本發(fā)明涉及分子生物學
技術領域：
，尤其是涉及一種用于鑒定山雞椒性別的snp標記及該snp標記的篩選方法。
背景技術：
：山雞椒(litseacubeba(lour.)pers.)，又名山蒼子，木姜子等，屬于樟科(lauracea)木姜子屬(litsealam)落葉灌木或小喬木，是原產于我國的珍貴天然香料植物。其果實、葉、花等組織可蒸提精油，精油中檸檬醛含量高達60-90％，是制造高級化妝品、藥品、食品添加劑、病蟲害防治劑、潤滑油等的重要原料。山雞椒為雌雄異株植物，天然林中雌雄株比例大約為1：0.59～0.75，但是僅有少數(shù)的雄株即可保證充足的花粉供應(1:0.18)。然而在實際種植中，由于山雞椒雌雄株在形態(tài)上差異不大，無法對造林材料進行性別鑒定，導致雌雄株比例不能達到1:0.18，只能在山雞椒生長三年開花后，通過花形態(tài)辨別雌雄株，再去除多余雄株以達到此比例。這種方式造成了巨大的時間延誤和資源浪費，阻礙了山雞椒雌雄株資源的優(yōu)化配置及其合理利用，延長了山雞椒苗木育種周期，降低了苗木結實率及苗木育種者的經濟效益。因此，開發(fā)一種能夠快速有效，并且能夠準確鑒定山雞椒性別的方法尤為重要。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供山雞椒基因組中snp位點在鑒定所述山雞椒性別中的應用，本發(fā)明的第二個目的在于提供一種能夠鑒定山雞椒性別的snp位點的篩選方法，本發(fā)明的第三個目的在于提供一種用于鑒定山雞椒性別的產品，以緩解現(xiàn)有技術中存在的沒有快速有效，并且準確的鑒定山雞椒性別的方法的技術問題。本發(fā)明提供的山雞椒基因組中snp位點在鑒定所述山雞椒性別中的應用，所述snp位點為lcu266763。本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的snp位點的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：步驟(a)：從待測山雞椒中提取基因組dna，構建rad文庫，并進行測序，得到原始數(shù)據(jù)；步驟(b)：對所述原始數(shù)據(jù)進行優(yōu)化篩選，得到rad測序數(shù)據(jù)；步驟(c)：將所述rad測序數(shù)據(jù)進行計數(shù)并獲得每個個體rad-標簽的數(shù)目和深度；步驟(d)：根據(jù)所述rad-標簽的深度進行一次歸類，并根據(jù)所述一次歸類后的差異堿基數(shù)進行二次歸類，對snp標記基因分型，根據(jù)最大似然法確定所述snp位點。進一步地，在所述步驟(a)中，所述基因組dna為從所述待測山雞椒的花蕾中提取。進一步地，在所述步驟(b)中，所述優(yōu)化篩選為去除所述原始數(shù)據(jù)中的接頭序列，過濾小片段序列、rad-tag不明確的序列及測序質量評估低于質量10的序列。進一步地，在所述步驟(d)中，所述一次歸類為將深度超過3且序列完全相同的rad-標簽聚為stack，所述二次歸類為差異堿基數(shù)少于4的所述stack聚為locus。進一步地，所述snp位點滿足以下條件(1)-(5)中的一條或多條：(1)在所述待測山雞椒的樣本中有40％及以上的個體具有該位點；(2)至少有一個所述stack或locus具有該位點；(3)測序深度大于等于3；(4)最小等位基因頻率大于等于0.05；(5)一個位點中有多個snps時隨機選取一個。進一步地，所述snp位點表現(xiàn)為在雄性中出現(xiàn)，在雌性中缺失，或者在雌性中出現(xiàn)，在雄性中缺失。進一步地，所述snp位點為lcu266763。進一步地，所述lcu266763表現(xiàn)為如下(a)和(b)：(a)雌中純合，等位基因核苷酸為g；(b)雄中雜合，等位基因核苷酸為g和a。另外，本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的產品，所述產品包括能夠特異性檢測所述lcu266763的引物對。本發(fā)明提供了山雞椒基因組中snp(singlenucleotidepolymorphisms，單核苷酸多態(tài)性)位點在鑒定所述山雞椒性別中的應用，通過檢測snp位點lcu266763能夠快速準確地鑒定山雞椒的性別。本發(fā)明提供的用于檢測山雞椒性別的snp位點的篩選方法，通過rad(restrictionsiteassociateddna)測序技術對待測山雞椒樣品進行測序分析，尋找到了一個只存在于雄性山雞椒或雌性山雞椒中的功能性snp分子標記，通過該snp標記，實現(xiàn)對山雞椒性別的準確鑒定。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實施例1提供的部分待測山雞椒樣品提取基因組dna電泳結果圖；圖2為本發(fā)明實施例1提供的部分待測山雞椒樣品rad-標簽測序深度分布情況結果圖；圖3本發(fā)明實施例4提供的lcu266763與性別相關性及性別預測的結果圖。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明提供了山雞椒基因組中snp位點在鑒定山雞椒性別中的應用，其中，snp位點為lcu266763。本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的snp位點的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：步驟(a)：從待測山雞椒中提取基因組dna，構建rad文庫，并進行測序，得到原始數(shù)據(jù)；步驟(b)：對所述原始數(shù)據(jù)進行優(yōu)化篩選，得到rad測序數(shù)據(jù)；步驟(c)：將所述rad測序數(shù)據(jù)進行計數(shù)并獲得每個個體rad-標簽的數(shù)目和深度；步驟(d)：根據(jù)所述rad-標簽的深度進行一次歸類，并根據(jù)所述一次歸類后的差異堿基數(shù)進行二次歸類，對snp標記基因分型，根據(jù)最大似然法確定所述snp位點。在本發(fā)明中，在步驟(a)中，山雞椒基因組dna為從待測山雞椒的花蕾中提??；測序為采用illuminape測序技術進行雙尾端測序；在本發(fā)明中，在步驟(b)中，優(yōu)化篩選為去除所述數(shù)據(jù)中的接頭序列，過濾小片段序列、rad-tag不明確的序列及測序質量評估低于質量10的序列。其中，測序質量評估應用slidingwindow(長度為截取后序列長度的15％)。在本發(fā)明中，在步驟(d)中，利用stacks軟件進行snp標記基因分型，將rad-標簽深度超過3的完全相同序列聚為一個stack，將差異堿基數(shù)少于4的stacks聚為一個locus，根據(jù)最大似然法確定snps。在本發(fā)明中，上述snp位點滿足以下條件(1)-(5)中的一條或多條：(1)在待測山雞椒的樣本中有40％及以上的個體具有該位點；(2)至少有一個stack或locus具有該位點；(3)測序深度大于等于3；(4)最小等位基因頻率大于等于0.05；(5)一個位點中有多個snps時隨機選取一個。在本發(fā)明中，snp位點表現(xiàn)為在雄性中出現(xiàn)，在雌性中缺失，或者在雌性中出現(xiàn)，在雄性中缺失。在本發(fā)明中，上述snp位點為lcu266763。其中，lcu266763表現(xiàn)為如下(a)和(b)：(a)雌中純合，等位基因核苷酸為g；(b)雄中雜合，等位基因核苷酸為g和a。另外，本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的產品，包括能夠特異性檢測lcu266763的引物對，其中，lcu266763的上游引物為：5'-atcttctaatccggccgttc-3'(如序列表中seqidno.1所示)；lcu266763的下游引物為：5'-gatcttctaatccggccgtt-3'(如序列表中seqidno.2所示)。在本發(fā)明中，用于鑒定山雞椒性別的產品例如可以為，但不限于試劑盒。本發(fā)明提供了山雞椒基因組中snp位點在鑒定所述山雞椒性別中的應用，通過檢測snp位點lcu266763能夠快速準確地鑒定山雞椒的性別。本發(fā)明提供的用于檢測山雞椒性別的snp位點的篩選方法，通過rad(restrictionsiteassociateddna)測序技術對待測山雞椒樣品進行測序分析，尋找到了一個只存在于雄性山雞椒或雌性山雞椒中的功能性snp分子標記，通過該snp標記，實現(xiàn)對山雞椒性別的準確鑒定。為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內容，現(xiàn)結合具體的實施例詳細介紹如下。實施例1山雞椒rad測序2014年10月于貴州省黔東南自治州黎平縣永從鄉(xiāng)，隨機采集天然分布的11株山雞椒雌株、11株山雞椒雄株花蕾，置于液氮中帶回實驗室，利用dn15植物基因組dna提取試劑盒提取基因組dna(結果如圖1所示)，用于構建rad文庫，并采用illuminape測序技術進行雙尾端測序。22個樣品共獲得261,462,739bp原始數(shù)據(jù)。通過去除原始數(shù)據(jù)中的接頭序列、過濾小片段序列及rad-tag不明確的序列、利用slidingwindow(長度為截取后序列長度的15％)進行測序質量評估，過濾掉低于質量10的序列后，共保留了84.04％的原始數(shù)據(jù)(219,745,695bp)，如表1所示。表1山雞椒rad測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計根據(jù)相同酶切位置rad-標簽測序數(shù)據(jù)之間的序列全同性，將數(shù)據(jù)進行計數(shù)并獲得每個個體rad-標簽的數(shù)目和深度信息，用于評估rad技術對于酶切區(qū)域的富集效果。通過對5’端非酶切位點起始的序列、rad-標簽深度值為1的序列進行過濾后，進一步統(tǒng)計數(shù)目標簽數(shù)目和深度信息，結果如圖2所示。22個樣品共得到30373871個rad-標簽。通過表2與圖1可以看出，樣品的酶切實驗富集效果良好。表2rad-標簽數(shù)據(jù)統(tǒng)計實施例2snp標記基因分型利用stacks軟件進行snp標記基因分型，將標簽深度超過3的完全相同序列聚為一個stack，將差異堿基數(shù)少于4的stacks聚為一個locus，根據(jù)最大似然法確定snps。挑出滿足以下條件的snps：(1)在所有樣本中有40％的個體具有該位點；(2)至少有一個群體具有該位點；(3)stack測序深度必須大于等于3；(4)最小等位基因頻率必須大于等于0.05；(5)一個位點中有多個snps時隨機選取一個。22個樣品共得到80769個snp標記，結果如表3至表8所示。表3基因型數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計表表4基因型數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計表續(xù)表-1poscnt9x10x11x1c2c3c4c133310a|11a|9a|8a|9a|2/g|3a|8-2181515c|13c|8a|5/c|7a|14a|4/c|4a|8-3196112g|8g|5--g|6g|7-4279410g|7g|6g|5-g|9g|8-5485010-c|13t|15c|8c|5t|9-6498113g|13-g|9g|10g|8--7556410c|6-c|7--c|8-8636812t|23--c|8-c|6/t|12c|59655310--c|6/t|3t|6t|5t|19-10951910-a|5/c|3--c|8-c|11111042914g|25--g|8g|5g|13a|6121046910-c|5/t|5t|15t|16t|7--131105415g|11g|6g|10g|6g|7g|7g|5141386714a|18a|6a|14a|4/c|4a|5a|10-151465811g|19-g|10a|4/g|3g|7g|7-161653710---c|13/g|5c|9c|21-172110711g|8-g|5g|6g|9--……………………………………………………表5基因型數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計表續(xù)表-2其中，“pos”是變異位點的位置；“cnt”表示有多少樣本具有該位點；其后是個體基因型：“/”表示該個體在此處為雜合位點，兩側是等位基因堿基型(無“/”則是純合位點)，“|”后面是該堿基的測序深度，“-”為缺失位點。表622個樣品snp信息統(tǒng)計表poscnt1x2x3x4x5x6x7x8x133310---a---a2181515---a--cc3196112-g-----g4279410-g-----g5485010------tt6498113---a/ggg-a/g7556410----cc-c8636812---c/t---c/t9655310c--c/t---c/t10951910c-c-cc--111042914-g-----g121046910---ttt--131105415--g----g141386714----a--a151465811----gg-g161653710----c/g-cc172110711--gggg--……………………………………………表722個樣品snp信息統(tǒng)計表續(xù)表-1表822個樣品snp信息統(tǒng)計表續(xù)表-2poscnt5c6c7c8c9c10c11c133310a-a----2181515-cacca/cc3196112ag-gggg4279410-ga---g5485010c/tt-t---6498113g-g-ggg7556410-c--ctc8636812ctc-ttt9655310t-t---c10951910-cc---c111042914a/ggga/ga/gga/g121046910-tt--t-131105415ggg-gag141386714a-a/caaaa151465811--a/g--gg161653710--cc/g-cc/g172110711--ga--g……………………………………………………實施例3山雞椒性別相關的snps位點篩選對山雞椒雌、雄dna池的rad-標簽進行比對，過濾后得到89個snp位點，表現(xiàn)出雌池(或者雄池)中存在，而在雄池(或者雌池)中缺失，如表9所示。進一步評估這89個標記，篩選出兩個標記可能與性別相關(lcu136163和lcu266763)，其分別在超過5個以上的樣本中表現(xiàn)出雌中純合(g)，雄中雜合(等位基因‘g’和‘a’)。表989個snp信息統(tǒng)計表其中，“/”表示該個體在此處為雜合位點，兩側是等位基因堿基型(無“/”則是純合位點)，“-”為缺失位點。實施例4snps性別關聯(lián)驗證及性別預測2016年1月，于富陽新沙島山雞椒種質資源庫中采集48株山雞椒植株(24株雌株和24株雄株)，利用等位基因特異pcr基因分型方法驗證rad標記lcu136163和lcu266763與性別關聯(lián)性，引物信息見表10。結果顯示，rad標記lcu136163標記未表現(xiàn)出與性別具有相關性，rad標記lcu266763表現(xiàn)出與性別相關性，預示著山雞椒性別決定的遺傳機制是基于雄性雜合性(g/a)。表10引物信息此外，對富陽城市森林公園的36株樣品(實際性別為18株雌株，18株雄株)進行性別預測，以驗證snps位點的正確性。除兩個雌株外，lcu266763能較穩(wěn)定的顯示出山雞椒雌雄間的差異，利用等位基因特異kasp方法進行相關性驗證及預測。讀取每個樣品的fam熒光發(fā)射系數(shù)和calfluororange560熒光系數(shù)，與空白對照進行比較。結果如圖3所示。通過以上實驗結果可以說明，本發(fā)明通過檢測snp位點lcu266763能夠快速準確地鑒定山雞椒的性別。本發(fā)明提供的用于檢測山雞椒性別的snp位點的篩選方法，尋找到了一個只存在于雄性山雞椒或雌性山雞椒中的功能性snp分子標記lcu266763，通過該lcu266763，實現(xiàn)對山雞椒性別的準確鑒定。最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。sequencelisting<110>中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所<120>用于鑒定山雞椒性別的snp標記及該snp標記的篩選方法<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1atcttctaatccggccgttc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gatcttctaatccggccgtt20當前第1頁12