dá)模式。圖2為重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp、重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp和重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為轉(zhuǎn)pplea3-3基因擬南芥的分子檢測(cè)結(jié)果。圖4為轉(zhuǎn)pplea3-3基因擬南芥的轉(zhuǎn)錄分析檢測(cè)結(jié)果。圖5為鑒定轉(zhuǎn)pplea3-3基因擬南芥的抗逆性。圖6pplea3-3蛋白的亞細(xì)胞定位分析。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。小立碗蘚和bcd固體培養(yǎng)基均記載在如下文獻(xiàn)中：covedj，perroudpf，charronaj，mcdanielsf，khandelwala，quatranors.isolationofdna，rna，andproteinfromthemossphyscomitrellapatensgametophytes.coldspringharbprotoc.2009feb；2009(2):pdb.prot5146.doi:10.1101/pdb.prot5146.公眾可從首都師范大學(xué)(即申請(qǐng)人處)獲得小立碗蘚，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。載體ppzp111記載在如下文獻(xiàn)中：hajdukiewiczp，svabz，maligap.thesmall，versatileppzpfamilyofagrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.plantmolbiol.1994sep；25(6)：989-94.公眾可從首都師范大學(xué)(即申請(qǐng)人處)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。野生型擬南芥columbia記載在如下文獻(xiàn)中：kimh，hyuny，parkj，parkm，kimm，kimh，leem，moonj，leei，kimj.ageneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughfveinarabidopsisthaliana.naturegenetics.2004,36:167-171.公眾可從首都師范大學(xué)(即申請(qǐng)人處)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。野生型擬南芥columbia在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)野生型擬南芥。peasy-bluntsimple載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。光照培養(yǎng)是指在溫度25℃、相對(duì)濕度70％進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為40～60μmol/m2.s-1。實(shí)施例1、蛋白質(zhì)pplea3-3的發(fā)現(xiàn)與pplea3-3基因的克隆一、蛋白質(zhì)pplea3-3的發(fā)現(xiàn)1、樣本的制備取在bcd固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)7天的小立碗蘚莖葉體，轉(zhuǎn)移至浸濕的濾紙上，然后共同置于500ml燒杯中，吸水紙封口，然后置于溫度為24±1℃、相對(duì)濕度為30±5％的培養(yǎng)室中處理3天，得到干旱處理的小立碗蘚莖葉體。按照上述方法，將“溫度為24±1℃、相對(duì)濕度為30±5％的培養(yǎng)室”替換為“溫度為24±1℃、相對(duì)濕度為70±5％的培養(yǎng)室”，其它步驟均不變，得到正常處理的小立碗蘚莖葉體。2、蛋白質(zhì)pplea3-3的發(fā)現(xiàn)利用酚抽提法提取干旱處理的小立碗蘚莖葉體的蛋白質(zhì)，命名為干旱處理-蛋白質(zhì)；然后采用ief/sds-page雙向電泳技術(shù)和熒光差異凝膠電泳法分離，獲得干旱處理-蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)圖譜。按照上述方法，將“干旱處理的小立碗蘚莖葉體”替換為步驟1中得到的正常處理的小立碗蘚莖葉體，其它步驟均不變，得到正常處理-蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)圖譜。用imagemaster2dplatinum軟件和decyder2dversion6.5software分析干旱處理-蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)圖譜和正常處理-蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)圖譜，與正常處理相比，獲得若干干旱處理的小立碗蘚莖葉體中豐度變化超過(guò)2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)(簡(jiǎn)稱(chēng)差異蛋白點(diǎn))。分離差異蛋白點(diǎn)，然后分別用胰蛋白酶處理，得到的多肽用malditof/tofms和ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常處理相比，有一種蛋白質(zhì)在ief/sds-page雙向電泳凝膠上被上調(diào)了9.6倍，在熒光差異凝膠電泳凝膠上被上調(diào)了14.6倍，推測(cè)可能與小立碗蘚的抗逆性相關(guān)；在下文中，將該蛋白質(zhì)命名為蛋白質(zhì)pplea3-3，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。二、pplea3-3基因的克隆本發(fā)明的申請(qǐng)人從小立碗蘚中克隆出蛋白質(zhì)pplea3-3的編碼基因。具體方法如下：1、模板的獲得：采用trizol法提取小立碗蘚的莖葉體的總rna，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cdna。2、人工合成引物cds-f：5’-ggatccatgaatcagtacggaagaga-3’(下劃線(xiàn)為限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ的識(shí)別序列)和cds-r：5’-ggtaccgtggtgcagcttctccttg-3’(下劃線(xiàn)為限制性?xún)?nèi)切酶kpnⅰ的識(shí)別序列)。3、完成步驟1和2后，以步驟1獲得的cdna為模板，以步驟2合成的cds-f和cds-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到約1700bp的雙鏈dna分子,然后進(jìn)行純化、回收，得到dna片段1。4、將dna片段1連接至peasy-bluntsimple載體，得到重組質(zhì)粒peasy-pplea3-3。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，重組質(zhì)粒peasy-pplea3-3含有序列表中的序列1自5’末端起第1至1662位所示的dna分子，表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)pplea3-3。實(shí)施例2、不同逆境脅迫下的pplea3-3基因的表達(dá)模式1、取在bcd固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)7天的小立碗蘚莖葉體，置于含150mmnacl的bcd固體培養(yǎng)基中處理24h，得到高鹽處理莖葉體1。2、按照步驟1的方法，將24h替換為48h，得到高鹽處理莖葉體2。3、按照步驟1的方法，將24h替換為96h，得到高鹽處理莖葉體3。4、取在bcd固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)7天的小立碗蘚莖葉體，置于bcd固體培養(yǎng)基處理24h，得到正常處理莖葉體1。5、按照步驟4的方法，將24h替換為48h，得到正常處理莖葉體2。6、按照步驟4的方法，將24h替換為96h，得到正常處理莖葉體3。7、取在bcd固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)7天的小立碗蘚莖葉體，置于含250mm甘露醇的bcd固體培養(yǎng)基中處理24h，得到滲透脅迫處理莖葉體1。8、按照步驟7的方法，將24h替換為48h，得到滲透脅迫處理莖葉體2。9、按照步驟7的方法，將24h替換為96h，得到滲透脅迫處理莖葉體3。提取高鹽處理莖葉體1、高鹽處理莖葉體2、高鹽處理莖葉體3、正常處理莖葉體1、正常處理莖葉體2、正常處理莖葉體3、干旱處理莖葉體1、干旱處理莖葉體2或干旱處理莖葉體3的總rna，并對(duì)各總rna中的pplea3-3基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，引物為5’-cgccgtgttgaacctggatatg-3’和5’-accgtgatggccaagatcagtaag-3’。內(nèi)參為actin2基因，內(nèi)參的引物為5’-gtcgtacaaccggtattgtg-3’和5’-gagctggtctttgaggtttc-3’。以正常處理莖葉體1中的pplea3-3基因的表達(dá)量作為1，各處理莖葉體中的pplea3-3基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1(圖1中，ppck24h為正常處理莖葉體1，ppck48h為正常處理莖葉體2，ppck96h為正常處理莖葉體3，ppnacl24h為高鹽處理莖葉體1，ppnacl48h為高鹽處理莖葉體2，ppnacl96h為高鹽處理莖葉體3，ppmanitol24h為滲透脅迫處理莖葉體1，ppmanitol48h為滲透脅迫處理莖葉體2，ppmanitol96h為滲透脅迫處理莖葉體3)：與正常處理莖葉體1相比，pplea3-3基因在高鹽處理莖葉體1、高鹽處理莖葉體2、高鹽處理莖葉體3、滲透脅迫處理莖葉體1、滲透脅迫處理莖葉體2和滲透脅迫處理莖葉體3中均上調(diào)表達(dá)，表達(dá)倍數(shù)分別為13000倍、44000倍、71000倍、174000倍、142000倍和92000倍。結(jié)果表明，pplea3-3基因在響應(yīng)高鹽脅迫和滲透脅迫的過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥的獲得和抗逆性鑒定一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp的構(gòu)建(1)用限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ雙酶切實(shí)施例1步驟2構(gòu)建的重組質(zhì)粒peasy-pplea3-3，回收約1665bp的dna片段2。(2)用限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ雙酶切載體ppzp111，回收約8.9kb的載體骨架1。(3)將dna片段2與載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒甲。(4)人工合成序列表中序列3所示的雙鏈dna分子。(5)用限制性?xún)?nèi)切酶sacⅰ和xhoⅰ雙酶切步驟(4)合成的雙鏈dna分子，然后進(jìn)行純化、回收，得到dna片段3。(6)用限制性?xún)?nèi)切酶sacⅰ和xhoⅰ雙酶切重組質(zhì)粒甲，回收約9.3kb的載體骨架2。(7)將dna片段3與載體骨架2連接，得到重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體ppzp111的限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ識(shí)別序列間的片段(載體ppzp111被限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列1自5’末端起第1至1662位所示的dna分子，得到中間載體；將中間載體的限制性?xún)?nèi)切酶sacⅰ和xhoⅰ識(shí)別序列間的片段(中間載體被限制性?xún)?nèi)切酶sacⅰ和xhoⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列3自5’末端起第7位至第726位所示的dna分子。重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2中a。2、重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp的構(gòu)建(1)人工合成序列表中序列4所示的雙鏈dna分子。序列表中序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的dna分子為野生型擬南芥中啟動(dòng)atlea3-3基因的啟動(dòng)子序列。(2)用限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ雙酶切步驟(1)合成的雙鏈dna分子，然后進(jìn)行純化、回收，得到dna片段4。(3)用限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ雙酶切重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp，回收約11.0kb的載體骨架3。(4)將dna片段4與載體骨架3連接，得到重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp的限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ識(shí)別序列間的片段(重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp被限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的dna分子。重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2中b。3、重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3的構(gòu)建(1)人工合成序列表中序列1所示的雙鏈dna分子。(2)向載體ppzp111的限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ識(shí)別序列間插入步驟(1)合成的雙鏈dna分子，得到重組質(zhì)粒乙；(3)用限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ雙酶切步驟(2)構(gòu)建的重組質(zhì)粒乙，回收約8.9kb的載體骨架4。(4)將步驟2中(2)得到的dna片段4和載體骨架4連接，得到重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體ppzp111的限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ識(shí)別序列間的片段(載體ppzp111被限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列1所示的dna分子，得到中間載體；將中間載體的限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ識(shí)別序列間的片段(中間載體被限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ和bamhⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的dna分子。重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2中c。二、擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp的植株的獲得1、將重組質(zhì)粒35s::pplea3-3::egfp導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌gv3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為gv3101/35s::pplea3-3:egfp。2、采用擬南芥花序浸花轉(zhuǎn)化法(記載于如下文獻(xiàn)中clough，s.j.，andbent，a.f..floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.(1998)16，735-743.)，將步驟1獲得的gv3101/35s::pplea3-3:egfp轉(zhuǎn)至野生型擬南芥中，獲得t1代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥種子。3、將步驟2獲得的t1代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥種子播種于含有50mg/l卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上，能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(抗性苗)即為t1代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp陽(yáng)性苗，t1代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp陽(yáng)性苗收到的種子即為t2代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥種子。4、將步驟3篩選得到的不同株系的t2代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥種子播種于含有50mg/l卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，如果某株系中能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(抗性苗)的數(shù)目與不能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(非抗性苗)的數(shù)目比例為3：1，則該株系為pplea3-3基因插入一個(gè)拷貝的株系，該株系中的抗性苗收到的種子即為t3代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥種子。5、將步驟4篩選得到的t3代擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥種子再次播種于含有50mg/l卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，均為抗性苗的即為t3代純合擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥。將其中3個(gè)t3代純合擬轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp擬南芥株系分別命名為line1、line2和line3。三、擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3:egfp的植株的獲得按照上述步驟二的方法，將重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp替換為重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3:egfp，其它步驟均相同，得到t3代純合擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3:egfp擬南芥。將其中3個(gè)t3代純合擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3:egfp擬南芥株系分別命名為line4、line5和line6。四、擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3的植株的獲得按照上述步驟二的方法，將重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp替換為重組質(zhì)粒lea3pro::pplea3-3，其它步驟均相同，得到t3代純合擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3擬南芥。將其中3個(gè)t3代純合擬轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3擬南芥株系分別命名為line7、line8和line9。五、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的獲得按照上述步驟二的方法，將重組質(zhì)粒35s::pplea3-3:egfp替換為載體ppzp111，其它步驟均相同，得到t3代純合擬轉(zhuǎn)空載體擬南芥，簡(jiǎn)稱(chēng)擬轉(zhuǎn)空載體擬南芥。六、分子檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄分析1、分子檢測(cè)以野生型擬南芥、擬轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代植株、line1的t3代植株、line2的t3代植株、line3的t3代植株、line4的t3代植株、line5的t3代植株、line6的t3代植株、line7的t3代植株、line8的t3代植株或line9的t3代植株的基因組dna為模板，以實(shí)施例1步驟二中2人工合成的引物cds-f和cds-r為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(wt為野生型擬南芥)。結(jié)果表明，line1的t3代植株、line2的t3代植株、line3的t3代植株、line4的t3代植株、line5的t3代植株、line6的t3代植株、line7的t3代植株、line8的t3代植株或line9的t3代植株均能夠擴(kuò)增得到約1700bp的條帶，而野生型擬南芥和擬轉(zhuǎn)空載體擬南芥均不能擴(kuò)增得到約1700bp的條帶。因此，line1、line2和line3的t3代植株均鑒定為t3代純合轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp的擬南芥，line4、line5和line6的t3代植株均鑒定為t3代純合轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3:egfp的擬南芥，line7、line8和line9的t3代植株均鑒定為t3代純合轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3的擬南芥，擬轉(zhuǎn)空載體擬南芥鑒定為轉(zhuǎn)空載體擬南芥。t3代純合轉(zhuǎn)35s::pplea3-3:egfp的擬南芥、t3代純合轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3:egfp的擬南芥和t3代純合轉(zhuǎn)lea3pro::pplea3-3的擬南芥均稱(chēng)為t3代純合轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥。2、轉(zhuǎn)錄分析(1)取5粒野生型擬南芥種子，先播種于1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)7天；然后轉(zhuǎn)移至含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)1天，得到鹽處理-野生型擬南芥幼苗。按照上述步驟(1)的方法，將野生型擬南芥種子分別替換為轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代種子、line1的t3代種子、line4的t3代種子和line7的t3代種子，其它步驟均不變，得到鹽處理-轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、鹽處理-line1擬南芥幼苗、鹽處理-line4擬南芥幼苗和鹽處理-line7擬南芥幼苗。(2)按照步驟(1)的步驟，將含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基替換為1/2ms培養(yǎng)基，其它步驟均不變，得到對(duì)照-野生型擬南芥幼苗。按照上述步驟(2)的方法，將野生型擬南芥種子分別替換為轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代種子、line1的t3代種子、line4的t3代種子和line7的t3代種子，其它步驟均不變，得到對(duì)照-轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、對(duì)照-line1擬南芥幼苗、對(duì)照-line4擬南芥幼苗和對(duì)照-line7擬南芥幼苗。(3)按照步驟(1)的步驟，將含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基替換為含400mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基，其它步驟均不變，得到滲透脅迫處理-野生型擬南芥幼苗。按照上述步驟(3)的方法，將野生型擬南芥種子分別替換為轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代種子、line1的t3代種子、line4的t3代種子和line7的t3代種子，其它步驟均不變，得到滲透脅迫處理-轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、滲透脅迫處理-line1擬南芥幼苗、滲透脅迫處理-line4擬南芥幼苗和滲透脅迫處理-line7擬南芥幼苗。(4)完成步驟(1)、(2)和(3)后，提取各擬南芥幼苗的總rna，用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)得到cdna，對(duì)cdna中pplea3-3基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析并取平均值，引物為5’-cgccgtgttgaacctggatatg-3’和5’-accgtgatggccaagatcagtaag-3’。內(nèi)參為actin2基因，內(nèi)參的引物為5’-gtcgtacaaccggtattgtg-3’和5’-gagctggtctttgaggtttc-3’。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4(c為對(duì)照，s為鹽處理，o為滲透脅迫處理)。結(jié)果表明，與野生型擬南芥相比，t3代純合轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥(line1的t3代植株、line4的t3代植株和line7的t3代植株)中pplea3-3基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(如：35s啟動(dòng)子可使pplea3.3基因上調(diào)300000倍以上，野生型擬南芥中啟動(dòng)atlea3-3基因的啟動(dòng)子可使pplea3.3基因上調(diào)10倍以上)，而轉(zhuǎn)空載體擬南芥中pplea3-3基因的表達(dá)量則無(wú)顯著差異。七、轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥的抗逆性鑒定待測(cè)擬南芥種子為野生型擬南芥種子、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代種子、line1的t3代種子、line4的t3代種子或line7的t3代種子。1、根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)(1)取5粒待測(cè)擬南芥種子，先播種于1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)6天；然后轉(zhuǎn)移至鹽處理培養(yǎng)基(含50mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基、含100mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基、含125mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基或含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基)上，20℃光暗交替培養(yǎng)4天，測(cè)量根長(zhǎng)并取平均值。(2)取5粒待測(cè)擬南芥種子，播種于1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)10天，測(cè)量根長(zhǎng)并取平均值(作為對(duì)照)。(3)取5粒待測(cè)擬南芥種子，先播種于1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)6天；然后轉(zhuǎn)移至脅迫處理培養(yǎng)基(含100mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基、含200mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基、含300mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基或含400mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基)上，20℃光暗交替培養(yǎng)4天，測(cè)量根長(zhǎng)并取平均值。以對(duì)照的根長(zhǎng)作為1，統(tǒng)計(jì)其它處理的相對(duì)根長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5中a和b(ck為對(duì)照)。2、存活率統(tǒng)計(jì)a、采用營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)方式統(tǒng)計(jì)存活率(1)將30粒待測(cè)擬南芥種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，正常培養(yǎng)42天，得到正常處理的待測(cè)擬南芥植株。(2)將30粒待測(cè)擬南芥種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，正常培養(yǎng)21天；第22天開(kāi)始通過(guò)停止?jié)菜M(jìn)行滲透脅迫，干旱脅迫14天；第36天開(kāi)始正常澆水，復(fù)水處理7天，得到干旱脅迫的待測(cè)擬南芥植株。(3)將30粒待測(cè)擬南芥種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，正常培養(yǎng)21天；第22天開(kāi)始通過(guò)施加150mmnacl水溶液進(jìn)行高鹽脅迫(每隔7天施加一次；每次取150mmnacl水溶液4l，置于種植有擬南芥的盆外部，待盆中的營(yíng)養(yǎng)土飽和吸收后，棄去盆外部的剩余溶液)，高鹽脅迫21天，得到高鹽脅迫的待測(cè)擬南芥植株。統(tǒng)計(jì)正常處理的待測(cè)擬南芥植株、干旱脅迫的待測(cè)擬南芥植株和高鹽脅迫的待測(cè)擬南芥植株的存活率。存活率＝存活的擬南芥幼苗數(shù)/30×100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5中c(未處理為正常處理的待測(cè)擬南芥植株)。b、采用組織培養(yǎng)方式統(tǒng)計(jì)存活率取30粒待測(cè)擬南芥種子，播種于1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)6天，然后轉(zhuǎn)移至1/2ms培養(yǎng)基、含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基或含400mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)6天，統(tǒng)計(jì)存活率。存活率＝存活的擬南芥幼苗數(shù)/30×100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5中d(未處理為1/2ms培養(yǎng)基，高鹽脅迫為含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基，滲透脅迫為含400mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基)。3、轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥的抗逆性相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定a、樣本的制備(1)取5粒野生型擬南芥種子，先播種于1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)7天；然后轉(zhuǎn)移至含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基上，20℃光暗交替培養(yǎng)7天，得到鹽處理-野生型擬南芥幼苗。按照上述步驟(1)的方法，將野生型擬南芥種子分別替換為轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代種子、line1的t3代種子、line4的t3代種子和line7的t3代種子，其它步驟均不變，得到鹽處理-轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、鹽處理-line1擬南芥幼苗、鹽處理-line4擬南芥幼苗和鹽處理-line7擬南芥幼苗。(2)按照步驟(1)的步驟，將含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基替換為1/2ms培養(yǎng)基，其它步驟均不變，得到對(duì)照-野生型擬南芥幼苗。按照上述步驟(2)的方法，將野生型擬南芥種子分別替換為轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代種子、line1的t3代種子、line4的t3代種子和line7的t3代種子，其它步驟均不變，得到對(duì)照-轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、對(duì)照-line1擬南芥幼苗、對(duì)照-line4擬南芥幼苗和對(duì)照-line7擬南芥幼苗。(3)按照步驟(1)的步驟，將含150mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基替換為含400mmmanitol的1/2ms培養(yǎng)基，其它步驟均不變，得到滲透脅迫處理-野生型擬南芥幼苗。按照上述步驟(3)的方法，將野生型擬南芥種子分別替換為轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代種子、line1的t3代種子、line4的t3代種子和line7的t3代種子，其它步驟均不變，得到滲透脅迫處理-轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、滲透脅迫處理-line1擬南芥幼苗、滲透脅迫處理-line4擬南芥幼苗和滲透脅迫處理-line7擬南芥幼苗。b、轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥的抗逆性相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定測(cè)量步驟1制備的各樣本的葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸和sod含量含量并取平均值，從而評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥的抗逆性。測(cè)量葉綠素含量和丙二醛含量的方法均記載于如下文獻(xiàn)中：songx，fangj，hanx，hex，lium，huj，zhuor.overexpressionofquinonereductasefromsalixmatsudanakoidzenhancessalttoleranceintransgenicarabidopsisthaliana.gene.2016jan.576(1pt3):520-7。測(cè)量脯氨酸含量的方法記載于如下文獻(xiàn)中：szabados，l.l.，&savourcb，a.(2010).proline:amultifunctionalaminoacid.trendsinplantscience，15(2)，89-97.測(cè)量sod含量的方法記載于如下文獻(xiàn)中：ali，akram，f.alqurainy，n.motohashi.activitiesofantioxidantsinplantsunderenvironmentalstress.2006.實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5中e、f、g和h(e為葉綠素含量的測(cè)定結(jié)果，f為丙二醛含量的測(cè)定結(jié)果，g為脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果，h為sod含量的測(cè)定結(jié)果；未處理為步驟1中(2)中的擬南芥植株，即正常生長(zhǎng)條件下的擬南芥植株；高鹽脅迫為步驟1中(1)中的擬南芥植株；滲透脅迫為步驟1中(3)中的擬南芥植株)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下，野生型擬南芥植株、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的t3代植株、line1的t3代植株、line4的t3代植株和line7的t3代植株中的相對(duì)根長(zhǎng)、存活率、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、sod含量均無(wú)顯著差異。但在組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行高鹽脅迫或滲透脅迫時(shí)，或者，在營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)條件下進(jìn)行高鹽脅迫或干旱脅迫時(shí)，與野生型擬南芥植株相比，t3代純合轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥(line1的t3代植株、line4的t3代植株和line7的t3代植株)的根長(zhǎng)顯著增加且存活率顯著增加，而轉(zhuǎn)空載體擬南芥的根長(zhǎng)和存活率則無(wú)顯著差異。與野生型擬南芥植株相比，在逆境脅迫下，t3代純合轉(zhuǎn)pplea3-3基因的擬南芥(line1的t3代植株、line4的t3代植株和line7的t3代植株)中葉綠素含量顯著提高、丙二醛含量顯著降低、脯氨酸含量顯著提高和sod含量顯著提高；與轉(zhuǎn)空載體擬南芥相比無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，與野生型擬南芥相比，line1、line4和line7的抗鹽性和抗旱性均顯著增加，抗鹽性和抗旱性均顯著增加具體體現(xiàn)為根長(zhǎng)增加、存活率提高、葉綠素含量增加、丙二醛含量減少、脯氨酸含量增加和sod含量增加。實(shí)施例4、pplea3-3蛋白的亞細(xì)胞定位1、取實(shí)施例3獲得的line1的t3代植株的葉片，置于3.5％(體積百分比)戊二醛水溶液，避光處理1h。2、完成步驟1后，棄上清，加入ph9.0、0.1medta溶液，55℃溫育2h。3、完成步驟2后，加入適量dapi染色液母液，得到染色體系(染色體系中dapi染色液的濃度為0.03mm)，然后染色5min。4、完成步驟3后，利用熒光共聚焦顯微鏡(德國(guó)carlzeiss公司產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為zeisslsm780laserconfocalmicroscope)觀察。按照上述方法，將line1的t3代植株替換為野生型擬南芥，其它步驟均不變，作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6(dic為微分干涉差顯微鏡通道下細(xì)胞明場(chǎng)圖，gfp+chl為綠色熒光蛋白及葉綠體自發(fā)熒光圖，dapi為dapi染色后的細(xì)胞核熒光，merge為上述各通道的疊加圖)。結(jié)果表明，pplea3-3蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。<110>首都師范大學(xué)<120>蛋白質(zhì)pplea3-3在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>1665<212>dna<213>小立碗蘚（physcomitrellapatens）<400>1atgaatcagtacggaagagaacagcaagatactggcctcgtcggctctggtacaggacat60cgcgatgaatacggcaatcccaggcaagagggtataatggacaaggtgaaaaatgccgta120ggcatgggccccagttcaggaaccggctacaacaatcagcctggttatgacaattacggt180aacccaaggcaagaaggattagtagacaaggcgaaggacgccgtgggcatgggtccgagt240ttaggaactggctacaataaccagcctggttatgacagttacgggaatcgtgagggcatt300gtggacagggcgaaagatgcggtagggatgggtccgaattcaggaactggctacaacaac360cagcctggatacgacaattacggtgaccgaaggcatgaaggattggcagacagagcgaag420gatgctgtaggtatggggcctaactcaggttacaaccaccagcctggatatgacaactac480ggcaatcgtgagggcgttgtggacaaggcgaaggatgcggtaggcatgggtccgaattca540ggaactggctacaacaaccagcctggttatgacagttatggtacccggagacaggaagga600ttggtagatagagcaaaggatgccgtcggcatgggccccaattcgggcaccggctataac660aatcagcccggatatgacaactacggtaacccaagacgcgaaggagtggtagacagggcg720aaggatgctgtaggtatggggcctaactcaggttacaacaatcagcccggatatgacaac780tacggcaatcgtgagggcattgtggacaaagccaaggatgcagtcggtgttggcccccac840tcgggtactggctaccacaaccagcccagctacgacaactatggcaaccctaggcaagag900ggaatcgtggatagagcgaaagacgctgtggggatgggaccaaactctggaactggctac960aacaaccagtctgattatgacagttatggcaacccaaggcacgaaggcatgcttgacaag1020gcgaaggatgactttgatatgggccccaattccggcactggctataacaaccggcccggc1080tatgacacctatggggaccgaaggcacgagggaattggtgacaaggtgagggacgcaatc1140ggtactggcccaaactccggatatgacagccgcacacccaccggaaccgacgcttacgtg1200catggcaaccatccccctggtatgcaagacagaatcactggcgtgaacgagccctcgatc1260ttaggtggacgtgagaatgtagaccgccatggttttggacacgatggtcgccaacatcac1320ggtctgctagataatgttactcttcaaagtggccatattcctgagactatggtaggcggg1380cgccgtgttgaacctggatatgatatgaccaagagtgctggacatcatcttactgatctt1440ggccatcacggtaacgatagcggtgtcactggattgggccatcacgacactgattacgat1500gagaggaggggaaaaggatttgaagacccgattgataacaaaaccggacttggatcagac1560tacgatacgaccgagaccggatctggttatggtgccaccgatactggtgctgcacctcac1620aagaagggaatcataactaagatcaaggagaagctgcaccactag1665<210>2<211>554<212>prt<213>小立碗蘚（physcomitrellapatens）<400>2metasnglntyrglyarggluglnglnaspthrglyleuvalglyser151015glythrglyhisargaspglutyrglyasnproargglngluglyile202530metasplysvallysasnalavalglymetglyproserserglythr354045glytyrasnasnglnproglytyraspasntyrglyasnproarggln505560gluglyleuvalasplysalalysaspalavalglymetglyproser65707580leuglythrglytyrasnasnglnproglytyraspsertyrglyasn859095arggluglyilevalaspargalalysaspalavalglymetglypro100105110asnserglythrglytyrasnasnglnproglytyraspasntyrgly115120125aspargarghisgluglyleualaaspargalalysaspalavalgly130135140metglyproasnserglytyrasnhisglnproglytyraspasntyr145150155160glyasnarggluglyvalvalasplysalalysaspalavalglymet165170175glyproasnserglythrglytyrasnasnglnproglytyraspser180185190tyrglythrargargglngluglyleuvalaspargalalysaspala195200205valglymetglyproasnserglythrglytyrasnasnglnprogly210215220tyraspasntyrglyasnproargarggluglyvalvalaspargala225230235240lysaspalavalglymetglyproasnserglytyrasnasnglnpro245250255glytyraspasntyrglyasnarggluglyilevalasplysalalys260265270aspalavalglyvalglyprohisserglythrglytyrhisasngln275280285prosertyraspasntyrglyasnproargglngluglyilevalasp290295300argalalysaspalavalglymetglyproasnserglythrglytyr305310315320asnasnglnserasptyraspsertyrglyasnproarghisglugly325330335metleuasplysalalysaspasppheaspmetglyproasnsergly340345350thrglytyrasnasnargproglytyraspthrtyrglyaspargarg355360365hisgluglyileglyasplysvalargaspalaileglythrglypro370375380asnserglytyraspserargthrprothrglythraspalatyrval385390395400hisglyasnhisproproglymetglnaspargilethrglyvalasn405410415gluproserileleuglyglyarggluasnvalasparghisglyphe420425430glyhisaspglyargglnhishisglyleuleuaspasnvalthrleu435440445glnserglyhisileprogluthrmetvalglyglyargargvalglu450455460proglytyraspmetthrlysseralaglyhishisleuthraspleu465470475480glyhishisglyasnaspserglyvalthrglyleuglyhishisasp485490495thrasptyraspgluargargglylysglyphegluaspproileasp500505510asnlysthrglyleuglyserasptyraspthrthrgluthrglyser515520525glytyrglyalathraspthrglyalaalaprohislyslysglyile530535540ilethrlysilelysglulysleuhishis545550<210>3<211>732<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3gagctcatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgag60ctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgcc120acctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctgg180cccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccac240atgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcacc300atcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgac360accctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctg420gggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcag480aagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcag540ctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgac600aaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcac660atggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtac720aagtaactcgag732<210>4<211>1748<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4ctgcagaatagagagaggtgaaggtactaacaacattcttaaggaagacacaacagtagt60gtcgtttacatgcatagagaattgcggagccttcccattgttatttccatgttggacgtt120ggagatatggattaatacactatcgacaagactctttgcaatattcaacagaagttgaat180ataaaaaggcctccaacaaagcatgcttgattcttatctaagctagatttcctattattt240tttctatccacaaagtcatattcttctatcaaggtcataactaataacttacaagaatta300taactttattactgtagaaccatgtaaattcttccatttttttttactttatcatggatt360ataacttattaagagataaattagcaaaggtaatattctatttatattcatatgtatgta420tgttaaaatttaaatcaaactaaatatttatagttttctattctctatcaagtttgatct480ctattaaatgtggatttatgaccccttttaatttatagtaaaaaattcacatatatttca540ctaaaaattattctaatttattgttgtctaaaaataacaacatataaacactcaaatcaa600tatcttcacattcaatgattgcacaacaacaaaatttatatatatatatatatatatata660tatacttactcaaaaaaaaatatatatatatatatatatatatatatacttactcaaaaa720atatgtatatatatatatacttactcaatatatatatatatatatatatatacttactca780aaataataaattaaacttaaataaagcaatttttagacacggtatatggcaatttttaag840tcgaacttaaggttgcaccaaatgatctccataaaccccatataaaacttttttgtgtca900ttaatcaagtatctggaccaacagtttttttacacaaaatatatcaactttgggagaaag960tctaactttaatacactttccttccaaataacaactttagttgaattcagttatcatggt1020ggtcatctttcaaaaaagaaattactccacatcagcgtctatttcttttacaatttaata1080tccaggccatactaaatggtaacacaaattcacctcacaaggcgtcccctccacgtcgtc1140gtttttccagctgtcgaatttgctgactcagcccaccgaactaccacgtggcagaggatt1200ctatccacgtggcatcggaggaaaaatccatttggcgacgcgacagtgtgaaaaagggat1260ggagggtcccatgagcgggacagatgccgtcttctctcccgctgtcgtgttttgtttcaa1320attgacgtccttatggttgatccattatctcaattgtgagccaatacattgtttgcatcg1380accggtgtagtgatttcaggtaaatgcgaatgagatctcgtgcgatcgagttgctctagt1440ttttgttgttctcatcttgctcactgactatatgcaagtgccaactcgtgggtgtgtgtg1500tgcgcgtgtgtgagtgcgtgtgtgtttgtgtgcttgtgagtatgatagttctttaagttt1560ttgcttttttcttttcttttcatggattgtggcgttagttgagcaaaaaactgcgtaatc1620atgtacgtatgattaatgcgtgcgttggattttgctacagataattcgagagaccttgtg1680ctgcgattttacttgtcggagagggtgtgtttaagttgcaagaaagtctaaaaagagata1740gaggatcc1748當(dāng)前第1頁(yè)12