本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及微小rna31前體編碼多肽在制備免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(regulatorycells，簡稱treg)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的t細(xì)胞亞群，其與自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切。調(diào)節(jié)性t細(xì)胞可分為天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(ntreg)和誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(atreg或itreg)，如th3、tr1，另外尚有cd8treg、nkt細(xì)胞等。

已有研究表明，treg與i型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、再生障礙性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血性貧血、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病、重癥肌無力等疾病密切相關(guān)。此外，其也與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性甲狀腺炎，自身免疫性肝病、多種腎臟疾病等很多自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。因此，treg對(duì)于自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展都具有重要意義，對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于了解自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)疾病預(yù)后判斷、進(jìn)一步的治療有著深遠(yuǎn)的意義。

多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis)屬于自身免疫性疾病的一種，其是發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦部以及脊髓)的慢性、炎癥性、自體免疫疾病，其特征是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中異常神經(jīng)退行病變(neurodegeneration)引發(fā)以t細(xì)胞、b細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，從而導(dǎo)致多處的神經(jīng)出現(xiàn)脫髓鞘(demyelination)現(xiàn)象，并在髓鞘組織修復(fù)的過程中，沿著軸突受損硬化。多發(fā)性硬化癥的確切發(fā)病原因還不清楚，患者可能出現(xiàn)行動(dòng)不便、視力受損、疼痛等神經(jīng)功能殘缺癥狀，嚴(yán)重會(huì)致死。多發(fā)性硬化癥目前尚無根治的藥物。

多肽類(peptide)藥物習(xí)慣上常指多肽類激素。一般將50或50以下氨基酸殘基組成的化合物列入多肽?，F(xiàn)已知生物體內(nèi)含有和分泌很多種激素和活性多肽，僅腦中就存在近40種，而人們還在不斷地發(fā)現(xiàn)、分離、純化新的活性多肽物質(zhì)。多肽在生物體內(nèi)的濃度很低，但生理活性很強(qiáng)，在調(diào)節(jié)生理功能時(shí)起著非常重要的作用。多肽類藥物由于其毒性低，特異性高，分子量小等自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為患者的最佳選擇。

因此，針對(duì)自身免疫性疾病的多肽類藥物具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明提供一種新的多肽，其可在炎癥環(huán)境中有選擇地增加treg的數(shù)量，可應(yīng)用于制備免疫調(diào)節(jié)藥物。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自：

(a)具有seqidno:2所示氨基酸序列的多肽；或

(b)將(a)所限定的多肽的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1-10個(gè)；較佳地1-5個(gè)；更佳地1-3個(gè)，如2個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或

(c)與seqidno:2所示的氨基酸序列有至少85％(較佳地至少90％；更佳地至少95％)相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多肽由微小rna-31(mirna-31)前體編碼。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，其編碼所述的多肽。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體(包括病毒載體或非病毒載體)，其含有所述的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組細(xì)胞，其中含有所述的表達(dá)載體或其基因組中包含所述的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽或編碼其的多核苷酸，或所述的表達(dá)載體或所述的重組細(xì)胞在制備免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的免疫調(diào)節(jié)藥物是：預(yù)防或治療自身免疫性疾病的藥物。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的自身免疫性疾病包括(但不限于)：多發(fā)性硬化癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和銀屑??；或

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的免疫調(diào)節(jié)藥物是增加調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)的數(shù)量的藥物(通過增加treg的數(shù)量，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié))。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備所述的多肽的方法，所述方法包括：培養(yǎng)所述的重組細(xì)胞，從而重組表達(dá)所述的多肽；或

所述方法包括：通過體外人工合成的方法制備所述的多肽。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于免疫調(diào)節(jié)的藥物組合物，所述的藥物組合物包括：所述的多肽或編碼其的多核苷酸，或所述的表達(dá)載體或所述的重組細(xì)胞；以及

藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于免疫調(diào)節(jié)的藥盒，所述藥盒中包括：

述的多肽或編碼其的多核苷酸；或

所述的表達(dá)載體；或

所述的重組細(xì)胞；或

所述的藥物組合物。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、電泳-免疫印跡檢測(cè)與gfp蛋白表達(dá)與分子量。

其中，空白組只轉(zhuǎn)染空白的gfp質(zhì)粒，mipep31組同時(shí)轉(zhuǎn)染mipep-gfp和gfp空質(zhì)粒。fusionegfp表示mipep-gfp融合蛋白的條帶。

圖2、mipep31的讀碼框(orf)的啟動(dòng)序列可以啟動(dòng)翻譯gfp蛋白。

a，mipep31的起始密碼子為atg；

b，mipep31的起始密碼子為att。

圖3、外源合成的mipep31可以進(jìn)入到細(xì)胞當(dāng)中。

a，1nmfitc標(biāo)記的mipep31與3t3細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的fitc熒光，可以觀測(cè)到fitc進(jìn)入到細(xì)胞中；

b，1nmfitc標(biāo)記的mipep31與cd4⁺t細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的fitc熒光，可以觀測(cè)到fitc進(jìn)入到細(xì)胞中；

c，3t3細(xì)胞固定后用dapi染細(xì)胞核后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光；

d，3t3細(xì)胞與fitc標(biāo)記的mipep31共培養(yǎng)，固定后用dapi染細(xì)胞核后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光；

e，上圖中放大觀察fitc的熒光。

圖4、外源合成的mipep31可以促進(jìn)treg的分化。

a，不同濃度的mipep31加入到treg的分化體系中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的分化；

b，不同濃度的mipep31加入到eae小鼠造模15天后分離的脾臟細(xì)胞中，加入mog再刺激后檢測(cè)treg的分化。

圖5、外源合成的mipep31可以促進(jìn)eae中樞treg的分化并治療eae。

a，mipep治療eae小鼠15天后，殺死小鼠分離中樞系統(tǒng)的單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)treg的比例；

b，mipep治療eae小鼠的eae評(píng)分情況，mipep可以明顯改善eae小鼠的發(fā)病情況；

黑色點(diǎn)狀線條：mipep31第10天開始，每3天1次治療eae小鼠30天的評(píng)分；

空心點(diǎn)狀線條：只注射pbs的對(duì)照eae小鼠30天的評(píng)分。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，微小rna31的前體的部分核苷酸序列能夠編碼產(chǎn)生一段多肽，并將之稱為微小rna31前體編碼多肽(mipep31)。所述的mipep31多肽能夠增加treg數(shù)量，具有免疫調(diào)節(jié)功能，因此其可應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)，預(yù)防或治療自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化癥。

如本文所用，所述的“保守性變異多肽”是指mipep31多肽的片段、衍生物和類似物。一般地，該“保守性變異多肽”是與seqidno:2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多5個(gè)，更佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。

如本文所用，所述的“微小rna31前體編碼多肽”、“mirna-31前體編碼多肽”、“mipep31多肽”可以互換使用。

如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性)的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。

如本文所用，“有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果的量。

mipep31多肽

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)微小rna31的前體的部分核苷酸序列能夠編碼產(chǎn)生一段多肽，命名為mipep31。

本發(fā)明的mipep31多肽可以是重組多肽、合成多肽。其可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生?；瘜W(xué)合成的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟悉的，例如固相多肽合成方法。

本發(fā)明的mipep31多肽的序列可以是：mrdwasvsslgsglwkerlwksittkrdgiapvtrnwrggkmla(seqidno:2)。

本發(fā)明還包括mipep31多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的mipep31多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是：

(i)有一個(gè)或多個(gè)(如1-10個(gè)、1-5個(gè)、1-3個(gè)或1-2個(gè))保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或

(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或

(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或

(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

在本發(fā)明中，mipep31多肽可以指具有seqidno:2所示序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與mipep31多肽相同功能的、seqidno:2序列的變異形式(保守性變異多肽)。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(gè)(如1-10個(gè)、1-5個(gè)、1-3個(gè)或1-2個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(例如為300個(gè)以內(nèi)，較佳地200個(gè)以內(nèi)，更佳地100個(gè)以內(nèi)，更佳地50個(gè)以內(nèi)，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括mipep31多肽的活性片段和活性衍生物。

本發(fā)明中，也包括為了增加多肽的穩(wěn)定性、半衰期、促進(jìn)功效而對(duì)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸加以修飾后構(gòu)成的修飾形式的多肽(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))，包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了抗水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。

本發(fā)明公開的mipep31合成簡易、成本低、不具免疫排斥性、能夠在炎癥環(huán)境中特異誘導(dǎo)treg細(xì)胞應(yīng)答、療效好、治療后疾病不易復(fù)發(fā)并且副作用小。

本發(fā)明還提供了mipep31多肽與其它物質(zhì)融合、偶聯(lián)或附著后所形成的復(fù)合體。例如，所述的mipep31多肽可以與一些熒光標(biāo)記(如fitc，gfp或egfp)偶聯(lián)，從而便于觀察到mipep31多肽在細(xì)胞內(nèi)的存在情況。

所述的mipep31多肽可以與一些具有穿膜功能的肽融合，以提高其穿透細(xì)胞，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的能力。一些具有穿膜功能的肽包括：①蛋白衍生肽(proteinderivedcpps)，如penetratin、tat和pvec等；②模型肽(modelpeptides)如map和(arg)7等；③設(shè)計(jì)肽(designedcpps)如mpg和transportan等。從其兩親性性質(zhì)也可將其分為3類：①兩親性cpps(pacpps)，如mpg、transportan、tp10、pep-1；②中等兩親性cpps(sacpps)，如penetratin，rl16；③非兩親性cpps(nacpps)，如r9。

本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明mipep31多肽或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。也即，“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或mipep31多肽的編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞(重組細(xì)胞)，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。

術(shù)語“表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。

包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。

mipep31多肽的應(yīng)用

本發(fā)明還提供了所述的mipep31多肽的應(yīng)用，用于制備免疫調(diào)節(jié)藥物，或用于制備增加調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)的數(shù)量的藥物。較佳地，所述的免疫調(diào)節(jié)藥物是：預(yù)防或治療自身免疫性疾病的藥物。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，確定了mipep31能夠在細(xì)胞中表達(dá)，外源合成的mipep31可以進(jìn)入到細(xì)胞中，mipep能夠促進(jìn)treg分化。并且，mipep31能夠有效地誘導(dǎo)多發(fā)性硬化癥的動(dòng)物模型eae小鼠中具功能的treg的產(chǎn)生，從而減輕eae小鼠發(fā)病。上述的研究結(jié)果表明，mipep31多肽可應(yīng)用于增加treg的數(shù)量，制備免疫調(diào)節(jié)藥物。

例如，所述的自身免疫性疾病包括：多發(fā)性硬化癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和銀屑病等。此外，對(duì)其它一些與treg的免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)相關(guān)的疾病或癥狀也具有潛在的預(yù)防或治療作用。目前，已知與treg的免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)相關(guān)的疾病或癥狀選自：腫瘤或病毒感染，炎癥反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、器官移植、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎、傳染性疾病等。

例如，所述腫瘤包括：前列腺癌、乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、腸癌、子宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、橫紋肌癌、舌鱗癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盤絨毛癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病、直腸腺癌或黑色素瘤，等。

例如，所述炎癥反應(yīng)包括：過敏性炎癥、毛囊炎、扁桃體炎、肺炎、肝炎、腎炎、痤瘡、哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎癥、慢性前列腺炎、腎小球腎炎、超敏反應(yīng)、炎性腸道疾病、盆腔炎、再灌注損傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥反應(yīng)、血管炎或間質(zhì)性膀胱炎，等。

例如，所述傳染性疾病包括：鼠疫、霍亂、傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、手足口病、登革熱、炭疽、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、流行性感冒、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、急性出血性結(jié)膜炎、麻風(fēng)病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病、真菌感染，等。

藥物組合物及藥盒

本發(fā)明還提供一種用于免疫調(diào)節(jié)的藥物組合物，所述的藥物組合物包括：本發(fā)明所述的多肽或編碼其的多核苷酸，或含有該多核苷酸的表達(dá)載體或表達(dá)該多肽的重組細(xì)胞；以及藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體。

合適的藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在remington’spharmaceuticalsciences中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、磷酸鹽緩沖液、ringer溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液、甘油或山梨醇等。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。

在使用時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明所述的本發(fā)明所述的多肽或編碼其的多核苷酸，或含有該多核苷酸的表達(dá)載體或表達(dá)該多肽的重組細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物(如人)，其中該安全有效量通常至少約0.01微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

對(duì)于某一對(duì)象的精確有效量取決于該對(duì)象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。對(duì)于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。

本發(fā)明還提供了一種藥盒或試劑盒，其中包括：本發(fā)明所述的多肽或編碼其的多核苷酸，或含有該多核苷酸的表達(dá)載體或表達(dá)該多肽的重組細(xì)胞；或所述的藥物組合物。

為了便于臨床應(yīng)用，本發(fā)明的藥物組合物可以包含在注射用給藥器(如注射用針)中，所述的注射用給藥器中，可以包含一次給藥量的所述的藥物組合物。所述的注射用給藥器可以被包含在藥盒中，以方便儲(chǔ)存、使用。

本發(fā)明所述的藥盒或試劑盒中，還可包括使用說明書，以利于本領(lǐng)域技術(shù)人員按照正確的方式使用。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、mipep31序列分析和體外合成

1、mipep31序列分析

mir-31前體的序列如下：

acgtaacctaaagctaacagacggggaagccatcaccagggtttgggttggattccctaccagtaaaatgaggtaatgatgtgaaattggtcacgttgttgaagagttgaactgttgaactgagaacctgctatgccaacatattgccatctttcctgtctgacagcagcttggctacctccgtcctgttcctccttgtcttgctacaagccatccatgatatgtagggccctgtgacttggtctgtctcgccctgacttctctccagtcctataccgaatcactcgctctgttctagccacactggccttttggggatgttcttggctgcaccaggaatattcccgcctctactgccctgtcttatcttttgggcatcagtggagaactctttcaccatggcactgtctataaaaccttacatgtgcccagccaccgttcacctcatgaccctgctctgacttgtcagaatcattgggcactacctgtccatgttcatttgcttagttgctgcttgatttactgtaccaggttgtaagtcctttaagggacacccgtcttcatttctgttcaccatacccctaaaccctgacgtttgcaagtcctcaagtcatgtctttgcgactctaccctggacttattgtgcaacagaagtgtcaaataatgagattttaatcatgccatgaatggctgtgatgaaacactggtttataagtaacaaagaataaacaaatgctactgatttctaagcctgcaaacccaacatcttaaaggagccacaataaagttaccatcaggtctacaactcagagaagacaaaatattgtatggaaaagagattatattcaaaataaaagttacttttgcggtttca(seqidno:1)

上述序列中，斜體下劃線部分為mipep31預(yù)測(cè)序列(seqidno:1的第112-246位)。翻譯為氨基酸的序列為：mrdwasvsslgsglwkerlwksittkrdgiapvtrnwrggkmla(seqidno:2)。

2、mipep的體外合成

使用常規(guī)的固相多肽合成方法，按照seqidno:2氨基酸序列合成多肽，質(zhì)譜分析確定氨基酸正確。純度達(dá)到96％以上，使用前溶于pbs待用。

實(shí)施例2、mipep31在細(xì)胞中的表達(dá)

將mipep31的編碼序列構(gòu)建到質(zhì)粒pegfp-n1(addgene)的sal1/xhol1限制性位點(diǎn)中。從而，獲得的重質(zhì)粒在表達(dá)后能夠形成mipep31與gfp的融合蛋白。

將前述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞(3t3)中，以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒(pegfp-n1blank)的脂肪細(xì)胞體細(xì)胞為對(duì)照?？瞻捉M只轉(zhuǎn)染空白的gfp質(zhì)粒，mipep31組同時(shí)轉(zhuǎn)染mipep-gfp和gfp空質(zhì)粒。

培養(yǎng)細(xì)胞，提取蛋白后用電泳-免疫印跡的方法檢測(cè)gfp的表達(dá)，結(jié)果如圖1。

空質(zhì)粒組可以檢測(cè)gfp的表達(dá)，mipep31組檢測(cè)到兩條gfp的條帶，而且其中一條分子量偏大，為融合了gfp的mipep31。

此外，本發(fā)明人將mipep31編碼序列中的起始密碼子atg突變成att，該序列采用如前所述的方法構(gòu)建到質(zhì)粒pegfp-n1中，轉(zhuǎn)入3t3細(xì)胞表達(dá)。

觀察突變前后的細(xì)胞產(chǎn)生的gfp熒光情況，結(jié)果如圖2。將mipep31讀碼框前的序列連同起始密碼子atg克隆到去除atg的gfp質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞(3t3)中，檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的gfp熒光，可以發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)gfp熒光；將mipep31讀碼框前的序列連同起始密碼子atg突變成att并克隆到去除atg的gfp質(zhì)粒上后檢測(cè)gfp的熒光，并沒有發(fā)現(xiàn)gfp熒光的出現(xiàn)。

上述結(jié)果說明，mipep31確實(shí)是在生理狀態(tài)下表達(dá)的一種多肽。

實(shí)施例3、外源合成的mipep31可以進(jìn)入到細(xì)胞中

實(shí)施例1中固相多肽合成方法得到的mipep31mipep，在其c端標(biāo)記fitc。

1、3t3細(xì)胞

將1nmfitc標(biāo)記的mipep31與3t3細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的fitc熒光。結(jié)果如圖3a，可以觀測(cè)到細(xì)胞中存在fitc信號(hào)，說明mipep能夠進(jìn)入到3t3細(xì)胞中。

3t3細(xì)胞固定后，用dapi染細(xì)胞核，之后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。結(jié)果如圖3c。用dapi染細(xì)胞核，可以觀測(cè)到藍(lán)色的熒光。

將3t3細(xì)胞與1nmfitc標(biāo)記的mipep31共培養(yǎng)；之后，將細(xì)胞固定，用dapi染細(xì)胞核后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。結(jié)果如圖3d～e，可以觀察到在細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)外存在綠色熒光，為fitc產(chǎn)生的熒光。

因此可見，mipep31可以明顯地進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。

2、cd4⁺t細(xì)胞

將1nmfitc標(biāo)記的mipep31與cd4⁺t細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的fitc熒光。結(jié)果如圖3b，可以觀測(cè)到細(xì)胞中存在fitc信號(hào)，說明外源合成的mipep31可以明顯地進(jìn)入到cd4⁺t細(xì)胞中。

實(shí)施例4、mipep促進(jìn)treg分化

實(shí)施例1中固相多肽合成方法得到的mipep31mipep，測(cè)定其對(duì)于treg分化的影響作用。

1、對(duì)treg細(xì)胞的體外誘導(dǎo)體系的影響

獲取小鼠的脾臟細(xì)胞，利用免疫磁珠分離小鼠cd4⁺cd25^-t細(xì)胞，在37℃條件下培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中加入anti-cd3(2μg/ml)、anti-cd28(2μg/ml)、tfg-β(2ng/ml)和il-2(2ng/ml)培養(yǎng)4天以得到treg。

在37℃條件下、1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)treg，分為若干個(gè)培養(yǎng)組，分別加入0nm，0.1nm，1nm和10nm濃度的mipep31，流式細(xì)胞術(shù)觀察mipep31對(duì)treg分化的影響。

結(jié)果如圖4a，說明在treg細(xì)胞的體外誘導(dǎo)體系中加入不同濃度的mipep31可以明顯的促進(jìn)treg的分化。

2、對(duì)炎癥環(huán)境分離得到的淋巴細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)小鼠造模：在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活結(jié)核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑，mog35-55配成終濃度10mg/ml。小鼠分別于背側(cè)中線兩側(cè)2點(diǎn)皮下注射由mog35-55與cfa按1:1混合乳化抗原。免疫當(dāng)天及第二天給小鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng/只，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生eae。

造模15天后，處死小鼠，分離脾臟細(xì)胞。

將0nm，0.1nm，1nm和10nm濃度的mipep31分別加入到eae小鼠造模15天后分離的脾臟細(xì)胞中，加入mog再刺激后檢測(cè)treg的分化。

結(jié)果如圖4b，說明從炎癥環(huán)境分離得到的淋巴細(xì)胞再刺激時(shí)加入mipep31發(fā)現(xiàn)可以在體外提高treg的分化。

因此，mipep31在炎癥環(huán)境中能夠有選擇地誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞發(fā)生而達(dá)到治療效果。

實(shí)施例5、測(cè)試mipep31對(duì)多發(fā)性硬化癥(eae)的治療效果

將mipep31注入在組織學(xué)、免疫學(xué)、多基因特性和治療反應(yīng)性上與人類多發(fā)性硬化癥極為相似的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，eae)小鼠體內(nèi)。

首先是建立eae模型，在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活結(jié)核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑，mog35-55配成終濃度10mg/ml。小鼠分別于背側(cè)中線兩側(cè)2點(diǎn)皮下注射由mog35-55與cfa按1:1混合乳化抗原。免疫當(dāng)天及第二天給小鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng/只，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生eae。

每只患病小鼠第10天開始尾靜脈注射50μg的mipep31(溶于pbs，濃度為0.5mg/ml)，之后每3天注射一次。從患病起觀察30天且每天評(píng)分。采用5分評(píng)分法，eae評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)具體如下：

0分：不發(fā)??；

1分：尾巴無力；

2分：輕微后肢無力；

3分：嚴(yán)重后肢癱瘓；

4分：四肢癱瘓；

5分：瀕臨死亡或死亡。

mipep治療eae小鼠15天后，殺死小鼠，分離中樞系統(tǒng)的單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)treg的比例。結(jié)果如圖5a，可見與對(duì)照組相比，mipep治療后中樞系統(tǒng)中treg的比例被極大的提高。

每天的觀察、評(píng)分結(jié)果如圖5b，mipep治療組的eae小鼠的發(fā)病情況較輕，能被基本治愈。

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