本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別地涉及一種幾丁質(zhì)的生產(chǎn)分離方法。
背景技術(shù)：
：幾丁質(zhì)又名甲殼素、甲殼質(zhì)，其有效成分是幾丁聚糖(殼聚糖)。在自然界中，幾丁質(zhì)存在于低等植物菌類、藻類的細(xì)胞，節(jié)肢動物蝦、蟹、昆蟲的外殼，高等植物的細(xì)胞壁等，是除纖維素以外的又一重要多糖。因幾丁質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和植物纖維素非常相似，故幾丁質(zhì)又稱為動物性纖維。節(jié)肢動物的外殼中有35％的蛋白質(zhì)、30％的鈣和無機鹽、剩下的就是35％甲殼質(zhì)。近年來，甲殼素的生物學(xué)功能在生理健康中的作用被廣泛關(guān)注，其應(yīng)用潛力巨大。在調(diào)節(jié)免疫方面，甲殼素能加強免疫細(xì)胞的增殖，因此有調(diào)節(jié)免疫力的功效。日本發(fā)表的動物實驗證實甲殼素的免疫強化作用有助于減少腫瘤細(xì)胞的傷害，及促進肝臟受損細(xì)胞的新生與正常化。在預(yù)防癌癥方面，甲殼素的抗癌效果已由日本東北藥科大學(xué)確認(rèn)，非常適合生物體而無毒性反應(yīng)出現(xiàn)。北海道大學(xué)的研究小組也發(fā)現(xiàn)，甲殼素有抑制惡性腫瘤細(xì)胞擴散及移轉(zhuǎn)的效果。在減少膽固醇和油脂吸收方面，甲殼素可抑制小腸對膽固醇的吸收，不但會減少膽固醇在肝臟的堆積量、也可降低低密度脂蛋白(ldl)的濃度、提高高密度脂蛋白(hdl)的含量，因此對于預(yù)防動脈硬化及心血管疾病有很好的效果。同時，甲殼素本身所帶的正電離子與食物中帶負(fù)電的脂肪自動附著結(jié)合，阻斷脂肪分解酵素的作用，使脂肪在腸內(nèi)不被吸收而直接排出體外。在改善消化機能方面，甲殼素可促進腸內(nèi)有益菌叢的繁殖，抑制有害菌叢的滋生，減少大腸菌生長的機會，以達到健胃的功效。在預(yù)防血壓升高方面，甲殼素是不會被人體吸收的一種高分子聚合物。日本水產(chǎn)廳主導(dǎo)的一項研究結(jié)果顯示，在食品中添加甲殼素可保留食品原來的口味、又不致吸收過多食鹽，可幫助高血壓患者控制食鹽的攝取。在減少體內(nèi)重金屬的積蓄方面，重金屬在體內(nèi)蓄積會造成神經(jīng)性病變、器官功能失調(diào)等后遺癥。甲殼素可以吸附銅、鎘、鋅、鈾等重金屬，并排出體外。甲殼素有助于體內(nèi)廢物的排除，而確保人體生理機能的正常運作。此外，殼聚糖在生物材料，食品添加劑和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用價值。例如，生物材料方面，由于殼聚糖具有良好的生物相容性，由殼聚糖制成的人工皮膚透氣性好，滲出性好，可以止痛，止癢，消腫化癖，并且能夠促進皮膚生長，加快創(chuàng)面愈合。由殼聚糖制備的人工皮膚若與乙酸合用，還有鎮(zhèn)痛和抗感染等功效。在食品添加劑應(yīng)用方面，大量的研究表明，甲殼素和殼聚糖是無毒的，基于結(jié)構(gòu)和氨基多糖的特點，它們有廣泛的用途。而其各種經(jīng)化學(xué)修飾或降解后的產(chǎn)物，由于具有極好的水溶性，更是日益受到青睞。美國食品與醫(yī)藥衛(wèi)生管理局(fda)已批準(zhǔn)其作為食品添加劑。而日本的食品工業(yè)中，殼聚糖的應(yīng)用更是占據(jù)重要地位。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面，用殼聚糖處理種子以及與種子接觸的土壤，利用殼聚糖的抗菌能力和改善土壤的作用，可將殼聚糖與可溶性蛋白合成液體土壤改良劑。這種改良劑有適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和具有可降解性，降解以后是優(yōu)質(zhì)的有機肥料，可供作物吸收，不但能抑制土壤中的病原菌生長繁殖，還能有效改善土壤的團粒結(jié)構(gòu)。目前，殼聚糖的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)法(酸堿法)和生物法(發(fā)酵法)。酸堿法是目前利用蝦殼提取制備幾丁質(zhì)最普遍的方法，也是目前工業(yè)上大規(guī)模利用蝦殼制備幾丁質(zhì)的主要方法。該方法先通過鹽酸浸泡蝦殼脫去碳酸鹽，再通過naoh溶液進行堿煮脫去蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，然后再洗滌至中性，使用kmno4溶液或者h(yuǎn)2o2溶液脫色，最后干燥得到幾丁質(zhì)。得到的幾丁質(zhì)再通過濃堿液法脫去乙?；涂梢缘玫讲煌撘阴６鹊臍ぞ厶?。發(fā)酵法即以蝦殼和蝦頭等廢棄物為底料，利用微生物在其生長繁殖過程中產(chǎn)酸去除礦物質(zhì)，產(chǎn)蛋白酶去除蛋白質(zhì)。相比傳統(tǒng)的酸堿法，微生物發(fā)酵法不僅反應(yīng)條件溫和，耗能少，而且發(fā)酵過程不會水解幾丁質(zhì)，可以得到較大分子量的幾丁質(zhì)產(chǎn)物，另外不會產(chǎn)生大量的酸堿廢液，對環(huán)境友好。但目前此方法還處在實驗室研究階段，尚未大規(guī)模應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)中。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本申請通過探索幾種商業(yè)化的蛋白酶，以蝦蟹殼為原料，采用酶促反應(yīng)催化脫蛋白的方法制備幾丁質(zhì)，從而提供了一種廉價、高效生產(chǎn)幾丁質(zhì)的方法，本發(fā)明的方法優(yōu)化了反應(yīng)條件，進一步提高了轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品純度，具有產(chǎn)物濃度高、收率高、純度高、副產(chǎn)物少和精制操作容易的優(yōu)點。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)幾丁質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟：(1)采用1-3mol/l的鹽酸浸泡蝦蟹殼；(2)將浸泡液的ph值調(diào)節(jié)為2-4，然后加入酸性蛋白酶和假絲酵母脂肪酶進行酶解處理；(3)將酶解處理后的蝦蟹殼脫色，用水漂洗，干燥得到幾丁質(zhì)。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法的步驟(2)中，所述酶解處理的條件為：反應(yīng)溫度35℃-45℃，反應(yīng)時間為10-12小時，假絲酵母脂肪酶的加料質(zhì)量是蝦蟹殼質(zhì)量的1-3wt％；更優(yōu)選地，所述酶解處理的條件為：反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間為12小時，假絲酵母脂肪酶的加料質(zhì)量是底物質(zhì)量的1wt％。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法的步驟(1)中，蝦蟹殼浸泡2次，每次12小時。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法的步驟(2)中，所述酸性蛋白酶的投料量是2mg/100ml浸泡液；更優(yōu)選地，所述酸性蛋白酶獲自黑曲霉；更優(yōu)選地，所述酸性蛋白酶的酶活力單位為10～30萬u。在本發(fā)明方法步驟(3)中，蝦蟹殼的脫色采用kmno4或h2o2進行；優(yōu)選采用h2o2進行；更優(yōu)選地，h2o2的使用質(zhì)量為蝦蟹殼質(zhì)量的1％。在本發(fā)明方法的步驟(3)中，所述干燥的條件為：干燥溫度50-70℃，干燥時間3-5個小時。本發(fā)明采用黑曲霉來源的酸性蛋白質(zhì)進行水解，水解率高達80％以上，相對于現(xiàn)有技術(shù)中50％以下的蛋白水解率，水解率大幅度提高。本發(fā)明還采用假絲酵母脂肪酶與酸性蛋白酶結(jié)合的方式，蝦蟹殼中的脂肪成分被有效地水解，從而更加有利于蝦蟹殼中蛋白質(zhì)成分的水解。本發(fā)明人在實驗中發(fā)現(xiàn)，假絲酵母脂肪酶對蛋白質(zhì)的水解具有很好的促進作用。假絲酵母脂肪酯對酸性蛋白酶水解的促進作用遠(yuǎn)高于假單胞菌、霉菌、豬胰腺來源的脂肪酶。本發(fā)明的幾丁質(zhì)的生產(chǎn)方法以蝦蟹殼為原料，通過酶促反應(yīng)催化蛋白質(zhì)水解來制備高分子量的幾丁質(zhì)，操作簡單，分離條件溫和，大大提高了幾丁質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。附圖說明以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：圖1示出本發(fā)明方法的工藝流程圖。具體實施方式實施例1將蟹殼清水洗凈后，稱取10g蟹殼，敲碎，每塊面積小于1cm2，放入100ml錐形瓶中，加入20ml1mol/l的鹽酸，浸泡12小時，過濾除去液體得固體物質(zhì)。將固體物質(zhì)倒回錐形瓶，再次加入20ml新鮮的1mol/l的鹽酸，浸泡12小時，直至蟹殼變軟，以除去蟹殼中的鈣質(zhì)成分。實施例2將實施例(1)得到的產(chǎn)物過濾，除去液體，將固體物質(zhì)倒回錐形瓶，加入20ml去離子水，使用1mol/l的鹽酸或1mol/l的氫氧化鈉，小心調(diào)節(jié)ph大約在3左右，加入10萬酶活(u)的酸性蛋白酶(鄭州食全食美商貿(mào)有限公司10萬u/g～30萬u/g，或鄭州君凱化工產(chǎn)品有限公司10萬u/g)以及底物質(zhì)量1％的假絲酵母脂肪酶，以300rpm、40℃的條件在搖床中反應(yīng)12小時，除去其中的蛋白質(zhì)成分。此時樣品由白色逐漸變得透明，得到水解后的透明產(chǎn)物。實施例3反應(yīng)后產(chǎn)物蛋白含量的確定：取實施例2所得透明產(chǎn)物1g，使用bca蛋白定量試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)標(biāo)準(zhǔn)方法定量產(chǎn)物中殘余蛋白含量，將此殘余蛋白含量定義為反應(yīng)后產(chǎn)物蛋白含量。初始產(chǎn)物蛋白含量的確定：將蟹殼清水洗凈后，稱取10g蟹殼，敲碎，每塊面積小于1cm2，放入100ml錐形瓶中，加入20ml1mol/l的鹽酸，浸泡12小時，過濾除去液體得固體。取少量固體并加入10萬酶活(u)的酸性蛋白酶后，取1g酶解液，測定蛋白含量并將測量得到的蛋白含量定義為初始蛋白含量。以蛋白水解效率(％)評價幾種酸性蛋白酶催化效率，蛋白水解率的計算公式如下。幾種酸性蛋白酶水解效率數(shù)據(jù)見表1。表1酸性蛋白酶來源蛋白水解效率米曲霉38.9％黑曲霉83.2％胃蛋白霉48.9％由上表可知，黑曲霉來源的酸性蛋白酶效率最高，水解效率高達83.2％。實施例4在實施例3的基礎(chǔ)上，本實施例以35℃、40℃、45℃的反應(yīng)溫度，10、11、12小時的反應(yīng)時間，0.5％、0.8％、1％底物質(zhì)量的假絲酵母脂肪酶量添加作為條件，實施三因素三水平正交試驗，最終得到的最優(yōu)的假絲酵母脂肪酶催化反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間12小時，假絲酵母脂肪酶的添加量為底物質(zhì)量的1％。實施例5本實施例采用假單胞菌脂肪酶、霉菌脂肪酶、假絲酵母脂肪酶和豬胰腺脂肪酶四種脂肪酶，就脂肪酶的來源對蛋白水解效率的影響進行了考查。將實施例(1)得到的產(chǎn)物過濾，除去液體，將固體物質(zhì)倒回錐形瓶，加入20ml去離子水，使用1mol/l的鹽酸或1mol/l的氫氧化鈉，小心調(diào)節(jié)ph大約在3左右，分成4份。每份加入10萬酶活(u)的酸性蛋白酶，然后在各份中分別加入底物質(zhì)量1％的假單胞菌脂肪酶、霉菌脂肪酶、假絲酵母脂肪酶和豬胰腺脂肪酶，以300rpm、40℃的條件在搖床中反應(yīng)12小時，除去其中的蛋白質(zhì)成分。此時樣品由白色逐漸變得透明，得到水解后的透明產(chǎn)物。通過實施例3的方法測量蛋白水解率，得到數(shù)據(jù)如表2所示。表2脂肪酶來源蛋白水解率假單胞菌脂肪酶62.3％霉菌脂肪酶60.9％假絲酵母脂肪酶83.2％豬胰腺脂肪酶65.5％由表2可知，在相同的條件下，采用假絲酵母脂肪酶進行酶解處理時，獲得的蛋白水解率最高。實施例6在處理過程當(dāng)中，蟹殼會產(chǎn)生一定紅色，這時候需要使用脫色劑進行脫色處理。常用的脫色劑為高錳酸鉀或者過氧化氫。使用過氧化氫不會有殘留，因此，本實驗選用過氧化氫作為脫色劑。由于不同反應(yīng)批次樣品產(chǎn)生顏色程度有所差異，故過氧化氫使用無定量，每批產(chǎn)品以gsb國標(biāo)色卡標(biāo)定處理后乳白色產(chǎn)品，確定過氧化氫使用量為底物量的0.1％。實施例7將實施例5脫色后產(chǎn)品經(jīng)室溫5倍產(chǎn)物體積清水漂洗后，50-70℃干燥3-5個小時即可得到最終分離的幾丁質(zhì)產(chǎn)物。實施例8定性分析：幾丁質(zhì)在高溫和堿作用下會分解成幾丁糖，幾丁糖經(jīng)碘和稀酸作用后呈現(xiàn)紫色。利用這個特性，可以對從蝦蟹殼中提取的幾丁質(zhì)進行定性檢測。定性分析步驟如下：稱取1g提取的幾丁質(zhì)，放入試管中，加入1ml0.1％氫氧化鈉，放入烘箱，160℃加熱1小時。取1滴在白瓷點滴試樣板上，加入1滴0.03％碘-碘化鉀溶液和1滴1wt％硫酸，在白瓷點滴試樣板上顯示紫褐色，再加數(shù)滴75％硫酸，發(fā)現(xiàn)紫色逐漸消失，表明提取的物質(zhì)為幾丁質(zhì)。當(dāng)前第1頁12