本發(fā)明涉及海洋放線菌培養(yǎng)制備化合物領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的喹唑啉酮類化合物的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：海洋包含著巨大的微生物資源，從海洋微生物來源的天然產(chǎn)物作為重要的先導(dǎo)化合物不斷應(yīng)用于臨床治療研究。其中海洋放線菌幾乎負(fù)責(zé)了約一半具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，尤其是抗生素、抗腫瘤劑、和酶免疫抑制劑等，主要的代謝產(chǎn)物是生堿類、大環(huán)內(nèi)脂類、肽類、氨基糖苷類、醚類、酮類、萜類、酯類、醌類等。如salinosporamidea(npi-0052)來源于海洋放線菌salinisporatropicacnb-392，現(xiàn)作為治療惡性腦膠質(zhì)瘤臨床藥物。鏈霉菌n-125來源的吲哚咔唑類生物堿ucn-01已完成淋巴、非小細(xì)胞肺癌的ⅱ期臨床研究，并取得良好效果。經(jīng)過不斷的活性研究發(fā)現(xiàn)，喹唑啉酮類化合物及其衍生物因其結(jié)構(gòu)的可變性和高效廣譜的生物活性，在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，喹唑啉酮主要表現(xiàn)在抗菌、抗腫瘤、抗癌、抗hiv-1和抗結(jié)核等方面，而且還具有安靜、退熱、抗炎、催眠、抗驚厥、抗帕金森氏綜合癥、調(diào)節(jié)心血管和調(diào)節(jié)細(xì)胞及酶的活性功能。并且包含喹唑啉酮結(jié)構(gòu)的化合物也具有很好的生物活性，如：常山堿、色胺酮及駱駝寧堿等。海洋放線菌產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣化，具有最大的潛力產(chǎn)生該類化合物，更好的用于醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域。并且培養(yǎng)條件簡單，易于大規(guī)模培養(yǎng)，且可不斷持續(xù)獲得，對(duì)環(huán)境幾乎沒有任何危害，因此可作為開發(fā)資源用于抗腫瘤活性研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤活性的喹唑啉酮類化合物及其制備方法和應(yīng)用，該式i結(jié)構(gòu)的化合物是微生物代謝產(chǎn)物中結(jié)構(gòu)特征新穎的化合物，本發(fā)明采用大米固體培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵海洋放線菌，最終由發(fā)酵產(chǎn)物分離純化獲得式i結(jié)構(gòu)的化合物。一種喹唑啉酮類化合物，為式i結(jié)構(gòu)：所述的喹唑啉酮類化合物的制備方法，由海洋放線菌固體發(fā)酵產(chǎn)生，經(jīng)分離純化得到，易于操作和實(shí)施。所述的喹唑啉酮類化合物的制備方法，包括以下步驟：1)將海洋放線菌接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，獲得種子液；2)將上述所得的種子液接種于大米固體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)，萃取獲得發(fā)酵產(chǎn)物；3)將上述所得的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化后，獲得式i結(jié)構(gòu)的喹唑啉酮類化合物。步驟1)中，所述的海洋放線菌，具體可采用市售產(chǎn)品，如采用中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心出售的鏈霉菌streptomycessp.cicc11027，訂購網(wǎng)址：http://www.china-cicc.org/。所述的搖床培養(yǎng)的條件為：在26℃～30℃、130rpm～230rpm的搖床中培養(yǎng)2～4天，進(jìn)一步優(yōu)選，在28℃、180rpm的搖床中培養(yǎng)3天。步驟2)中，所述的大米固體培養(yǎng)基，由大米和海水組成，所述的大米的質(zhì)量和海水的體積之比為30g～50g：50ml～70ml，進(jìn)一步優(yōu)選，所述的大米的質(zhì)量和海水的體積之比為40g：60ml，即按大米質(zhì)量40g和海水體積60ml配比后經(jīng)高壓濕熱滅菌所得。所述的靜置培養(yǎng)的條件為：在23℃～33℃下靜置培養(yǎng)100～140天，進(jìn)一步優(yōu)選，在28℃下靜置培養(yǎng)120天。步驟3)中，所述的分離純化包括：由乙酸乙酯等體積浸泡萃取獲得的發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)凝膠柱色譜、制備液相色譜獲得式i結(jié)構(gòu)的化合物。所述的凝膠柱色譜的條件：采用的填料為羥丙基葡聚糖凝膠(lh-20)，采用的洗脫劑為甲醇-水溶液，進(jìn)一步優(yōu)選，采用的洗脫劑為甲醇體積百分?jǐn)?shù)20％-100％的甲醇-水溶液。所述的制備液相色譜的條件：采用的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，采用的流動(dòng)相是甲醇-水的溶液、乙腈-水的溶液。進(jìn)一步優(yōu)選，采用的流動(dòng)相是甲醇體積百分?jǐn)?shù)40％-100％甲醇-水的溶液；乙腈體積百分?jǐn)?shù)20％-60％的乙腈-水的溶液。本發(fā)明采用人前列腺癌細(xì)胞株pc3進(jìn)行活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，本發(fā)明提供式i結(jié)構(gòu)的化合物能很好抑制pc3細(xì)胞的生長，充分說明該類化合物具有癌細(xì)胞殺滅作用，因此可制備獲得作為抗腫瘤藥物。本發(fā)明提供的化合物可用于治療與急、慢性白血病、淋巴癌、乳腺癌、肺癌、pdgf依賴性腫瘤等癌癥，艾滋病，冠心病、糖尿病、老年癡呆癥、畸形性骨炎、腦缺血等疾病的藥物以及抗真菌藥物。所述的式i結(jié)構(gòu)的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，用于治療與激酶有關(guān)的癌癥具有很好的應(yīng)用前景。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中具有抗腫瘤活性的喹唑啉酮類化合物，可用于開發(fā)治療非小細(xì)胞肺癌、胃癌、前列腺癌、pdgf依賴性腫瘤等癌癥藥物以及畸形性骨炎、冠心病等疾病藥物；本發(fā)明首次闡述該化合物由海洋放線菌產(chǎn)生，具有重要的研究價(jià)值。所述的式i結(jié)構(gòu)的化合物可用于研究抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)篩選；本發(fā)明實(shí)驗(yàn)操作簡單，易于擴(kuò)大生產(chǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為式i具有抗腫瘤活性化合物a68-29e的1h-nmr圖譜；圖2為式i具有抗腫瘤活性化合物a68-29e的13c-nmr圖譜；圖3為式i具有抗腫瘤活性化合物a68-29e的hsqc圖譜；圖4為式i具有抗腫瘤活性化合物a68-29e的hmbc圖譜；圖5為式i具有抗腫瘤活性化合物a68-29e的1h-1hcosy圖譜。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一、化合物的發(fā)酵海洋放線菌采用中國普通微生物菌種保藏管理中心出售的鏈霉菌streptomycessp.cicc11027；1)將海洋放線菌接種于500ml錐形瓶中，每瓶含250ml高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃、180rpm的搖床中培養(yǎng)3天，獲得可用于發(fā)酵培養(yǎng)的種子液；2)將步驟1)所得的種子液接種至大米培養(yǎng)基(大米培養(yǎng)基，由以下組分制成：大米質(zhì)量40g；海水60ml，置于500ml錐形瓶后經(jīng)高壓濕熱滅菌所得)，接種體積為12ml，在28℃下靜置培養(yǎng)120天，得到含有本發(fā)明具有抗腫瘤活性的喹唑啉酮類化合物的固體發(fā)酵產(chǎn)物。二、化合物的制備將含有本發(fā)明具有抗腫瘤活性的喹唑啉酮類化合物的固體發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯浸泡萃取3次，溶劑回收濃縮，獲得粗體物。將所得粗體物進(jìn)行凝膠柱色譜(填料為羥丙基葡聚糖凝膠lh-20)，洗脫劑為體積百分?jǐn)?shù)20％-100％的甲醇-水體系梯度洗脫，每1/4柱體積為一個(gè)餾分，tlc分析合并含有目標(biāo)化合物的餾分。對(duì)目標(biāo)組分采用中壓制備色譜分離(sepaxamethystc-18(10μm,30×400mm)色譜柱，檢測波長292nm，填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠)，流動(dòng)相為體積百分?jǐn)?shù)40％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，tlc分析合并含有新化合物的餾分。所得含有新化合物的組分采用高效制備液相色譜分離(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色譜柱，檢測波長292nm，填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠)，采用的流動(dòng)相為體積百分?jǐn)?shù)40％-70％乙腈/水體系以10ml/min梯度洗脫，收集28-30min色譜峰，回收溶劑，得到化合物a68-29e。如圖1至5所示，依據(jù)核磁共振數(shù)據(jù)，其結(jié)構(gòu)如下所示，為式i結(jié)構(gòu)。分子式根據(jù)高分辨質(zhì)譜hr-esi-ms計(jì)算為c17h12n3o2([m+na]+290.0926.,calculated290.0924)，鑒定化合物為6-(indol-10-ylcarbonyl)-quinazolone，簡稱為a68-29e，具體結(jié)構(gòu)如下：化合物的核磁鑒定(1h500mhz,13c125.7mhz)，其結(jié)果如表1所示。表1三、抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)采用磺酰羅丹明b(sulforhodamineb，srb)比色法檢測化合物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞株pc3細(xì)胞的增殖抑制作用。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，配置成5×104個(gè)/ml，以100μl/孔鋪于96孔培養(yǎng)板，co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，取出培養(yǎng)板后于每孔中加入不同濃度的待測樣品，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加藥完成后，置于co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后取出培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl4℃冰箱預(yù)冷的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)10％的三氯醋酸(tca)固定，靜置5分鐘后，再將培養(yǎng)板移至4℃冰箱過夜。倒掉固定液，每孔用去離子水洗滌5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入70μlsrb溶液，室溫25℃放置20分鐘，去上清液，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1％醋酸洗滌5次，空氣干燥。結(jié)合的srb用100μl/孔10mmol/ltris堿液(ph＝10.5)振蕩溶解。置于酶標(biāo)儀中測定各孔光吸收，測定波長為515nm。根據(jù)各孔o(hù)d值計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(od515給藥孔/od515對(duì)照孔)]×100％，根據(jù)各濃度抑制率計(jì)算半數(shù)抑制濃度ic50，其結(jié)果如表2所示。表2化合物ic50(μm)a68-29e>10結(jié)果表明，本發(fā)明提供式i結(jié)構(gòu)的化合物能很好抑制pc3細(xì)胞的生長，充分說明該類化合物具有癌細(xì)胞殺滅作用，因此可制備獲得作為抗腫瘤藥物。當(dāng)前第1頁12