專利名稱：一個(gè)新的控制真菌菌落生長與致病力的ank蛋白及其編碼基因與利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)藥學(xué)、植物病理學(xué)與真菌學(xué)等領(lǐng)域中控制真菌菌落生長與致病力蛋白及其編碼基因和啟動(dòng)子的功能與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
錨蛋白重復(fù)序列(ANK，ankyrin repeat)是生物體中廣泛利用的一種序列模塊，指相對保守的33個(gè)氨基酸的重復(fù)出現(xiàn)。這種模塊首先在兩個(gè)酵母細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Swi6和Cdc10中發(fā)現(xiàn)(Breeden and Nasmyth，1987)，隨后，在細(xì)胞骨架錨蛋白(ankyrins)中也發(fā)現(xiàn)了含有24個(gè)這種重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)，因此將這種結(jié)構(gòu)稱為錨蛋白重復(fù)序列模體(ANK repeat motif)(Lux et al，1990)。晶體結(jié)構(gòu)顯示，該模體折疊成β2α2二級(jí)結(jié)構(gòu)，在空間上則形成L型結(jié)構(gòu)，β發(fā)夾(“L”的短臂)延伸在反平行的兩個(gè)α螺旋(“L”的長臂)之外，與α螺旋構(gòu)成的平面幾乎垂直，彼此相臨的ANK模體之間通過β發(fā)夾形成一個(gè)連續(xù)的反平行β片層，數(shù)目不等的ANK串聯(lián)起來，依靠氫鍵和疏水作用，組成緊密穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域，形成種類眾多但功能各異的ANK蛋白質(zhì)分子。這種蛋白質(zhì)分布廣泛，從病毒、原核生物、真核生物到人體，從細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞外介質(zhì)都有報(bào)道。在SMART數(shù)據(jù)庫中已確定的3608個(gè)蛋白質(zhì)中含有19,276個(gè)ANK重復(fù)(NRDB；Schultz et al，1998；Letunic et al.2002)。ANK結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，能夠和多種配體結(jié)合，行使紛繁復(fù)雜的生物功能，包括信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架形成、轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞周期調(diào)控，炎癥發(fā)生及發(fā)展、膜蛋白和毒素等(Steven G，1999，Leila K.Mosavi，2004)。
在植物與微生物互作研究方面，Delaney等在擬南芥上篩選一個(gè)無誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的突變體nim1，該突變體受病原物誘導(dǎo)后有水楊酸的積累，但是卻不能誘導(dǎo)SAR基因的表達(dá)，表明該突變阻斷了SA的下游(Delaney et al，1995)，該NIM1蛋白與含有ANK的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子抑制子IκB具有相似性(Ryals et al，1997)。Cao等人在擬南芥上篩選了一個(gè)對誘導(dǎo)SAR無反應(yīng)的突變體npr1(Cao et al.1994)，后又發(fā)現(xiàn)NPR1基因調(diào)控SAR，并且編碼一個(gè)新的含有ANK重復(fù)的蛋白(Cao et al.1997)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NPR1是擬南芥抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游控制SA積累的關(guān)鍵基因，也是SA誘發(fā)的系統(tǒng)抗性的中心元件，通過病原特異信號(hào)控制NPR1在多途徑中的調(diào)節(jié)作用，NPR1與其他蛋白質(zhì)發(fā)生選擇性的協(xié)同作用從而激活一系列的抗病相關(guān)基因產(chǎn)生系統(tǒng)抗性(Dempsey等，1999)。在SA途徑中，NPR1基因通過WRKY70誘導(dǎo)PR蛋白的產(chǎn)生，從而啟動(dòng)植物的SAR(Clarte et al.1998，2000；Li et al.2004)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)該基因的編碼產(chǎn)物能介導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子TGA家族成員的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Thomma等，1999；Zhou等，1999)，而這種互作正是NPR1作用的分子基礎(chǔ)。因此，推測NPR1蛋白通過與其它蛋白作用來調(diào)控SA激活的植物防御反應(yīng)。
酵母細(xì)胞中，含有ANK重復(fù)的YAR1基因是細(xì)胞增殖的必需基因(Deborah etal.1996)。真核細(xì)胞的發(fā)育過程分G1、S、G2、M四個(gè)時(shí)期，而G1-S期的過渡是中心調(diào)控階段，在許多細(xì)胞中，有絲分裂信號(hào)和細(xì)胞大小在此階段異常敏感。裂殖酵母中，此階段的許多基因的啟動(dòng)子區(qū)域連接著一些順式調(diào)控元件，如SCB(Swi4-Swi6 cell cycle box，CACGAAA)和MCB(MluI cell cycle box，ACGCGTNA)。與SCB結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子SBF(SCB-binding factor)包括Swi4蛋白和Swi6蛋白，激活G1細(xì)胞周期基因、細(xì)胞壁生物合成基因和HO基因的轉(zhuǎn)錄；而與MCB結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子MBF(MCB-binding factor)包括Swi6蛋白和Mbp1蛋白，激活DNA合成的一些必須基因的轉(zhuǎn)錄(Ho et al，1999；Koch et al，1993)。Swi6/Cdc10家族蛋白質(zhì)成員中，Swi6、Swi4、Mbp1、Res1/Sct1、Res2/Pct1、Cdc10等都具有ANK序列組成的核心結(jié)構(gòu)域，在參與整個(gè)細(xì)胞周期中的信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用(Xu et al.1996；Lan etal.1997；Steven et al.1998)。MBP1與SWI4在序列上有相似性，其單獨(dú)缺失雖然不能使酵母致死但卻導(dǎo)致DNA合成基因的異常表達(dá)，但同時(shí)缺失MBP1與SWI4基因的菌株則不能存活。而Swi4-Mbp1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控在子囊菌酵母中具有高度保守性，甚至可能是整個(gè)真核生物的普遍特征(Koch et al，1993)。
由梨孢菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是世界性的水稻病害，也是我國水稻的主要病害之一，重病田可導(dǎo)致水稻絕收。該病在我國部分省市幾乎每年都有大發(fā)生，在全國范圍也曾數(shù)次大流行。最近的一次全國大面積流行是1993年。當(dāng)年在全面防治的情況下，稻瘟病仍然導(dǎo)致稻谷減產(chǎn)上百億斤。2004年，重慶和四川等省市暴發(fā)大面積的稻瘟病，僅重慶的合川市就有2萬畝水稻發(fā)生稻瘟病，其中近5000畝水稻絕收，曾作為重要農(nóng)業(yè)問題被報(bào)道。梨孢菌是一種絲狀子囊菌真菌，除水稻之外，還能侵染包括小麥、大麥以及一些草坪草在內(nèi)的50多種禾本科植物，導(dǎo)致瘟病。同時(shí)，該菌具有許多重要作物的病原真菌所共有的侵染過程，包括分生孢子產(chǎn)生與萌發(fā)、附著胞形成、侵入、侵染菌絲的擴(kuò)展。此外，梨孢菌可進(jìn)行遺傳雜交和轉(zhuǎn)化。為此，許多發(fā)達(dá)國家的研究者將梨孢菌作為模式病原真菌，正在全面、深入地開展植物病原真菌致病性和致病型變異的分子機(jī)理研究，期望通過此類研究來尋找真菌特異性靶標(biāo)以設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥。尤其是最近完成的梨孢菌全基因組序列測定，為進(jìn)行病原真菌致病性的功能基因組研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
生物信息學(xué)研究表明梨孢菌(Magnaporthe grisea)基因組中含有ANK基序蛋白的基因大約有51個(gè)，其它植物病原真菌中也有不少含有ANK基序的蛋白，但有關(guān)ANK蛋白基因在絲狀真菌中的功能研究還未見報(bào)道。本發(fā)明通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有一個(gè)ANK蛋白的基因在梨孢菌、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等真菌間比較保守，其蛋白質(zhì)在氨基酸水平上的一致性達(dá)40％以上，該蛋白在本發(fā)明中暫命名為MBP1。為了弄清楚該ANK基因及其編碼蛋白的生物學(xué)功能和作用的分子機(jī)制，尤其是在病原真菌的生長、發(fā)育和致病過程中的作用，本發(fā)明以MgMBP1為例，開展了基因敲除與功能研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MgMBP1的基因敲除導(dǎo)致梨孢菌生長緩慢等多種缺陷，并且致病力顯著減弱。因此，該ANK基序蛋白及其表達(dá)可作為靶標(biāo)，用于新型農(nóng)藥的設(shè)計(jì)和篩選，在植物真菌病害的控制有重要應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在以梨孢菌為研究模式，提供源于梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等植物病原真菌中相對保守的一個(gè)ANK基因及其編碼蛋白的序列、該基因的啟動(dòng)子序列以及該基因在控制菌落生長與致病力中的作用與表達(dá)特征。
本發(fā)明所提供的ANK蛋白在梨孢菌中為MgMBP1，為具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；其序列由796個(gè)氨基酸殘基組成。
2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對真菌菌落生長及致病力有影響的蛋白質(zhì)。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
MgMBP1的編碼基因(MgMBP1)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。MgMBP1是指具有下述核苷酸序列之一的DNA序列1)如序列表中SEQ ID №1所示的基因組DNA序列；其序列特征為由5690個(gè)堿基組成，包括四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子，自5′端第1498位至1553位堿基為第一外顯子，自5′端第1554位至1932位堿基為第一內(nèi)含子，自5′端第1933位至2191位堿基為第二外顯子，自5′端第2192位至2495位堿基為第二內(nèi)含子，自5′端第2496位至2659位堿基為第三外顯子，自5′端第2660位至2794位堿基為第三內(nèi)含子，自5′端第2795位至4674位堿基為第四外顯子；其編碼區(qū)位于SEQ ID №1的5′端第1498位至4674位堿基之間。自SEQ ID №1的5′端第1位至1497位堿基為啟動(dòng)子序列。
2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列，或其經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對真菌菌落生長及致病力有影響的蛋白質(zhì)序列的對應(yīng)多核苷酸序列。
3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同分子與生物學(xué)功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
本發(fā)明所涉及的MgMBP1的cDNA，是指具有下述特征之一核苷酸序列1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；該序列由2391個(gè)堿基組成。
2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)或其經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對真菌菌落生長及致病力有影響的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同分子或生物學(xué)功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
本發(fā)明所涉及的MgMBP1的啟動(dòng)子序列，其特征在于可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；該序列由1318個(gè)堿基組成，其特征在于具有驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的能力。
2)在序列表中SEQ ID №4的基礎(chǔ)上經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)堿基的取代和或缺失和/或添加而衍生的DNA變體序列，其特征在于具有驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的能力。
3)與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列具有80％以上同源性，且具相同功能的DNA序列。
利用MgMBP1基因、cDNA以及啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體、細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的保護(hù)范圍還包括源于灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等植物病原真菌中與MgMBP1同源的蛋白，命名分別為BcMBP1、GmMBP1、GzMBP1、PnMBP1和SsMBP1。其特征在于其與MgMBP1在氨基酸序列上分別具有40％或以上的一致性；其序列分別為SEQ ID №5、SEQ ID №6、SEQ ID №7、SEQ ID №8和SEQ ID №9所示的氨基酸序列。
以MgMBP1基因中任一區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，并通過PCR擴(kuò)增用于檢測在化合物處理狀況下MgMBP1基因的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
以MgMBP1或與其有40％或以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)多肽，并制備抗體用于檢測在化合物處理狀況下MgMBP1蛋白的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所涉及的MgMBP1基因的敲除導(dǎo)致梨孢菌菌落生長緩慢，分生孢子發(fā)芽和附著胞形成緩慢、形成侵染釘和侵染性菌絲的能力減弱，并且在感病水稻品種上的致病力減弱。本發(fā)明最重要的用途是應(yīng)用上述成果，設(shè)計(jì)和篩選能夠破壞該基因表達(dá)、剪切及其編碼蛋白的表達(dá)的化合物；或設(shè)計(jì)和篩選能對MgMBP1的氨基酸序列進(jìn)行修飾或阻斷MgMBP1的核定位的化合物；或設(shè)計(jì)和篩選能阻斷與MgMBP1啟動(dòng)子的核苷酸序列結(jié)合蛋白結(jié)合的化合物；從而開發(fā)新型的抗真菌的藥物。此外，本發(fā)明的用途還包括以MgMBP1啟動(dòng)子的核苷酸序列或MgMBP1基因的DNA或cDNA的某一區(qū)段作為探針在梨孢菌中再分離的DNA序列，或者在其它真菌中分離的、與該基因具有一定序列同源性的序列。
本發(fā)明還涉及源于小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等植物病原真菌的、與梨孢菌MgMBP1在氨基酸序列上具有高于40％一致性的同源蛋白，它們可能與梨孢菌MgMBP1具有相同的生物學(xué)功能。因此，這些同源蛋白及其編碼基因的啟動(dòng)子也可作為靶位點(diǎn)，用于設(shè)計(jì)和篩選抗這些真菌的藥物。
上述利用MgMBP1及其同源蛋白的表達(dá)為靶標(biāo)、開展抗真菌藥劑的篩選和設(shè)計(jì)等用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。


附圖1.源于梨孢菌(Magnaporthe grisea，Mg)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae，Gz)、玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis，Gm)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum，Ss)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea，Bc)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaerianodorum，Pn)的MBP1類蛋白的親緣關(guān)系。
附圖2.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131MgMBP1基因敲除體的構(gòu)建與證明。圖示說明上圖為敲除載體構(gòu)建的示意圖；下圖為敲除體的Southern雜交確認(rèn)圖，左圖為以MgMBP1為探針，右圖為以置換的潮霉素抗性基因?yàn)樘结槨?br> 附圖3.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與MgMBP1基因的敲除體Q877的菌落形態(tài)、菌落生長速度比較。圖示說明上為3-7天的菌落直徑，中菌落生長速率，下為培養(yǎng)7天后的實(shí)物照片。菌落生長所用培養(yǎng)基為燕麥西紅柿培養(yǎng)基，25℃光照培養(yǎng)。最初接種量相同。
附圖4.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與及其MgMBP1基因敲除轉(zhuǎn)化體Q877在洋蔥表皮上分生孢子的萌發(fā)率不同時(shí)間段的比較。圖示說明上照片為接種4hr后的實(shí)物照片，左為野生型，右為敲除體；下為接種后4-36hr孢子萌發(fā)的百分率。
附圖5.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與及其MgMBP1基因敲除轉(zhuǎn)化體Q877在洋蔥表皮上附著胞形成率不同時(shí)間段的比較。圖示說明上為接種10hr后的實(shí)物照片，左為野生型，右為敲除體；下為接種后4-36hr附著胞形成的百分率。
附圖6.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與及其MgMBP1基因敲除轉(zhuǎn)化體Q877在洋蔥表皮上侵染成功率不同時(shí)間段的比較。圖示說明上為接種16hr后的實(shí)物照片，左為野生型，右為敲除體；下為接種后8-36hr侵染釘形成的百分率。
附圖7.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與及其MgMBP1基因敲除轉(zhuǎn)化體Q877在洋蔥表皮上侵染性菌絲生長情況的比較。圖片為接種36hr后的實(shí)物照片，左為野生型，右為敲除體；下圖為具有分枝侵染菌絲的附著胞的百分率。
附圖8.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與及其MgMBP1基因敲除轉(zhuǎn)化體Q877致病力比較。圖示說明上圖為接種水稻和大麥96小時(shí)后的實(shí)物照片，左為接種水稻，右為接種大麥；下圖為接種感病水稻品種麗江新團(tuán)黑谷96小時(shí)后總病斑和擴(kuò)展型病斑數(shù)量與病斑的平均長度和寬度比較。接種采取活體噴霧接種；接種濃度為1.5×104個(gè)孢子/毫升；第4葉期麗江新團(tuán)黑谷幼苗；接種后36小時(shí)黑暗保濕培養(yǎng)，而后見光，25℃。
附圖9.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與MgMBP1基因敲除轉(zhuǎn)化體Q877的五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體C804、C805、C811、C812、C817菌落生長直徑的比較。圖示說明上為在燕麥西紅柿培養(yǎng)基上培養(yǎng)第三天到第七天的菌落直徑；下為培養(yǎng)第五天的實(shí)物照片。
附圖10.梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131與MgMBP1基因敲除轉(zhuǎn)化體Q877的五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體C804、C805、C811、C812、C817的分生孢子萌發(fā)率比較。圖示說明接種洋蔥表皮4-36hr的分生孢子萌發(fā)百分率。
附圖11.野生型菌株P(guān)131與五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體C804、C805、C811、C812、C817附著胞形成率的比較。圖示說明接種洋蔥表皮4-36hr附著胞形成率的百分率。
附圖12.野生型菌株P(guān)131與五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體C804、C805、C811、C812、C817侵染釘形成率的比較。圖示說明接種洋蔥表皮8-36hr侵染釘形成率的百分率。
附圖13.MgMBP1在菌絲、孢子、附著胞、侵染釘及侵染性菌絲中的表達(dá)圖。圖示說明左列為明視場所拍攝，中間列為暗視場藍(lán)光下所拍攝，右列為明暗視場所拍攝照片疊加圖。
具體實(shí)施例方式
為了更好的理解本發(fā)明，以下通過實(shí)施例予以進(jìn)一步地說明，但并非對本發(fā)明的限制。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1植物病原真菌基因組中ANK蛋白MBP1的生物信息學(xué)分析。
首先，對英國Exeter大學(xué)建立的植物病原真菌的EST數(shù)據(jù)庫(http//cogeme.ex.ac.uk/)進(jìn)行檢索、分析，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)編碼含ANK結(jié)構(gòu)域蛋白的EST(序列號(hào)分別為MagUK14180864、MagUK30406229和MagUKCon )。這一結(jié)果說明ANK蛋白是病原真菌中的一類表達(dá)蛋白。因而，分別將這3個(gè)EST與梨孢菌菌株70-15的全基因組序列(http//www.riceblast.org./)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)梨孢菌中含有51個(gè)推定的、功能不同的ANK蛋白。進(jìn)一步，利用小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等重要的病原真菌已有的基因組數(shù)據(jù)，對其中可能存在的ANK蛋白進(jìn)行分析、預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)梨孢菌中一種ANK蛋白在這幾種病原菌中均具有一個(gè)對應(yīng)的、氨基酸序列一致性高于40％的同源蛋白。梨孢菌中該基因編碼的蛋白由796個(gè)氨基酸組成，與酵母的MBP1蛋白在氨基酸序列具有27％的一致性，其中與MBP1的DNA結(jié)合域的一致性達(dá)56％，故將其命名為MgMBP1。MgMBP1在上述其它真菌病原中的同源蛋白則分別命名為GzMBP1、GmMBP1、SsMBP1、BcMBP1和PnMBP1。幾種植物病原真菌中MBP1蛋白的親緣關(guān)系如附圖1所示。
實(shí)施例2基因的敲除1.基因置換轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建?；蛑脫Q載體的構(gòu)建是指將預(yù)測的該基因的兩側(cè)翼序列定向連入一個(gè)載體中，該載體事先已連入一個(gè)新霉素抗性基因，在兩側(cè)翼序列之間連入潮霉素抗性基因(見附圖2中的示意圖)。
2.基因置換載體轉(zhuǎn)化梨孢菌。采用不破壞載體內(nèi)基因的限制性內(nèi)切酶將載體線性化，轉(zhuǎn)化梨孢菌的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法如下(1)，分生孢子的制備。將充分打斷的梨孢菌菌絲均勻地涂布到燕麥片培養(yǎng)基平板上，26℃-28℃培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見新生菌絲長出培養(yǎng)基表面時(shí)，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，單層紗布蓋上于26℃-28℃光照培養(yǎng)48小時(shí)左右，在培養(yǎng)基表面即可見大量的梨孢菌孢子。
(2)，原生質(zhì)體的制備。500毫升三角瓶裝入150毫升CM培養(yǎng)基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，酸水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸鈣0.1％，磷酸二氫鉀0.02％，硫酸鎂0.025％，氯化鈉0.015％)，接入約106個(gè)分生孢子，在26-28℃、100轉(zhuǎn)/分條件下?lián)u培30-32小時(shí)，三層滅菌擦鏡紙過濾收集菌絲體，菌絲體用0.7M氯化鈉溶液洗滌后轉(zhuǎn)移至滅菌的50毫升離心管中，每1克菌絲加入1毫升的酶滲透液(含20毫克/毫升崩潰酶，用0.7M氯化鈉配制)，26-28℃、100轉(zhuǎn)/分條件下酶解3~4小時(shí)后，用0.7M氯化鈉洗滌菌絲體，經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過濾，收集原生質(zhì)體，4,000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mMTris-Cl，pH 7.5，50mM氯化鈣)洗滌原生質(zhì)體一次，然后分別用10毫升STC洗2次，離心沉淀后用STC將原生質(zhì)體濃度調(diào)至0.5~1×108個(gè)/毫升。
(3)，梨孢菌轉(zhuǎn)化將原生質(zhì)體分裝于滅菌的50毫升離心管中，每管150微升，加入等體積的線性化的載體(約2微克)和STC混合液，冰上放置20分鐘，然后逐滴緩慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-pH 7.5，50mM氯化鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4,000轉(zhuǎn)/分、4℃離心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養(yǎng)基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室溫靜置培養(yǎng)12~13小時(shí)后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，加入約12毫升冷卻至50℃左右的SR(LR+1.6％瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12毫升的0.7％上層瓊脂(冷卻至50℃左右，300微克/毫升的潮霉素。28℃培養(yǎng)4~6天，將出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體同時(shí)轉(zhuǎn)至兩種抗性的CM培養(yǎng)基(含350微克/毫升的新霉素和250微克/毫升的潮霉素)上，將在含新霉素培養(yǎng)基上不長而在潮霉素抗性培養(yǎng)基上長的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入燕麥片番茄培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集菌絲提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)一步確定基因置換轉(zhuǎn)化體。通過此篩選，共獲得了7個(gè)敲除體。
實(shí)施例3基因置換轉(zhuǎn)化體表型觀察1.將基因置換轉(zhuǎn)化體單孢分離，將敲除體之一Q877的單孢菌落和野生型菌落用5mm打孔器打下數(shù)個(gè)菌餅接種于番茄燕麥培養(yǎng)基平板上25-26℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第三天到第七天測量菌落直徑，減去5mm原菌餅直徑為真實(shí)擴(kuò)展直徑。第二天的菌落直徑減去前一天的為菌落擴(kuò)展速率。表1為Q877與P131菌落直徑第三天到第七天的差異比較，表2為菌落擴(kuò)展速率比較。
表1、敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131菌落擴(kuò)展直徑差異

注差異顯著性為A和B的兩組之間在5％的顯著范圍內(nèi)差異顯著。
表2、敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131菌落擴(kuò)展速率差異

注差異顯著性為A和B的兩組之間在5％的顯著范圍內(nèi)差異顯著。
2.基因置換轉(zhuǎn)化體在洋蔥內(nèi)表皮上侵染的觀察。將實(shí)施例1所述的分生孢子洗下后用雙層擦鏡紙過濾于50毫升的離心管中，4000轉(zhuǎn)/分室溫離心5分鐘收集孢子，然后懸浮于0.25‰的吐溫20中。調(diào)整分生孢子濃度到每毫升1.5-2×104孢子，均勻地噴霧接種于放置在1.2％固體水瓊脂上的洋蔥內(nèi)表皮上，25-26℃保濕黑暗培養(yǎng)36小時(shí)，而后見光培養(yǎng)。分時(shí)間段調(diào)查計(jì)數(shù)。表3是敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131孢子接種洋蔥內(nèi)表皮各時(shí)間段孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和侵染釘形成率的差異。
注差異顯著性為A和B的兩組之間在5％的顯著范圍內(nèi)差異顯著。此表內(nèi)差異顯著性指36h時(shí)的數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。
3.致病性的測定。采用實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)梨孢菌的分生孢子，孢子洗下后用雙層擦鏡紙過濾于50毫升的離心管中，4000轉(zhuǎn)/分室溫離心5分鐘收集孢子，然后懸浮于0.25‰的吐溫20中。調(diào)整分生孢子濃度到每毫升1.5-2×104孢子，均勻地噴霧接種于四葉一心期水稻幼苗的葉片正面。25-26℃保濕黑暗培養(yǎng)36小時(shí)，而后見光培養(yǎng)。96小時(shí)后調(diào)查病斑。表4為敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131接種水稻葉片病斑數(shù)的差異，表5為敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131接種水稻葉片病斑大小的差異。
表3.敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131孢子接種洋蔥內(nèi)表皮各時(shí)間段孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和侵染釘形成率的差異

表4.敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131接種水稻葉片病斑數(shù)的差異

注差異顯著性為A和B的兩組之間在5％的顯著范圍內(nèi)差異顯著。
表5.敲除體Q877與野生型菌株P(guān)131接種水稻葉片病斑大小的差異

注差異顯著性為A和B的兩組之間在5％的顯著范圍內(nèi)差異顯著。
實(shí)施例4梨孢菌控制菌落生長和致病力基因MgMBP1的克隆。
1.PCR擴(kuò)增。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中序列和軟件分析，得出該基因大概位置和可能外顯子，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連在T載體上。
表6.野生型菌株P(guān)131與五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體c804、c805、c811、c812、c817在番茄燕麥培養(yǎng)基上菌落擴(kuò)展直徑的比較

注差異顯著性為A兩組之間在5％的顯著范圍內(nèi)差異不顯著。
2.選取適合的酶切取上述片段連在互補(bǔ)載體上，該互補(bǔ)載體連有新霉素抗性基因，將此載體線性化轉(zhuǎn)入敲除體中，轉(zhuǎn)化方法如上述實(shí)施例1所述，挑取轉(zhuǎn)化體進(jìn)行菌落生長和致病性實(shí)驗(yàn)，均回復(fù)野生型，證明此擴(kuò)增片段包含了完整的該基因。
表6為野生型菌株P(guān)131與五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體c804、c805、c811、c812、c817在番茄燕麥培養(yǎng)基上菌落擴(kuò)展直徑的比較。表7為野生型菌株P(guān)131與五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體c804、c805、c811、c812、c817孢子接種洋蔥內(nèi)表皮的孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和侵染釘形成率的比較。
3.RT-PCR。收集產(chǎn)孢時(shí)間為24小時(shí)的分生孢子，異硫氰酸胍(GT)法抽取總RNA，用SuperscriptII TM的反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到分生孢子總cDNA的第一條鏈。根據(jù)軟件分析的可能外顯子設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因的cDNA全長。
實(shí)施例5基因的表達(dá)時(shí)期分析1、載體的構(gòu)建。將基因的啟動(dòng)子與GFP基因相連連入帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的載體中。
2、表達(dá)載體轉(zhuǎn)化梨孢菌。按實(shí)施例1中所述轉(zhuǎn)化方法，采用不破壞載體內(nèi)基因的限制性內(nèi)切酶將載體線性化，轉(zhuǎn)化梨孢菌的原生質(zhì)體。挑取具有新霉素抗性的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該基因在菌絲、孢子、附著胞、侵染釘及侵染性菌絲階段都有表達(dá)。
表7野生型菌株P(guān)131與五個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體c804、c805、c811、c812、c817孢子接種洋蔥內(nèi)表皮的孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和侵染釘形成率的比較。

注差異顯著性為A兩組之間在5％的顯著范圍內(nèi)差異不顯著。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一個(gè)新的控制真菌菌落生長與致病力的ANK蛋白及其編碼基因與利用<160>9<210>1<211>5690<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>1gatatcttag taatcctctc gagttaaggt aggtatacta atcggtagtt ataacttctt 60ccatccattt caatcctgtt ctcaggatga ggatggctga aacgaggata aacatcccaa 120gcaagttacc aacgggtagc tggccgtata cattctttga tttgtttggc tgcaaccttg 180catccatcgt aaccattttg gagggatatt ttgcttggcc ctcctgactg acttgcgagt 240tcgcctggta ccaaggccca aagccgcagg atgatcggat tactaccaaa ttcaatccac 300cagatcgatc gcattgtcat caagttgtct gagccgctga ctacattctt ggggcacggt 360caagagaggc atggcatgca tgccacaact aattccatgt ctgccactcc cgagtctcgc 420actgcagcca aatacgggag aactcggact ggacttttgt atcacacggg cggaaagtaa 480acaagactgc gagtggttgc aaaagctaga gcatgggatc tggttggtag aaaagcgtac 540cgtggttcgc tgaaggtatt tatactatac ttctacaaag tgaactagcg acttgttgtc 600ccctgaaatc ggccacctga acgcctcatg acacccgtgt agaatcgtat taagtagcag 660gaaagggaga aaaaaccaca aatgaaagga aataagtcat cgtacagtac aagaccgaac 720catgactgca aatagtgagg attctagtcc cgaggcaaaa aacccagcta tcaaggtcat 780ggggcgcaac tatacatgcc atatttgtct acatgctgcg acggtggtga agttatgggc 840gacccccgag aggacactgg cgagaatcct ggtgacagat cgacccaggc aggaggagac 900gatgacctcc aaagcggtga accaaaagac gcatggtcaa cacgggttgg gcagtcgccg 960gcatgaggca attgtagcgg aggcgtgcgg cacaaagcta atgttccggc cgtgctctac1020agagccgatg ttggtggcgc aaggtccatc gtctcgccac ccaccaggcc gtttgttact1080gatgatgggc cgtcggcggt actatttacc atgccatccg acacctcttc ttccatgata1140gcaacaagct cctccaggtt gtcgtcgagg ttctccgcca aggggcctaa acagttccta1200aggagtcgcc ggtattggtc gatcttctcg cccgtgccga ccatgctgag tgcctcaatg1260tactccgtct ccgccatttg ctgctcgcct aaaagatagc gaagctcgtt ggccaaagcg1320agcctctcct cgatgctgtt ggtgttcccg ttggaatcac cgttcatgct tgcgtccagc1380tcccgctcaa ctaggccttc gacatgaaga cggttcagtg tgcaaacaac tgccttgacc1440tttccggtgg ctgtctcgag ttcaccgtca ataccaaaag cttgctctgg cggcaacagc1500tgcgacccca gctccgcaag cttgtttgtt aaagaggtgt gctcagcttg tgcgttcgac1560aatattcgtg tcgcctcgcg ctcggcttcg tctttgatcg tgaactcgtc ttcgtatgac1620ctggcaagat cgtggaactt ctcaaagacc aaaggtgtaa ttcggttctg cacggtgagg1680gcggcctctg acttgaggct ggctgtcatt ttgttgctgt ggctgttggc cgcgccaatg1740gtcatcgcgc cgacatcacc agccaacgca tcgcgaaagg aaacctgtct tctagccgat1800tcaggtgcaa atggagagga tgatctttgt ggcacagagc gcagcttctt gctggcattg1860
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1 5 10 15Val Pro Val Tyr Glu Cys Asn Val Asn Gly Asn His Val Met Arg Arg20 25 30Arg Ala Asp Asp Trp Ile Asn Ala Thr His Ile Leu Lys Val Ala Asp35 40 45Tyr Asp Lys Pro Ala Arg Thr Arg Ile Leu Glu Arg Glu Val Gln Lys50 55 60Gly Val His Glu Lys Val Gln Gly Gly Tyr Gly Lys Tyr Gln Gly Thr65 70 75 80Trp Ile Pro Leu Glu Glu Gly Arg His Leu Ala Glu Arg Asn Gly Val85 90 95Leu His Lys Met Arg Pro Ile Phe Asp Tyr Val Pro Gly Asp Arg Ser100 105 110Pro Pro Pro Ala Pro Lys His Ala Thr Ala Ala Ser Asn Arg Met Lys115 120 125Pro Pro Arg Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Asn Ser Lys130 135 140Lys Asn Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Gln Ser Phe Val Thr Asn Ala145 150 155 160Ser Gln Gln Ser Gln Val Ser Glu Asp Pro Tyr Glu Ala Ser Gln Thr165 170 175Arg Ser Gln Ile Phe Arg Glu Glu Thr Pro Asp Asn Glu Thr Val Val180 185 190Ser Glu Ser Met Leu Gly Asp His Asp Met Leu Asp Ala Ser Gln Tyr195 200 205Ser Thr Gly Ser Arg Lys Arg Lys Arg Gly Val Asp Gln Met Ser Met210 215 220Leu Asp Gln Gln His Gln Ile Trp Ala Asp Ala Leu Leu Asp Tyr Phe225 230 235 240Met Leu Leu Asp His Glu Ala Ala Cys Ala Trp Pro Glu Pro Pro Pro245 250 255Ser Ile Asn Leu Asp Arg Pro Ile Asp Glu Lys Gly His Ala Ala Met260 265 270His Trp Ala Ala Ala Met Gly Asp Val Gly Val Val Lys Glu Leu Ile275 280 285His Arg Gly Ala Arg Ile Asp Gly Leu Ser Asn Asn Leu Glu Thr Pro290 295 300Leu Met Arg Ala Val Met Phe Thr Asn Asn Phe Asp Lys Glu Thr Met305 310 315 320Pro Ser Met Val Lys Ile Phe Gln Gln Thr Val His Arg Thr Asp Trp
325 330 335Phe Gly Ser Thr Val Phe His His Ile Ala Ala Thr Thr Ser Ser Ser340 345 350Asn Lys Tyr Val Cys Ala Arg Trp Tyr Leu Asp Cys Ile Ile Asn Lys355 360 365Leu Ser Glu Thr Trp Ile Pro Glu Glu Val Thr Arg Leu Leu Asn Ala370 375 380Gln Asp Gln Asn Gly Asp Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Arg Asn Gly385 390 395 400Ala Arg Lys Cys Val Arg Ser Leu Leu Gly Arg Ser Val Ser Val Asp405 410 415Ile Pro Asn Lys Lys Gly Glu Thr Ala Asp Asp Leu Ile Arg Glu Leu420 425 430Asn Gln Arg Arg Arg Met His Gly Arg Thr Arg Gln Ala Ser Ser Ser435 440 445Pro Phe Ala Pro Pro Leu Glu His Arg Leu Asn Gly His Ile Ala Ala450 455 460Leu Asp Gly Gly Pro Leu Leu Pro Val Pro Phe Pro Ser Met Val Ala465 470 475 480Arg Glu Pro Val Gln Tyr Arg Ser Gln Thr Ala Ser His Leu Met Thr485 490 495Lys Val Ala Pro Thr Leu Leu Glu Lys Cys Glu Glu Leu Ala Ala Ala500 505 510Tyr Glu Ser Glu Leu Gln Glu Lys Glu Ala Glu Ser Phe Asp Ala Glu515 520 525Arg Val Val Lys Arg Arg Gln Ala Glu Leu Glu Ala Val Arg Lys Gln530 535 540Val Ala Glu Leu Gln Asn Met Gly Asn Gly Leu His Ile Asp Leu Asn545 550 555 560Asp Asp Glu Ala Asp Gly Gln Gln Glu Glu Glu Leu Arg Met Leu Val565 570 575Glu Glu Ala Glu Ser Leu Leu Glu Ile Glu Gln Lys Ala Glu Leu Arg580 585 590Arg Leu Cys His Asn Thr Pro Gln Pro Asn Lys Thr Asn Ser Pro Val595 600 605Asp Val Ser Glu Lys Leu Arg Leu Ala Leu Leu Leu His Arg Ala Gln610 615 620Leu Glu Arg Arg Glu Leu Val Arg Glu Val Val Gly Asn Leu Ser Val625 630 635 640Ala Gly Met Ser Glu Lys Gln Gly Thr Tyr Lys Lys Leu Ile Ala Lys
645 650 655Ala Leu Gly Glu Arg Glu Glu Asp Val Glu Leu Met Leu Pro Glu Ile660 665 670Leu Gln Glu Leu Glu Glu Ala Glu Thr Gln Glu Arg Ala Glu Gly Leu675 680 685Asp Gly Ser Pro Leu690<210>9<211>610<212>PRT<213>油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)<400>9Met Arg Arg Arg His Asp Asp Trp Ile Asn Ala Thr His Ile Leu Lys1 5 10 15Ala Ala Gly Phe Asp Lys Pro Ala Arg Thr Arg Ile Leu Glu Arg Glu20 25 30Val Gln Lys Glu Glu His Glu Lys Ile Gln Gly Gly Tyr Gly Lys Tyr35 40 45Gln Gly Thr Trp Val Pro Leu Glu Lys Gly Gln Ala Leu Ala Gln Arg50 55 60Asn Asn Ile Tyr Glu Lys Leu Arg Ala Ile Phe Glu Tyr Thr Pro Gly65 70 75 80Glu Leu Ser Pro Pro Pro Ala Pro Lys His Ala Thr Asn Lys Pro Lys85 90 95Val Asp Ser Thr Asn Arg Ile Glu Pro Val Pro Ile Gln Gln Ala Val100 105 110Ile Ala Arg Gln Val Glu Glu Asn Tyr Asp Asn Ile Ser Thr Gln Leu115 120 125Asn Asp Asp Glu Ser Val Ala Asp Asp Val Thr Val Ala Ser Ala Ser130 135 140Tyr Met Ala Glu Asp Asp Arg Phe Asp Met Pro Gln Pro Pro Thr Gly145 150 155 160His Arg Lys Arg Lys Arg Asp Arg Glu Arg Asp Glu Phe Gln Gln Asp165 170 175Asp Pro Val Asp Leu Arg Ala Gln Ala His Leu Met Trp Ala Asp Glu180 185 190Leu Leu Asp Tyr Phe Met Ala Pro Pro Thr Asp Ala Asn Leu Met Asp195 200 205Arg Arg Pro Glu Pro Pro Ile Asn Phe Glu Pro Asp Phe Ile Ile Asp210 215 220
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權(quán)利要求
1.一種控制真菌菌落生長與致病力的真菌蛋白，含有錨蛋白重復(fù)域(ANK重復(fù)域)，與其在氨基酸序列上一致性最高為26％的已知功能蛋白是酵母的MBP1。在酵母中，MBP1控制細(xì)胞周期，不同于本發(fā)明的蛋白的功能。在梨孢菌中，這一新的蛋白命名為MgMBP1。MgMBP1及其同源蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3所示序列。2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且導(dǎo)致真菌菌落生長緩慢、致病力減弱的蛋白質(zhì)。3)與序列表中的SEQ ID №3具有一致性高于40％的病原真菌灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID №5，6，7，8，9。
2.權(quán)利要求1所述的控制真菌菌落生長與致病力的蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述控制真菌菌落生長與致病力蛋白的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列或與其一致性高于40％的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述控制真菌菌落生長與致病力蛋白的基因組基因的編碼區(qū)位于自序列SEQ ID №1的5′端第1017位至4193位堿基之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述控制真菌菌落生長與致病力蛋白的cDNA，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述控制真菌菌落生長與致病力蛋白的cDNA的編碼序列為自SEQ ID №2的5′端第1位至2391位堿基。
7.利用權(quán)利要求1所述的控制真菌菌落生長與致病力蛋白的編碼基因構(gòu)建的表達(dá)載體、細(xì)胞系和宿主菌。
8.控制梨孢菌菌落生長與致病力的MgMBP1基因的啟動(dòng)子，具有自SEQ ID №4的5′端第1位至1318位堿基的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1所述的控制真菌菌落生長與致病力的MBP1蛋白的表達(dá)與修飾作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2所述的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪切作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中的應(yīng)用
11.權(quán)利要求8所述MgMBP1基因的啟動(dòng)子及其結(jié)合蛋白作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求9、10、11所述的抗真菌藥劑為抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaena nodorum)的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一類新的控制真菌生長與致病力的基因與利用，其編碼的蛋白具有錨蛋白重復(fù)模塊。該基因在梨孢菌中簡稱MgMBP1，其全長、cDNA、編碼的蛋白質(zhì)和啟動(dòng)子分別具有序列表中SEQ ID №1、№2、№3和№4的核苷酸或氨基酸序列。該基因在菌絲和侵染各階段表達(dá)，其敲除導(dǎo)致梨孢菌生長與侵染上多種缺陷和對寄主致病力的顯著減弱。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)在灰葡萄孢菌、玉米莖腐菌、小麥赤霉菌、小麥穎枯菌、油菜菌核菌等病原真菌中也存在與MgMBP1一致性高于40％的蛋白，可能具有相同功能。MgMBP1及其同源蛋白的表達(dá)與修飾、基因產(chǎn)物的剪切和啟動(dòng)子的核苷酸序列可作為靶位點(diǎn)，用于設(shè)計(jì)和篩選抗真菌的新型藥劑。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1763086SQ200510117528
公開日2006年4月26日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者彭友良, 馬星霞, 趙文生 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)