本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種sirna序列及應(yīng)用，尤其涉及一種可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列及外用治療銀屑病的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銀屑病作為一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，病情頑固病情容易反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)給患者及親屬造成了沉重的生活負(fù)擔(dān)和精神困擾，而其以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的外觀也嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康。但是，銀屑病的具體發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確。研究表明，遺傳因素、環(huán)境因素以及自身免疫因素共同導(dǎo)致了銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。以往研究認(rèn)為，t細(xì)胞作為機(jī)體的主要免疫細(xì)胞，在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中起著主要的作用。近些年，隨著研究的深入，廣大學(xué)者對(duì)除t細(xì)胞之外的角質(zhì)形成細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞在銀屑病中發(fā)揮的作用，也逐漸有了新的認(rèn)識(shí)。然而這些細(xì)胞具體在疾病的不同階段中以何種方式發(fā)揮何種作用，仍不是十分明確。

角蛋白17(k17)作為一種細(xì)胞骨架蛋白，是角蛋白家族中的一員，屬于i型角蛋白，由432個(gè)氨基酸組成，分為頭、體、尾三個(gè)結(jié)構(gòu)域，主要的功能區(qū)在體區(qū)。k17具有高度保守性，其在不同種屬間，如鼠和牛，體和尾兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均可保持90％以上的保守性。在正常情況下，k17主要分布于毛囊、指甲、皮脂腺及汗腺等部位，在維持細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用。在臨床上，k17基因的突變可以引起多發(fā)性脂囊瘤及2型先天性甲肥厚。這提示k17能夠參與皮膚附屬器的分化發(fā)育。當(dāng)皮膚損傷后，k17的表達(dá)亦會(huì)有所升高。研究發(fā)現(xiàn)，干涉k17的原代角質(zhì)形成細(xì)胞，其體積變小，蛋白合成效率降低。而在k17敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胚胎外胚層創(chuàng)口的愈合時(shí)間有所延長(zhǎng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，k17能夠參與細(xì)胞內(nèi)的激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和蛋白合成等功能。

早在上世紀(jì)90年代即有學(xué)者發(fā)現(xiàn)k17在銀屑病患者頭皮中高表達(dá)。而后亦有研究發(fā)現(xiàn)k17表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。由于在正常的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中不表達(dá)，k17的這種表達(dá)模式提示與銀屑病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。伴隨著銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活躍和分化障礙，角蛋白譜也隨之發(fā)生了變化。在正常角質(zhì)形成細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)的k1和k10，在銀屑病皮損中的表達(dá)下調(diào)，取而代之的則是代表著角質(zhì)形成細(xì)胞高增殖狀態(tài)的角蛋白，包括k6、k16和k17(見(jiàn)圖1)。那么，k17如此異常高表達(dá)的機(jī)制是什么呢？komine等對(duì)k17的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究發(fā)現(xiàn)，凡是能介導(dǎo)stat1磷酸化激活的細(xì)胞因子，如il-6，均可上調(diào)k17的表達(dá)。而il-3、il-4、il-10、ifn-α及ifn-β等不能激活stat1的細(xì)胞因子，均不能上調(diào)k17的表達(dá)，這一結(jié)果提示stat1是k17表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)于2011年在細(xì)胞及動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子il-17a能夠通過(guò)stat1和stat3上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中k17的表達(dá)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，il-22能夠通過(guò)stat3和erk1/2通路來(lái)上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中k17的表達(dá)?？梢?jiàn)，銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中k17的表達(dá)受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，包括il-17、il-22和ifn-γ等，而這些細(xì)胞因子都是由銀屑病發(fā)病過(guò)程中的輔助t細(xì)胞分泌的。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，由于k17含有與鏈球菌m蛋白相類似的氨基酸序列“aleeanxxl”，且含有這一序列的k17肽段能夠刺激來(lái)自于銀屑病患者的t細(xì)胞分泌ifn-γ，因此提示k17可能是銀屑病自身反應(yīng)性t細(xì)胞的靶抗原。不久后，k17與鏈球菌m蛋白相類似的另一抗原表位“glrrxld”也被發(fā)現(xiàn)。隨后，中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)通過(guò)利用體外k17肽段及抗原提呈細(xì)胞同銀屑病患者來(lái)源的t細(xì)胞共孵育，證實(shí)了含有“aleeanxxl”表位的k17肽段確實(shí)能夠激活自身反應(yīng)性t細(xì)胞，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的能夠刺激t細(xì)胞活化的k17抗原表位90。由此可見(jiàn)，k17可能作為一個(gè)重要的自身抗原，參與銀屑病的免疫反應(yīng)過(guò)程。

在此基礎(chǔ)上，首次提出了銀屑病發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)由k17參與的環(huán)路：銀屑病局部t細(xì)胞活化后，釋放il-17、il-22和ifn-γ等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，使k17表達(dá)升高，此時(shí)高表達(dá)的k17被角質(zhì)形成細(xì)胞或?qū)Ｂ毜目乖岢始?xì)胞提呈給初始t細(xì)胞，使其活化，產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，促進(jìn)銀屑病的進(jìn)一步惡化，以此形成循環(huán)。并且研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)反義核酸或sirna等技術(shù)抑制k17的表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中分別觀察到角質(zhì)形成細(xì)胞增生活性下降、表皮厚度變薄、炎癥反應(yīng)減輕、銀屑病皮損改善等現(xiàn)象，首次明確了k17分子可以作為新的靶標(biāo)用于銀屑病的治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種能夠可有效抑制角蛋白17表達(dá)、可為今后研發(fā)銀屑病靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)的可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列，其特征在于：所述可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的基因名稱是krt17-219、krt17-452或krt17-1472；

所述krt17-219的正義鏈5’-3’是gggagcaacaguuauuccatt，所述krt17-219的反義鏈3’-5’是uggaauaacuguugcuccctt；

所述krt17-452的正義鏈5’-3’是cuacagcgcuuauuaccautt，所述krt17-452的反義鏈3’-5’是augguaauaagcgcuguagtt；

所述krt17-1472的正義鏈5’-3’是gagaccauuaaagcuugcutt，所述krt17-1472的反義鏈3’-5’是agcaagcuuuaauggucuctt。

可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列在制備治療銀屑病藥物的應(yīng)用。

可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列在制備減輕銀屑病病癥藥物的應(yīng)用。

一種基于可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列制備而成的治療銀屑病的藥物。

一種用于治療銀屑病的藥物，其特征在于：所述用于治療銀屑病的藥物是由可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列、1×磷酸緩沖鹽溶液pbs以及醫(yī)用凡士林混合而成；所述可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的用量是5-20μl；所述1×磷酸緩沖鹽溶液pbs的用量是20-50μl；所述凡士林的用量是80-300μl。

上述可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的用量是8-12μl；所述1×磷酸緩沖鹽溶液pbs的用量是25-40μl；所述凡士林的用量是90-150μl。

上述可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的用量是10μl；所述1×磷酸緩沖鹽溶液pbs的用量是30μl；所述凡士林的用量是100μl。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

本發(fā)明提供了一種可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列及應(yīng)用，該可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的基因名稱是krt17-219、krt17-452或krt17-1472；該可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列能夠抑制角蛋白17表達(dá)、能減輕imq誘導(dǎo)銀屑病、能降低皮損細(xì)胞因子的表達(dá)水平、能夠減輕imq誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。本發(fā)明在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討在咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型中，k17與細(xì)胞因子和趨化因子以及中性粒細(xì)胞的關(guān)系，為今后研發(fā)銀屑病靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是正常表皮與銀屑病表皮角蛋白表達(dá)對(duì)比圖；

圖2是k17在sirna干涉imq誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型中的表達(dá)；

圖3a是ctrl-v組、imq-v組以及imq-sirna組小鼠的外觀；

圖3b是ctrl-v組、imq-v組以及imq-sirna組小鼠在低倍(10×)和高倍(40×)鏡下的h&e染色切片；

圖3c是ctrl-v組、imq-v組以及imq-sirna組小鼠表皮厚度統(tǒng)計(jì)圖；

圖4a是ctrl-v組、imq-v組以及imq-sirna組小鼠細(xì)胞因子的表達(dá)情況；

圖4b是ctrl-v組、imq-v組以及imq-sirna組小鼠趨化因子的表達(dá)情況；

圖5a是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ctrl-v組、imq-v組以及imq-sirna組小鼠表皮中的中性粒細(xì)胞數(shù)量的分布；

圖5b是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ctrl-v組、imq-v組以及imq-sirna組小鼠表皮中的中性粒細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列，可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的基因名稱是krt17-219、krt17-452或krt17-1472；

krt17-219的正義鏈5’-3’是gggagcaacaguuauuccatt，krt17-219的反義鏈3’-5’是uggaauaacuguugcuccctt；

krt17-452的正義鏈5’-3’是cuacagcgcuuauuaccautt，krt17-452的反義鏈3’-5’是augguaauaagcgcuguagtt；

krt17-1472的正義鏈5’-3’是gagaccauuaaagcuugcutt，krt17-1472的反義鏈3’-5’是agcaagcuuuaauggucuctt。

本發(fā)明所提供的可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列在制備治療銀屑病藥物或減輕銀屑病病癥藥物的應(yīng)用。

基于本發(fā)明所提供的可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列，還可以制備成的治療銀屑病或減輕銀屑病的藥物。

同時(shí)，本發(fā)明采用上述可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列，提供了一種用于治療銀屑病的藥物，該用于治療銀屑病的藥物是由可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列、1×磷酸緩沖鹽溶液pbs以及醫(yī)用凡士林混合而成；可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的用量是5-20μl；1×磷酸緩沖鹽溶液pbs的用量是20-50μl；凡士林的用量是80-300μl，作為優(yōu)選，本發(fā)明采用的可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列的用量是8-12μl；1×磷酸緩沖鹽溶液pbs的用量是25-40μl；凡士林的用量是90-150μl。

實(shí)施例1：

k17sirna配置

配制k17-sirna乳膏：本發(fā)明所提供的可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列中每種sirna序列各10μl，1xpbs30μl，凡士林：100μl，充分混勻，制備成乳膏狀。

實(shí)施例2：

本發(fā)明所提供的可抑制角蛋白17表達(dá)的sirna序列是：

表1k17-sirna序列

實(shí)施例3：

根據(jù)3種不同的sirna序列，分別制備軟膏，在imq外用涂抹構(gòu)建的銀屑病樣小鼠模型中進(jìn)行如下試驗(yàn)，并得到試驗(yàn)結(jié)果：

1、k17sirna干涉效果驗(yàn)證及驗(yàn)證

將配制好的k17-sirna乳膏涂抹于剃毛后的野生型c57bl/6小鼠背部，連續(xù)涂抹2天后，再繼續(xù)涂抹k17-sirna乳膏的同時(shí)加用imq(咪喹莫特)，檢測(cè)對(duì)imq誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型進(jìn)行sirna干涉后其k17表達(dá)情況。脫頸處死小鼠后，取小鼠背部皮膚組織行real-timepcr，檢測(cè)k17表達(dá)。結(jié)果顯示，imq-sirna組的k17表達(dá)量明顯低于imq-v組(p<0.001)(圖2)，ctrl-v組是只涂抹凡士林；imq-v組是交替涂抹凡士林和imq；imq-sirna組是交替涂抹k17-sirna和imq。

2、k17表達(dá)下調(diào)減輕imq誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠表型

在imq-v組交替涂抹凡士林和imq(咪喹莫特)、imq-sirna組交替涂抹k17-sirna和imq(方法見(jiàn)2.1.3)后，可以觀察到imq-sirna組和imq-v組在外觀上差異不明顯(圖3a)。但是在h&e染色切片上可以看出，imq-sirna組的表皮較imq-v組薄，更接近c(diǎn)trl-v組(圖3b)，同時(shí)可以觀察到，在imq-v組中，真皮淺層有較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表皮內(nèi)也可見(jiàn)少量炎細(xì)胞，而在另外兩組中此現(xiàn)象并不明顯。測(cè)量表皮厚度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)(圖3c)，雖然imq-v組和imq-sirna組的表皮相較于ctrl-v組均有增厚(p<0.001)，但后者增厚的程度較前者輕，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。

3、角蛋白17下調(diào)對(duì)皮損細(xì)胞因子的影響

通過(guò)h&e染色切片觀察到imq-sirna組表皮增厚較imq-v組有所減弱，那么k17表達(dá)降低造成的表皮增厚減弱、角質(zhì)形成細(xì)胞增殖降低，是否會(huì)影響表皮內(nèi)的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)？因此通過(guò)real-timepcr來(lái)觀察三組小鼠中細(xì)胞因子和趨化因子變化的情況。結(jié)果顯示，imq-v組的il-6、il-8及il-22的表達(dá)量明顯高于ctrl-v組(p<0.01，p<0.001，p<0.01)，而在imq-sirna組中，三種細(xì)胞因子的表達(dá)量較imq-v組有明顯降低(p<0.001，p<0.001，p<0.01)(圖4a)。在cxcl-1、cxcr-3、ccr-4、ccr-10、ccl-20、ccl-22等趨化因子的表達(dá)中，imq-v組的表達(dá)量均顯著高于ctrl-v組，但各趨化因子在imq-sirna組中的表達(dá)卻較imq-v組有明顯的降低(圖4b)。說(shuō)明k17的缺失可能造成細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)量的減少。

4、角蛋白17下調(diào)對(duì)皮損炎細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

通過(guò)對(duì)h&e切片染色的觀察，發(fā)現(xiàn)imq-v組中的真皮淺層有較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表皮內(nèi)也可見(jiàn)少量炎細(xì)胞，而在另外兩組中此現(xiàn)象并不明顯。結(jié)合實(shí)時(shí)定量pcr的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)在imq誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型中k17可能還發(fā)揮著對(duì)炎癥細(xì)胞的趨化作用。因此，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)此模型中炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果表明：imq-v組的中性粒細(xì)胞百分比明顯高于ctrl-v組(p<0.001)，而k17表達(dá)降低的imq-sirna組，中性粒細(xì)胞數(shù)量則遠(yuǎn)低于imq-v組(p<0.001)(見(jiàn)圖5a以及圖5b)。證明k17表達(dá)量的降低，可以減輕imq誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。