本發(fā)明是申請日為2011年12月23日，申請?zhí)枮?01180067799.0，標題為“非編碼免疫調節(jié)dna構建體”的專利申請的分案申請。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及核酸分子及其在調節(jié)免疫系統(tǒng)中的用途。

發(fā)明背景

新出現(xiàn)的一種對抗復雜疾病例如癌癥、傳染病、過敏反應和哮喘的策略是利用患者的免疫系統(tǒng)。已知免疫系統(tǒng)或其活性可以被特定的dna序列調節(jié)。據(jù)krieg等人報道(nature1995374:6522546-549)，大部分已知的免疫修飾短dna序列含有未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤基序(cg基序)。與原核生物或病毒相比，在真核生物的基因組中未甲基化的cg基序的出現(xiàn)基本上被抑制。因此，含有該基序的dna分子已經(jīng)進化為天然的“危險信號”并且引起免疫系統(tǒng)對原核病原體或病毒病原體的對抗。這可以在治療上或在預防上用來治療或預防傳染病以及非傳染病。

含有未甲基化cg基序的dna構建體能夠通過強烈刺激先天免疫系統(tǒng)的效應細胞從而引發(fā)相當?shù)纳硇?，所述效應細胞包括樹突細胞、巨噬細胞、天然殺傷細?nk)和nkt細胞。未甲基化cg基序由先天免疫模式識別受體toll樣受體(tlr)9檢測。盡管仍未完全了解其確切的識別機制，在闡明其通路上已經(jīng)取得了顯著進展(a.krieg,nat.rev.drugdisc.,5:471-484,2006)。假設在含有未甲基化cg的dna構建體與受體結合后，應答細胞中多重信號級聯(lián)被激活。通過特征表面分子的上調和細胞因子的分泌，誘導以th1模式為主的適應性免疫。這樣的構建體可以與例如抗體、化學療法或放射療法、疫苗或細胞因子組合使用。變應性疾病和哮喘主要是th2介導的。通過增加th1/th2的比例，減弱th2介導的應答，從而可以治療或預防這些類型的疾病。

取決于所分析的特定細胞類型，表面分子包括，例如，cd40、cd69、cd80或cd86。不同細胞類型的細胞因子分泌也是特征性的；細胞因子包括，例如，巨噬細胞炎性蛋白質(mip)-1α、mip-1β、白細胞介素(il)-6、il-8、干擾素(ifn)-α、腫瘤壞死因子(tnf)-α、ifn-γ、單核細胞趨化蛋白(mcp)-1或ifn-γ誘導的10kda蛋白(ip-10)。

為了預防或治療疾病，已經(jīng)證明疫苗接種是非常有效的方法。為了確保強烈而持續(xù)的免疫應答，能夠刺激抗原呈遞細胞例如樹突細胞的佐劑通常和抗原一起施用，并且在這個用途上tlr9激動劑已經(jīng)被證明是有效的免疫刺激劑。

不依賴于任何對未甲基化cg基序影響或調節(jié)免疫應答的機制的解釋，已經(jīng)開發(fā)了許多方法通過使用這樣的基序調節(jié)免疫系統(tǒng)。wo1998/018810公開了當含有未甲基化cg基序的免疫刺激性序列是單鏈的一部分時，其甚至更有效。然而，由于單鏈核酸的快速降解，施用開鏈的單鏈dna分子是不可行的。因此，開發(fā)了用于保護含有未甲基化cg基序的單鏈或雙鏈dna構建體的不同方法。

為了實現(xiàn)對dna核酸酶降解的抗性，核酸聚合物主鏈中的磷酸二酯鍵經(jīng)常被修飾為硫代磷酸酯。這樣的由硫代磷酸酯保護的核酸除了其刺激性活性稍微減少之外，最近幾年的臨床試驗還顯示硫代磷酸酯保護的毒性排除或嚴重限制了這樣的核酸在藥物組合物或藥劑中的任何應用。

另一種保護含有cg基序的dna序列的方法公開于例如ep1196178。該文件公開了短的脫氧核糖核酸分子，其包含部分單鏈的、啞鈴狀的、共價閉合的包含cg基序的核苷酸殘基序列(“dslim”)。根據(jù)ep1196178的公開內(nèi)容，cg基序位于所公開的分子的雙鏈莖兩端處的單鏈環(huán)內(nèi)或位于所述雙鏈莖內(nèi)。單鏈發(fā)夾環(huán)保護雙鏈莖免受細胞內(nèi)外的dna核酸酶的降解。

文件wo2010/039137公開了免疫調節(jié)性寡核苷酸作為tlr介導的疾病的拮抗物，其在免疫刺激性基序的側翼序列中和/或在寡核苷酸基序中具有一或多個化學修飾，所述寡核苷酸基序在無所述修飾時是免疫刺激性的。因此，wo2010/039137所公開的寡核苷酸旨在抑制由tlr導致的免疫應答。

wo2005/042018描述了新的所謂的c-型cpg寡核苷酸，其中c-型寡核苷酸由cpg序列以及富含gc的回文基序表征，所述cpg序列通常位于所述分子的5’或3’末端或其附近，所述富含gc的回文基序通常位于所述分子的另一末端或其附近。該文件公開了c-型dna的回文序列的變體。

發(fā)明簡述

針對本領域的狀態(tài)，本公開的目的在于提供另一種免疫調節(jié)dna構建體，其在轉移入真核細胞后是穩(wěn)定的且避免了有害的副作用。

本公開教導了用于免疫刺激的dna構建體，其包含至少一個序列基序n¹n²cgn³n⁴，其中n¹n²和n³n⁴是c、g、a和t的任意組合，且c是脫氧胞苷，g是脫氧鳥苷，a是脫氧腺苷，t是脫氧胸苷，且其中所述構建體是包含至少一個l-構象核苷酸的線性單鏈或雙鏈dna序列。n¹n²可以是選自包含gt、gg、ga、at或aa的組的元件，n³n⁴是選自包含ct或tt的組的元件。

作為本公開的進一步的實施方式，提供了構建體，其中至少一個l-構象的核苷酸被包含在位于dna單鏈5’-和/或3’-末端或其附近的末端5個核苷酸內(nèi)。

本發(fā)明還提供了包括至少一個具有至少三個連續(xù)的脫氧鳥苷的g延伸(stretch)的dna構建體，所述g延伸位于5’-和/或3’-末端附近，其中該g延伸可以位于兩個根據(jù)權利要求1或2的序列基序之間。

根據(jù)權利要求1或2的兩個序列基序之間的間隔可以是至少5個堿基，特別是當所述序列的元件沒有脫氧鳥苷時。

進一步預期所述dna序列是包含單鏈或雙鏈dna的線性開鏈dna構建體，或是包含至少一個具有單鏈環(huán)的末端的線性dna構建體。

上文定義的序列基序n¹n²cgn³n⁴應位于所述dna序列的單鏈和/或雙鏈區(qū)域內(nèi)。

作為進一步的實施方式，所述構建體包含分子間和/或分子內(nèi)堿基對以及至少一個未配對的、單鏈的區(qū)域。

此外，提供了多聚體構建體，其中至少兩個構建體相互連接，所述構建體包含分子間和/或分子內(nèi)堿基對以及至少一個未配對的、單鏈的區(qū)域。

此外，所述構建體可以包含至少一個l-或d-構象的核苷酸，其被官能團修飾，所述官能團選自包含羧基、胺基、酰胺基、醛亞胺基、縮酮基、乙縮醛基、酯基、醚基、二硫基、硫醇基和醛基的組。

所述修飾的核苷酸可以連接至化合物，所述化合物選自包含肽、蛋白質、碳水化合物、抗體、合成分子、聚合物、微彈(microprojectile)、金屬顆粒、納米顆粒、微團、脂質載體、或固相的組。

本公開提供了dna構建體，其具有在5’末端的第一g延伸和三個根據(jù)權利要求1或2的序列基序，其中至少5個堿基位于第一和第二基序之間，脫氧鳥苷除外，以及具有位于第二和第三序列基序之間的g延伸，且其中三個3’末端脫氧核苷酸中的兩個是l-構象。

本公開的構建體可以用于治療癌癥或自身免疫病或用于調節(jié)免疫系統(tǒng)。

作為本公開的進一步的實施方式，提供了藥物組合物，其包含上述的dna構建體。所述藥物組合物還可以包含化療劑。

此外，提供了疫苗，其包含上述的dna構建體。其中，可以包含所述dna構建體作為佐劑。

發(fā)明詳述

在本公開的含義中，線性開鏈dna序列被指定為dna構建體。所述dna序列可以是單鏈的或是部分或完全雙鏈的。術語dna構建體不代表對相應dna序列的長度限制。dna構建體的單體單元是核苷酸。

dna構建體可以合成制備或是部分或完全生物來源，其中生物來源包括基于遺傳學方法制備dna序列。

l-dna或l-構象的核苷酸指的是核苷酸，其包含l-脫氧核糖而非天然存在的d-脫氧核糖作為糖殘基。l-脫氧核糖是d-脫氧核糖的對映體(鏡像)。部分或完全由l-構象核苷酸組成的dna構建體可以是部分或完全單鏈或雙鏈的；然而，l-構象的核苷酸不能與d-構象的核苷酸雜交(hauseretal.,nucleicacidres.200634:5101-11)。l-dna與d-dna同等地可溶和有選擇性的。然而，l-dna對天然存在的酶尤其是外切核酸酶的降解具有抗性，因此l-dna被保護免受生物學降解(urataetal.,nucleicacidsres.199220:3325-32)。因此，l-dna可非常廣泛地應用。

根據(jù)本公開，“莖”應當理解為dna雙鏈，其通過同一dna分子內(nèi)(其然后部分自我互補)或不同dna分子內(nèi)(其部分或完全互補)的堿基配對形成。分子內(nèi)堿基配對指的是在同一分子內(nèi)的堿基配對，而不同dna分子之間的堿基配對稱作分子間堿基配對。

在本公開的含義中，“環(huán)”應當理解為在莖結構內(nèi)部或其末端的未配對的、單鏈的區(qū)域。“發(fā)夾”是莖和環(huán)的不同組合，其在同一dna分子兩個自我互補的區(qū)域雜交形成具有未配對環(huán)的莖時出現(xiàn)。啞鈴狀描述在莖區(qū)域側翼兩端都具有發(fā)夾的線性dna構建體。因此，本公開上下文中的“線性dna構建體”描述包含單鏈或雙鏈dna的線性開鏈dna構建體或在雙鏈dna莖兩端包含單鏈環(huán)的線性啞鈴狀dna構建體。

術語“dna末端”，無論其意指dna單鏈的5’-或3’末端，指的都不僅僅是末端的核苷酸，也包含末端的5個核苷酸或甚至對各dna末端來說的最后三個核苷酸。dna末端的修飾涉及各核苷酸中的至少一個。

在本公開的含義中“g延伸”應理解為具有至少三個連續(xù)脫氧鳥苷的序列。

核苷酸共價或非共價連接的“固相”指的是，但不限于，柱、基質、珠、玻璃(包括修飾的或功能化的玻璃)、二氧化硅或硅基材料(包括硅和修飾的硅)、塑料(包括聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯和苯乙烯與其它材料的共聚物、丙烯酸酯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯等)、尼龍或硝化纖維素、樹脂、多糖、碳以及無機玻璃、金屬、納米顆粒、和塑料。因此，微孔板也在本公開的固相的范圍內(nèi)。

本公開的免疫調節(jié)指的是免疫刺激和免疫抑制。免疫刺激優(yōu)選地指的是刺激免疫系統(tǒng)的效應細胞以便其增殖、遷移、分化或以任何其它方式活化。例如無共刺激信號時可以通過免疫刺激性dna分子誘導b細胞增殖，而所述b細胞增殖通常需要來自輔助t細胞的共刺激信號。在另一方面，免疫抑制應當理解為降低免疫系統(tǒng)的活化或效力。通常故意誘導免疫抑制以便預防例如移植器官的排斥，治療骨髓移植后的移植物抗宿主病，或用于治療自身免疫病，例如類風濕關節(jié)炎或克羅恩氏病(crohn’sdisease)。

在這個背景下，免疫調節(jié)還可以指對免疫反應本質或特性的影響，其通過影響仍在發(fā)育或成熟的免疫反應或通過調節(jié)已經(jīng)建立的免疫反應的特性。

本公開所用的術語“疫苗接種”指的是施用抗原性材料(疫苗)以產(chǎn)生對疾病的免疫。疫苗可以預防或改善許多病原體(例如病毒、真菌、原生動物寄生蟲、細菌)感染的作用，以及預防或改善變應性疾病和哮喘以及腫瘤的作用。疫苗通常含有用于加強免疫應答的一或多種佐劑，例如，免疫刺激性核酸。通常認為疫苗接種是最有效且經(jīng)濟的預防傳染病和其它疾病的方法。

所施用的材料可以，例如，是病原體(細菌或病毒)活的但弱化的形式、所述病原體的死亡的或滅活的形式、純化的材料如蛋白質、編碼抗原的核酸、或細胞例如腫瘤細胞或樹突細胞。特別是，最近已經(jīng)開發(fā)了dna疫苗接種。dna疫苗接種通過將編碼抗原的dna插入人或動物細胞(且表達，引起免疫系統(tǒng)識別)而生效。免疫系統(tǒng)中一些識別所述表達蛋白的細胞將發(fā)動對這些蛋白和表達這些蛋白的細胞的攻擊。dna疫苗的一個優(yōu)勢是其非常易于生產(chǎn)和儲存。此外，相對于常規(guī)疫苗，dna疫苗具有多種優(yōu)勢，包括誘導更寬范圍的免疫應答類型的能力。

疫苗接種可以用作預防性方法，在疫苗接種的健康個體暴露于抗原后產(chǎn)生針對所述抗原的免疫性。或者，治療性疫苗接種通過將經(jīng)疫苗接種的患病個體的免疫系統(tǒng)導向抗原，可以導致所述免疫系統(tǒng)應答的加強。預防性和治療性疫苗接種均可以應用于人類以及動物。

本公開所用術語“基因治療”指的是對個體的細胞和/或生物學組織的暫時的或永久的遺傳修飾(如基因的插入、替換或移除)以治療疾病，例如腫瘤或自身免疫病?；蛑委熥畛Ｒ姷男问缴婕皩⒐δ芑虿迦氲椒翘囟ǖ幕蚪M位置以置換突變的基因，而其他的基因治療形式涉及直接校正突變或修飾使病毒能夠感染的正?；蚧蛏踔翆⒒蚧蚧蚱无D移進細胞內(nèi)使其轉錄。

“自體基因治療”指的是使用同一個體的組織或細胞。通過基因治療修飾分離的細胞或組織并將其重新導入供體中。相反，“異體(allogenic)基因治療”指的是使用來自受體之外的個體的細胞用于基因治療。在遺傳修飾后，所述異體細胞被導入到受體中。

術語“離體基因治療”指的是這樣的治療方法，其中來自個體的細胞，如造血干細胞或造血祖細胞，離體進行遺傳學修飾并隨后被導入到待治療的個體中。術語“體內(nèi)基因治療”指的是這樣的治療方法，其中來自個體的細胞，如造血干細胞或造血祖細胞，使用例如病毒載體或其它表達構建體在體內(nèi)進行遺傳學修飾。

基因治療也可以被分為“生殖系基因治療”和“體細胞基因治療”。在“生殖系基因治療”中，生殖細胞，即精子或卵子，被遺傳學修飾。所述遺傳變化通常整合至它們的基因組。因此，治療引起的改變將是可遺傳的且將傳遞至后代。該方法對于治療遺傳紊亂和遺傳性疾病是有用的。在“體細胞基因治療”中，將治療性基因轉移進入個體的體細胞中。任何修飾和作用將僅限于所述個體，且不會被該個體的子代和后代遺傳。

術語“癌癥”包括被治療或預防的癌性疾病或腫瘤，其選自包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤、皮膚腫瘤、淋巴瘤、白血病、胃腸腫瘤(包括結腸癌(coloncarcinomas)、胃癌、胰腺癌、結腸癌癥(coloncancer)、小腸癌)、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、前列腺癌、腎細胞癌和/或肝轉移的組。

本公開的自身免疫病包括類風濕關節(jié)炎、克羅恩氏病、全身性紅斑狼瘡(sle)、自體免疫甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、格雷夫斯病(graves’disease)、重癥肌無力、乳糜瀉和阿狄森氏病(addison’sdisease)。

本公開提供了包含至少一個cg基序和至少一個l-構象的核苷酸的線性開鏈dna序列。由于部分/全部l-構象，所述dna不能作為天然存在的d-構象特異性dna降解酶的底物。由此，無需使用被證明具有毒性的硫代磷酸酯主鏈，而可以保護本發(fā)明的dna構建體免受酶促降解。此外，所述dna構建體僅僅由最小數(shù)目的核苷酸組成，這使得所述dna構建體小且因此顯著改善其被患者細胞的吸收。

含cg的dna構建體的效果取決于其與tlr9的相互作用，而dna-蛋白質相互作用取決于dna和蛋白質兩者的構象。由于單個分子的手性對于獲得的聚合物的構象是決定性的，因此未知部分或全部l-構象的dna分子是否能夠結合并激活tlr9。實驗數(shù)據(jù)證明這如此保護的dna分子出人意料地適用于誘導免疫應答。如實施例和附圖所示，單個核苷酸手性的至少部分改變?nèi)匀幻黠@地允許結合并激活tlr9。因此，具有cg基序和l-構象核苷酸的dna分子可以用于免疫調節(jié)。

令人驚奇的是，如在附圖中可見，即使采用相同的核苷酸序列時，所誘導的刺激模式不同于ep1196178(公開了啞鈴狀分子(“dslim”)，其包含在所述分子兩端處的單鏈環(huán)中或在雙鏈莖中的cg基序)所公開的分子誘導的刺激模式。

所述dna序列可以是單鏈的或是部分或完全雙鏈的。這包括在相同分子內(nèi)的(分子內(nèi))或在不同分子內(nèi)的(分子間)或其任意組合的堿基配對。也可能所述構建體包含至少一個未配對的、單鏈的區(qū)域。作為進一步的實施方式，包括發(fā)夾結構。由于部分或全部l-構象，確保了所述構建體的更長的半衰期，原因是l-構象核苷酸不被降解。

也預期單鏈的或是部分或全部雙鏈的至少兩個分子可以相互連接從而形成多聚體構建體。因此所述多聚體構建體中并入至少和連接配偶體一樣多的cg基序，其緊密地包裝在一個分子中，并因此預期該多聚體構建體引發(fā)顯著的免疫應答。獲得的單鏈的或是部分或全部雙鏈的多聚體構建體可以是共價閉合的，在其分子內(nèi)包含l-構象核苷酸，或者是開放的多聚體構建體，其在5’-和/或3’-末端處或其附近包含l-構象核苷酸以保護其免受酶促降解。

根據(jù)本公開，所述一個或多個cg基序位于所述構建體的單鏈和/或雙鏈區(qū)域內(nèi)。正如ep1196178中所公開的，cg基序無論是包含在所述分子的單鏈區(qū)域內(nèi)還是雙鏈區(qū)域內(nèi)，其都能夠引發(fā)免疫應答。

本公開還包括用官能團對至少一個l-或d-構象的核苷酸的化學修飾，所述官能團選自包含羧基、胺基、酰胺基、醛亞胺基、縮酮基、乙縮醛基、酯基、醚基、二硫基、硫醇基和醛基的組。這使得所述dna構建體能通過例如吸附、共價鍵接或離子鍵接偶聯(lián)至化合物，所述化合物選自包含肽、蛋白質、脂質、泡囊、微團、碳水化合物、抗體、合成分子、聚合物、微彈、金屬顆粒、納米顆?；蚬滔嗟慕M。根據(jù)各自的目的可以具體地選擇所述修飾。所述構建體因此可以用于，例如，將其他分子運輸至應答于所加入的cg基序的特定細胞。此外，通過這樣的修飾有可能將所述構建體偶聯(lián)至微彈，其可用于將所述構建體轉移進入細胞。所述構建體也可以偶聯(lián)至固相，例如微孔板。

偏向th1的活化涉及nk細胞和細胞毒性t細胞的活化，而這些免疫應答可以用于癌癥治療。因為含有未甲基化cg基序的dna構建體優(yōu)選地導致th1活化，因此本公開所述構建體可以用于治療癌癥。正在進行多項涉及將tlr9激動劑用于治療癌癥的臨床試驗。這樣的分子已經(jīng)有效地單獨施用或與例如放射療法、手術、化學療法和冷凍療法聯(lián)合施用(krieg,j.clin.invest.2007117:1184-94)。由于本公開所述構建體的有效的免疫調節(jié)、小尺寸和穩(wěn)定性，從這方面看能預期其是非常有優(yōu)勢的。此外，它們獨特的免疫學譜將其與它優(yōu)勢較少的tlr9配體區(qū)分開，且該譜可用于癌癥特異性治療。

在另一方面，tlr9激動劑也參與調節(jié)性t細胞的產(chǎn)生并因此可以用于治療自身免疫病。施用途徑看起來是決定含有cg基序的dna構建體的體內(nèi)效果的一個變量(krieg,j.clin.invest.2007117:1184-94)。

已經(jīng)證明這樣的含有cg基序的dna分子的免疫刺激作用能改善癌癥治療中標準治療方法例如化學療法的效力。因此，也提供了包含本公開所述構建體的藥物組合物。再者，與現(xiàn)有技術中的tlr9激動劑相比，本公開所述構建體的優(yōu)越性能使得該構建體成為治療例如癌癥、傳染病、過敏反應和哮喘的疾病的有前景的工具。過敏反應和哮喘(主要是th2-介導的)的治療因此得益于對th1活化的偏好性。

由于tlr9激動劑已經(jīng)被證明是有效的疫苗佐劑，因此也提供了包含本公開所述dna構建體的疫苗。本公開所述構建體僅包含用于tlr9刺激的相關序列且由于其l-核苷酸修飾而是穩(wěn)定的。因此，可以避免由于無關序列而導致的副作用。所述分子較長的半衰期確保了高效的刺激，并因此預期強的免疫應答。

使用合成柱和各核苷酸(β-l-脫氧“nt”(n-bz)ced亞磷酰胺；“nt”代表腺苷、胞苷、鳥苷或胸苷)制備本公開所述dna分子。所述dna分子隨后通過hplc純化。

為了揭示使用l-核糖而非d-核糖的dna的效果，以下dna分子用于此處描述的最初實驗(表1)。

表1：非編碼免疫調節(jié)dna構建體和對照的序列。

使用表1所述序列的實驗顯示含有cg基序的l-核糖保護的線性序列能夠刺激免疫系統(tǒng)且其誘導的免疫應答明顯不同于ep1196178公開的dslim誘導的免疫應答。因此，命名為odn2216(gggggacgatcgtcgggggg；seqid6)的經(jīng)修飾的序列和其修飾被用于研究結構差異的影響，如g-延伸的存在、長度和位置，cg基序間的間隔以及l(fā)-核糖核苷酸和cg基序、g-延伸之間的距離的各自影響。

表2總結了所使用的序列，以及與odn2216相比(前兩個和最后6個核苷酸用硫代磷酸酯修飾)，它們對ifn-α和ip-10分泌的作用，其中粗體字母表示包含l-核糖的核苷酸，斜體字母指的是g-延伸而下劃線字母指得是cg-基序。破折號將各序列置于合適位置以與ckm508相比較，但其不代表所述序列結構上或功能上的修飾。

表2：與odn2216(odn2216前兩個和最后6個核苷酸用硫代磷酸酯修飾)相比，所指示的序列對ifn-α和ip-10分泌的作用。

用具有至少一個g延伸(特別是在3'末端處或其附近)的序列獲得了好的結果。刺激還依賴于cg-基序的存在(ckm477)，再次表明了所述刺激不是l-核糖而是cg基序的作用。

用odn2216修飾的序列獲得的結果鑒定出了有利的結構組分，其被轉移至ckm374的dna序列。表3顯示了將所述修飾的序列與ep1196178公開的啞鈴狀dslim相比較的結果。同樣地，粗體字母代表包含l-核糖的核苷酸，斜體字母指的是g-延伸，雙下劃線字母代表硫代磷酸酯修飾的核苷酸而下劃線字母指的是gc-基序。

從表3的結果可獲知，直接位于5’末端的g延伸看起來是有利的(對比ckm532和ckm499)。此外，在5’末端處使用4個而非3個脫氧鳥苷進一步增加了其對ifn-α和ip-10的刺激(對比ckm501和ckm532)。

在gc-基序之間添加額外的g-延伸看起來也是有益的(對比ckm532和ckm520)。第一個和第二個g-延伸之間的距離進一步影響所述dna分子的效力。此外，僅在3'末端處或其附近使用包含l-核糖的脫氧核苷酸看起來賦予了所述dna分子足夠的穩(wěn)定化程度。可以觀察到預期的對ifn-α和ip-10的良好的刺激(見下文)。因為il-8已經(jīng)被證明是誘導新生血管發(fā)生，所以僅僅小量誘導il-8分泌看起來是有益的。

明顯地，g延伸的存在和小心選擇的位置與含有l(wèi)-核糖的脫氧核苷酸的穩(wěn)定作用的組合使得可以制備優(yōu)于dslim分子的刺激效率的dna分子。

表3：與dslim相比，所指示的序列對ifn-α、ip-10和il-8分泌的作用。

附圖簡述

本公開將通過實施例和附圖進一步被闡明，但不被限于所公開的實施方式。其顯示:

圖1酶消化后dna構建體的瓊脂糖凝膠電泳

圖2小鼠巨噬細胞細胞系刺激后的gfp強度。

圖3類漿細胞樹突細胞(pdc)刺激后的mip-1α濃度。

圖4pdc刺激后的mip-1β濃度。

圖5pdc刺激后的il-8濃度。

圖6pdc刺激后的il-6濃度。

圖7pdc刺激后的ifn-α濃度。

圖8pdc刺激后的tnf-α濃度。

圖9外周血單個核細胞(pbmc)刺激后的mcp-1和il-8濃度。

圖10pbmc刺激后活化的t細胞的頻率。

圖11,12pbmc的ifn-α、ip-10和il-8分泌。

圖13l-核糖修飾的末端脫氧核苷酸對elam9細胞刺激的作用。

圖14與未刺激狀態(tài)相比，由ckm532和dslim對b細胞和pdc的免疫刺激。

附圖詳述

圖1顯示全部dna構建體由來自t7噬菌體的t7-聚合酶消化后的凝膠。6μg的各dna構建體與10單位的t7-聚合酶孵育(總反應體積：20μl)。經(jīng)過0、1、2、5、30和1500分鐘后，從樣品中取出3μl的孵育混合物并用5μl含甲酰胺的sanger染料稀釋。所有的等分試樣加樣至3％的瓊脂糖凝膠，并在100伏運行40分鐘。

和t7-聚合酶孵育5分鐘后，發(fā)現(xiàn)未修飾的dna分子lin-30l2(泳帶2)被完全消化，然而本發(fā)明所述構建體(ckm337；泳帶3)以及dslim(泳帶1)和硫代磷酸酯修飾的構建體ckm338(泳帶4)和ckm339(泳帶5)甚至在1500分鐘的孵育后仍保持顯著的存在。事實上，在全部測試的分子中，ckm337顯示了最高的穩(wěn)定性。由于其不足的穩(wěn)定性，在進一步的研究中排除了lin30l2。

圖2顯示用不同的刺激性dna構建體對elam9細胞的刺激。elam9細胞是tlr9-陽性鼠巨噬細胞(raw264)，其被人彈性蛋白啟動子(helam)控制下的d1-egfp穩(wěn)定轉染，所述人彈性蛋白啟動子含有若干nfκb應答元件。在所述細胞接種1天后，其用所示dna構建體(3μm)刺激7小時。通過流式細胞術測量gfp強度的幾何平均值。

除了最后的t以外其他全部核苷酸為l-構象的dna構建體(ckm336)沒有刺激能力。然而，兩端處均具有l(wèi)-構象核苷酸的dna構建體(ckm337)的確刺激了gfp表達。這是相當出人意料的，因為含有具有l(wèi)-構象核苷酸的cg基序的dna構建體是否能夠結合并激活tlr9是未知的。此外，預期ckm337比dslim(ep1196178公開的分子)更容易被細胞攝取，且比硫代磷酸酯修飾的構建體(ckm338和ckm339)具有更低的毒性。

圖3至圖8顯示dna構建體對pdc分泌炎癥趨化因子和細胞因子的作用。使用來自miltenyi,diamondpdc試劑盒的組合分選方法從ficoll純化的pbmc中富集pdc：首先，使用來自miltenyi’s試劑盒的pdc生物素-抗體混合物(cocktail)從pbmc去除非-pdc，然后使用來自pdcdiamond試劑盒的cd304(bdca-4)diamond微球從細胞中正篩選pdc。將2.5x10⁵/ml的pdc和10ng/ml的il-3接種在培養(yǎng)基中(rpmi1640、10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、100單位/ml鏈霉素、2mm谷氨酰胺，37℃，5％co2)，并用3μm的各構建體刺激2天。

為了測定細胞刺激后分泌的化合物的量，收集經(jīng)刺激的細胞的澄清上清液并使用多重系統(tǒng)(來自ebioscience/bendermedsystems的flowcytomix)或elisa分析。

出乎意料地，與使用dslim刺激相比，使用ckm337刺激的pdc顯示出了對mip-1α、-1β和il-8分泌的類似的作用。使用linckm338和ckm339刺激后mip-1α、-1β和il-8分泌稍微提高(圖3、4和5)。然而，全部的硫代磷酸酯修飾的構建體繼承了上文所述的若干缺點。

關于il-6分泌，dslim、ckm337和ckm338對pdc具有類似作用。ckm339稍微更有效(圖6)。

值得注意的是，與全部其它線性構建體相比，ckm337對pdc的ifn-α分泌具有出乎意料地更強的作用(圖7)。

dslim、ckm337、ckm338和ckm339全部對pdc的ifn-α分泌具有類似的作用(圖8)。

通過ficoll密度梯度從人血沉棕黃層分離pbmc。對于功能分析，通過以指定濃度(2-3μm)施加各化合物對培養(yǎng)基(rpmi1640、10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、100單位/ml鏈霉素、2mm谷氨酰胺，37℃，5％co2)中的10⁶細胞/ml刺激2天。

圖9(a和b)顯示所示dna構建體(各3μm)對pbmc分泌mcp-1和il-8的作用。如根據(jù)使用pdc的實驗所預期的，全部核苷酸為l-構象的dna構建體(ckm336)施加至pbmc時沒有刺激能力。然而，ckm337對激發(fā)mcp-1和il-8兩者的分泌是有效的。出乎意料地，與dslim相比，其對il-8分泌的作用更強而對mcp-1分泌的作用更弱。

為了測定細胞亞群和其活化狀態(tài)，使用選擇性熒光團連接的抗體標記特征性表面標志物。以10⁶細胞/染色組進行抗體染色；每組和多達4種不同的與熒光團連接的抗體一起孵育，最后重懸于400μlfacs緩沖液并通過流式細胞術分析至少100,000活細胞。用于測定t細胞和其中的活化細胞的門控策略是帶有活化標志物cd69的cd3+/cd56-。

圖10顯示所示的dna構建體(各2μm)對pbmc群體內(nèi)活化t細胞頻率的作用。全部5種構建體具有類似的刺激能力。t細胞不表達tlr9。因此，在用所述dna構建體刺激后，pbmc群體內(nèi)的細胞被活化，其進而能夠活化t細胞。

序列的優(yōu)化顯示g-延伸的引入增強了寡核苷酸轉染后的效力。所述效力還依賴于cg-基序之間的距離。通過使用在寡核苷酸3’-末端處的包含l-核糖的脫氧核苷酸，能夠充分地保護線性dna序列免受降解(比較表2和表3)。從表3可以得出，寡核苷酸ckm501(seqidno:33)、ckm527(seqidno:32)、ck532(seqidno:31)和ckm534(seqidno:34)顯示出意料之外的好結果。圖11和12顯示指定的dna構建體對pbmc中分泌細胞因子ifn-α(上)、ip-10(中)和il-8(下)的作用。實驗操作如上文所述。

圖11顯示與啞鈴狀的dslim相比，ckm501和ckm527導致了ifn-α分泌水平升高且ckm527也增加了ip-10分泌。對于dslim，il-8的分泌相當?shù)?，與ckm339相比更低，所述ckm339是啞鈴狀dslim的單鏈環(huán)的序列，其在兩端用硫代磷酸酯修飾的脫氧核苷酸保護。

從圖12可以得出，ckm532顯示出顯著且出人意料的對ifn-α和ip-10分泌的高誘導，但其顯示出對il-8分泌的相當?shù)偷恼T導。因此，ckm532確認了結構元件g-延伸直接位于5’-末端處且有另一個g-延伸位于兩個cg-基序(第二和第三gc-基序)之間，這看起來是有利的。表3中的ckm520和ckm532的比較，表明ckm532中g-延伸位于第二和第三cg-基序之間是ifn-α和ip-10分泌的預期增加的原因，而ckm520主要增加il-8分泌。此外，僅用兩個在3’末端處的包含l-核糖的脫氧核苷酸保護寡核苷酸似乎是足夠的。

從圖12中ckm532和ckm534的比較可以得出，縮短5’-末端處的g-延伸導致效力降低。鑒于增加了的ifn-α和ip-10分泌和低的il-8分泌，ckm532再次證明了所鑒別的結構組分的優(yōu)勢。

圖13上部顯示用所指示的dna構建體刺激elam9細胞的結果，所述構建體包含具有不同程度l-核糖修飾的脫氧核苷酸。在圖13下部的序列中，包含l-核糖的核苷酸以粗體字母表示。實驗以一式兩份進行(l-dslim032和l-dslim030)。

包含l-核糖的脫氧核苷酸的程度和位置對于elam9細胞的刺激有影響。完全l-構象的序列(ckm336；seqidno:2)根本沒有任何刺激作用，這與wo2010/039137的公開一致。使用由在3’-和5’-末端處的包含l-核糖的脫氧核苷酸進行保護的包含cg-基序的寡核苷酸獲得了好的效果，而在5’末端處的包含l-核糖的脫氧核苷酸的長延伸則適得其反(比較ckm489和ckm490)。此外，用包含l-核糖的脫氧核苷酸修飾cg-基序導致作用的喪失。因此，為了達到良好的刺激作用，cg-基序不應當包含l-核糖且在兩端的l-核糖修飾的脫氧核苷酸的延長應當受到限制，即5’末端不超過8個末端脫氧核甘酸和最多最后一個cg-基序之后的3’末端脫氧核苷酸。

圖14顯示與未刺激狀態(tài)相比，ckm532和dslim產(chǎn)生的免疫刺激。使用圖10中所述實驗應用的方案進行facs實驗并分別應用于b細胞(門控策略:cd19陽性，cd86作為活化標志物)和pdc(門控策略:譜系陰性，hla-dr陰性，cd123陽性細胞，cd40和hla-dr作為活化標志物)。顯示的數(shù)據(jù)是基于對三種不同血沉棕黃層制備物的測量。

圖14上顯示通過標志物cd86證明的b細胞的刺激。顯然，與dslim和未刺激狀態(tài)相比，ckm532導致b細胞的刺激增加。這顯示為b細胞成熟的增加，例如產(chǎn)抗體細胞，其是免疫刺激的重要特征。

圖14下顯示使用標志物hla-dr檢測的pdc的刺激。hla-dr是mhc分子的一部分，也因此是免疫系統(tǒng)抗原呈遞過程的一部分。與dslim或未刺激的細胞相比，ckm532再次顯示了該免疫刺激特征的更強的增加。

總之，ckm337(d-dna構建體，其兩端具有l(wèi)-構象的核苷酸)令人驚奇地對pbmc和分離的pdc兩者均具有刺激作用，而全部核苷酸為l-構象的dna構建體(ckm336)沒有作用。顯然，ckm337的構象仍然允許其與tlr9的結合，而ckm336空間上不能結合或刺激tlr9。

出乎意料地，相比于啞鈴狀的dslim和硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸，由ckm337誘導的刺激模式與其它所有構建體相比都是獨特的。ckm337誘導pdc分泌最高量的ifn-α。pbmc分泌il-8弱于硫代磷酸酯修飾的分子，但強于dslim。相反，dslim誘導pbmc分泌更高量的mcp-1，但ckm337與硫代磷酸酯修飾的分子相當。

通過在線性dna分子的5’末端直接引入所謂的g-延伸使得可能增強用ckm337觀察到的效果。此外，結果表明僅僅通過3’-末端處的包含l-核糖的脫氧核苷酸針對降解的保護對于穩(wěn)定所述寡核苷酸來說是足夠的。所鑒別的結構特征(g-延伸、cg-基序、cg-基序的間隔以及通過使用不同程度和位置的l-核糖修飾的脫氧核苷酸的保護)使得能夠調節(jié)包含l-核糖的寡核苷酸的免疫刺激作用?？雌饋硐喈斆黠@，本公開揭示了構建用于細胞或免疫系統(tǒng)靶向刺激的免疫調節(jié)dna構建體的新工具。

多年來已知ifn-α為抗病毒細胞因子。其刺激th1細胞發(fā)育，從而促進含有cg的dna分子的作用。ifn-α還顯示出在小鼠和人惡性腫瘤中的抗腫瘤活性并能夠減少移植腫瘤細胞的致腫瘤性，其部分地是通過活化細胞毒性t細胞從而增加腫瘤細胞細胞溶解的可能性。ifn-α也增加nk細胞和巨噬細胞的活性，這兩者對于抗腫瘤細胞毒性均是重要的(brassardetal.,j.leukoc.biol.200271:565-81)。因此，用本公開的所述dna構建體刺激后ifn-α量的增加預期對于治療癌癥是有益的。

最近已經(jīng)證明ip-10是體內(nèi)有效的抗血管生成(angiostatic)蛋白。因此，ip-10的誘導尤其在治療腫瘤疾病中看起來也是有益的。

il-8是促炎細胞因子，已知其能介導中性粒細胞活化以及從外周血向組織內(nèi)的遷移。如已經(jīng)在卵巢癌中被證明的，所獲得的中性粒細胞浸潤可能是抑制腫瘤生長的部分原因(leeetal.,j.immunol.2000164:2769-75)。此外，il-8還是對t細胞和嗜堿性粒細胞是趨化性的。因此，對于至少一些腫瘤類型的治療或預防，含cg的dna構建體引起的il-8的選擇性上調是有利的。在另一方面，已經(jīng)明確il-8引起血管發(fā)生，使得il-8分泌的誘導可能適得其反。因此，通過本發(fā)明所述的不同的dna分子對il-8不同程度的誘導可能使得能夠針對所需治療效果改造所述分子。

已知mcp-1參與單核細胞/巨噬細胞募集至損傷和感染位點，并因此可能參與刺激宿主抗腫瘤應答。已經(jīng)證明mcp-1可以活化單核細胞，使之在體外對幾種人腫瘤細胞的細胞生長抑制更強(zachariaeetal.,j.exp.med.1990171:2177-82)。因此，和il-8類似，根據(jù)具體的腫瘤類型調節(jié)mcp-1的表達是有益的。

因此，誘導的特異性細胞因子對于治療和預防不同的腫瘤類型是有益的。顯然，未甲基化的cg-基序呈遞給tlr9的具體狀況決定了應答細胞中誘導的各自獨特的刺激模式。

序列表

<110>莫洛根股份公司

<120>非編碼免疫調節(jié)dna構建體

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