專利名稱：蛋白質(zhì)激發(fā)子Hrip1在提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)激發(fā)子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在自然環(huán)境中，作物生長發(fā)育往往受到干旱、高溫、低溫等逆境脅迫，影響正常發(fā)育而造成減產(chǎn)，提高植物抗逆性是降低逆境傷害的重要途徑之一。通過現(xiàn)代生物技術(shù)將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)，是培育抗逆新品種的有效途徑。目前已有許多基因?qū)胫参锾岣呖鼓嫘缘难芯繄蟮?，這些基因主要包括兩類，第一類是功能基因，這些基因可以通過合成相關(guān)物質(zhì)來提高植物在逆境中的抗性，如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成基因等。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成對于維持植物在滲透脅迫環(huán)境中的生存至關(guān)重要，將P5cS、BADH、SacB等基因轉(zhuǎn)入植物體后脯氨酸，甜菜堿和糖類等含量明顯增加，同時轉(zhuǎn)基因作物抗逆性也明顯增強(qiáng)；如將PvP5CSl導(dǎo)入擬南芥中，在NaCl和甘露醇滲透脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株種子發(fā)芽率和幼苗根長均比野生型顯著增加[1]。另一類是調(diào)節(jié)基因，此類基因在逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，迅速傳遞信息使植物在逆境中做出反應(yīng)來抵抗惡劣環(huán)境，如DREB類轉(zhuǎn)錄因子，MYB類轉(zhuǎn)錄因子，蛋白激酶類基因等[2]。Liu等將小麥TaPMPl基因?qū)霟煵葜校珊得{迫后，轉(zhuǎn)基因植株的存活率相對野生型提高20%-60%[3]。蛋白激發(fā)子能夠激發(fā)植物防御信號反應(yīng)，通過信號識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)一系列基因的表達(dá)，啟動植物防衛(wèi)反應(yīng)，激活植物的免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)植物生長代謝系統(tǒng)，能夠提高植物抗病能力，促進(jìn)植物生長[4_5]。蛋白激發(fā)子不但具有激發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)的功能，而且蛋白激發(fā)子轉(zhuǎn)入植物后也能夠提高植物抗病性。Yang等將激發(fā)子蛋白激發(fā)子MgSMl轉(zhuǎn)化擬南芥提高對病原真菌和細(xì)菌的抗性[6]。發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室將PemGl基因轉(zhuǎn)入水稻提高對稻瘟病的抗性[7]。Hripl是發(fā)明人從極細(xì)鏈格孢菌(A.tenuissima)中分離到的一種蛋白激發(fā)子，前期研究證明，Hripl蛋白滲入煙 草葉片后能夠引發(fā)煙草葉片的鈣離子流入、介質(zhì)堿化、激活水楊酸途徑的蛋白激酶并且提高植物體內(nèi)相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)[8]。本發(fā)明將激活蛋白基因Hripl導(dǎo)入野生型擬南芥中，獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，通過研究Hripl在抗逆過程中的作用，揭示蛋白激發(fā)子在生物脅迫適應(yīng)性中的反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是申請?zhí)枮?201110149203.3，申請日為:2011-06_03，發(fā)明名稱為:“提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的蛋白質(zhì)及其基因、應(yīng)用”的中國發(fā)明專利申請的系列申請，所述專利申請已于2011-11-16公開，公開號102241752A;所述專利申請的說明書和權(quán)利要求書全文為本發(fā)明所引用。在上述專利申請中，發(fā)明人公開了一種能夠提高植物抗性及誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的來自于極細(xì)鏈格孢菌(Alternaria tenuissima) JH505菌株的蛋白質(zhì)及編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中的蛋白質(zhì)是一種蛋白質(zhì)激發(fā)子，命名為Hripl (過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白1，Hypersensitive response inducing proteinl)(其氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所不)；其編碼基因?yàn)镠ripl基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示)。此專利申請重點(diǎn)研究了 Hripl基因可以誘導(dǎo)植物如煙草的抗性防御反應(yīng)，如對煙草花葉病毒的抗性能力。本發(fā)明是在上述申請的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究了 Hripl基因在擬南芥中表達(dá)后能夠顯著提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力。轉(zhuǎn)基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強(qiáng)。本發(fā)明對5個T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行分子檢測，證明Hripl在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中能夠正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強(qiáng)，75mmol T1NaCl和50mmol Γ1甘露醇滲透脅迫2d，轉(zhuǎn)基因植株種子平均相對發(fā)芽率是32.1%和77.9%,分別是野生型的3.72倍和5.61倍；150mmol T1NaCl和50mmol Γ1甘露醇處理擬南芥幼苗7d后，轉(zhuǎn)基因植株平均相對根長是81.79%和93.25%,分別是野生型的1.53和1.34倍。三周齡的轉(zhuǎn)基因植株在250mmol T1NaCl脅迫20d，平均存活率為67%，顯著高于野生型(42%) (P〈0.05);干旱脅迫25d后，復(fù)水5d轉(zhuǎn)基因植株平均存活率為72%，而野生型僅為44%。檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株葉片的抗氧化酶活性明顯高于野生型，用200mmol T1NaCl和200mmol L—1甘露醇處理后24h，POD活性分別比野生型植株提高1.56和1.85倍，CAT活性分別比野生型植株提高1.64和1.86倍。以上結(jié)果說明，Hripl在擬南芥中的表達(dá)具有提高植株耐鹽抗旱能力的功能。


圖1:植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-CaMV35S-Hripl-Nos 的結(jié)構(gòu)圖；圖2:轉(zhuǎn) Hripl 基因植株的 PCR(A)、RT-PCR(B)和 Western Blotting(C)分析；圖3:NaCl和甘露醇脅迫下轉(zhuǎn)Hripl擬南芥種子和野生型種子發(fā)芽試驗(yàn)；圖4:250mmol PNaCl脅迫處理轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的生長狀況；圖5 =NaCl和甘露醇脅迫下轉(zhuǎn)Hripl擬南芥和野生型擬南芥植株葉片POD酶活含量，其中標(biāo)以不同小寫字母者在p〈0.05水平上差異顯著；圖6 =NaCl和甘露醇脅迫下轉(zhuǎn)Hripl擬南芥和野生型擬南芥植株葉片CAT酶活含量，其中標(biāo)以不同小寫字母者在p〈0.05水平上差異顯著。
具體實(shí)施例方式為進(jìn)一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實(shí)施例具體說明:I材料與方法1.1試驗(yàn)材料哥倫比亞生態(tài)型(Col-O)野生型擬南芥和農(nóng)桿菌菌株GV3101由發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存，已知。植物表達(dá)載體PCAMBIA1301。蛋白激發(fā)子Hripl抗體由華大基因制備。1.2表達(dá)載體構(gòu)建以引物 5' -CATGCCATGGGCATGTACTTCTCGAATATACTCCCGG-3 '(如 SEQ ID NO:3所示)和 5' -GGGTCACCTCAGCACTGAGGCAAGTTACAGACC-3 '(如 SEQ ID N0:4 所示)，以保存的Hripl基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增蛋白激發(fā)子Hripl基因的完整開放閱讀框(open readingframe, 0RF)序列。選pCAMBIA1301載體序列上的Nco I和BstE II兩個酶切位點(diǎn)，將該表達(dá)載體的⑶S基因替換為Hripl基因，構(gòu)建35S::Hripl植物雙元表達(dá)載體(圖1)。
1.3轉(zhuǎn)Hripl基因擬南芥株系的獲得及篩選采用花序浸染法獲得轉(zhuǎn)Hripl基因擬南芥植株[9]。將Ttl代種子表面消毒后均勻鋪灑在含有25ug ml/1潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，4°C均一化處理3d后，置于22°C光照(光周期為16h光照/8h黑暗)生物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。選取培養(yǎng)10-15d生長較快的綠苗移栽到培養(yǎng)土中繼續(xù)生長以收獲種子，篩選三代直到得到純合的轉(zhuǎn)基因株系。1.4轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子鑒定分別提取轉(zhuǎn)Hripl擬南芥單株的DNA和RNA，以DNA和cDNA為模板，用引物 5 ' -ATGTACTTCTCGAATATACTCCCGG-3 '(如 SEQ ID NO:5 所示)和5' -TCAGCACTGAGGCAAGTTACAGACC-3'(如 SEQ ID NO:6 所示)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，分別以野生型擬南芥(WT)和HriplPCR產(chǎn)物(CK)為陰性對照和陽性對照。將T4代煙草的葉片加液氮充分研磨后立即轉(zhuǎn)移到磷酸緩沖液(0.025molL-1K2HPO4, 0.025mol L-1KH2PO4, 2mmol L-1EDTA, ρΗ8.0),充分混勻后 12000Xg, 4 °C 離心IOmin0將上清液冰浴Ih后12000Xg，4°C再離心lOmin。將提取的蛋白用12%SDS_PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，使用華大 基因公司制備的羊抗兔Hripl基因的抗體，再參考Kobayashi等[1°]方法進(jìn)行免疫雜交。1.5轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗抗旱性和耐鹽性測定將5個轉(zhuǎn)基因株系擬南芥T4代純合種子和野生型擬南芥種子點(diǎn)播在含有75mmolIZ1NaCl和50mmol Γ1甘露醇的1/2XMS固體培養(yǎng)基上，以不含滲透劑的1/2XMS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的種子為對照(CK)，測定種子發(fā)芽率和幼苗根長。發(fā)芽率測定試驗(yàn)每株系處理60粒種子，重復(fù)三次。根長試驗(yàn)每株系處理30株幼苗根長，重復(fù)三次。操作方法參照Dai等。種子相對發(fā)芽率(%)=(脅迫條件下發(fā)芽率/對照發(fā)芽率)X100%,相對根長(%)=(脅迫條件下的根長/對照條件下根長)X100%。1.6轉(zhuǎn)基因擬南芥成株抗旱性和耐鹽性測定將在1/2XMS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的轉(zhuǎn)基因植株(L1、L2、L3、L4和L5)以及野生型幼苗到裝有定量營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中(9.5cm x9.5cm),每缽移植4株苗，培養(yǎng)3周后，分組進(jìn)行脅迫處理，每株系處理3缽，重復(fù)3次。耐鹽實(shí)驗(yàn)采用250mmol PNaCl水溶液從培養(yǎng)托盤底部浸透營養(yǎng)土，每托盤使用IL NaCl水溶液，溫室中繼續(xù)培養(yǎng)至第20d，統(tǒng)計(jì)幼苗存活率；抗旱實(shí)驗(yàn)在停止?jié)菜囵B(yǎng)25d模擬干旱脅迫(溫室控制相對濕度75%)，然后復(fù)水繼續(xù)培養(yǎng)5d，統(tǒng)計(jì)植株存活率。1.7轉(zhuǎn)基因擬南芥相關(guān)防御酶活力測定取干旱和鹽脅迫處理24h長勢一致的擬南芥植株，在植株相同部位取10片葉片，分別測定正常條件(CK)和脅迫條件下(200mmol T1NaCl和200mmol IZ1Mannitol)不同轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片過氧化物酶(Peroxidase, POD)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)酶活性。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用紫外分光光度法測定，方法參照劉穎超[12]的方法。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SAS(Version9.1)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析
2.1轉(zhuǎn)Hripl基因擬南芥的獲得及分子檢測將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥后收獲Ttl代種子，用含有25 μ g mL_1潮霉素1/2MS培養(yǎng)基篩選，共獲得5個陽性Ttl代轉(zhuǎn)Hripl擬南芥單株。對獲得的5個陽性Ttl代株系進(jìn)行Hripl基因的DNA和轉(zhuǎn)錄水平檢測。(圖2-A)結(jié)果顯示5個轉(zhuǎn)基因株系(L1、L2、L3、L4、L5)有目標(biāo)基因的擴(kuò)增片段，RT-PCR結(jié)果顯示Hripl基因在5個植株中均正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖2-B)，Western blotting分析，在供試5個轉(zhuǎn)基因株系中均檢測到抗原和抗體特異的17.56kD雜交帶，而在野生型(Wt)中沒有檢測到雜交信號，表明Hripl已整合到擬南芥基因組并正確表達(dá)(圖2-C)。2.2轉(zhuǎn)Hripl基因擬南芥種子在脅迫條件下的相對發(fā)芽率轉(zhuǎn)Hripl基因的擬南芥種子對干旱和鹽脅迫耐性顯著提高。結(jié)果顯示(圖3，表
1)，在75mmol L4NaCl和50mmol L—1甘露醇脅迫下，所測試的5個轉(zhuǎn)基因株系種子相對發(fā)芽率均顯著高于野生型(P〈0.005),平均值分別為32.1%和77.9%,是野生型的3.72倍和
5.61倍，表明Hripl基因的轉(zhuǎn)入顯著改善了擬南芥種子對干旱和鹽的耐滲透能力。表INaCl和甘露醇脅迫下轉(zhuǎn)Hripl擬南芥種子和野生型種子相對發(fā)芽率
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)激發(fā)子Hripl在提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力中的應(yīng)用，所述蛋白質(zhì)激發(fā)子Hripl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用， 其特征在于:所述植物是擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)激發(fā)子Hrip1在提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力中的應(yīng)用。Hrip1基因在擬南芥中表達(dá)后能夠顯著提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力。轉(zhuǎn)基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強(qiáng)。本發(fā)明對5個T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行分子檢測,證明Hrip1在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中能夠正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強(qiáng),75mmol L-1NaCl和50mmol L-1甘露醇滲透脅迫2d,轉(zhuǎn)基因植株種子平均相對發(fā)芽率是32.1%和77.9%,分別是野生型的3.72倍和5.61倍;150mmol L-1NaCl和50mmol L-1甘露醇處理擬南芥幼苗7d后,轉(zhuǎn)基因植株平均相對根長是81.79%和93.25%,分別是野生型的1.53和1.34倍。
文檔編號C07K14/37GK103145816SQ20131009774
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者邱德文, 劉崢, 楊秀芬, 曾洪梅, 郭立華, 袁京京, 彭學(xué)聰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所