本發(fā)明屬于牛血加工領域，具體涉及一種從牛血中提取超氧化物歧化酶的方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase簡稱sod)是一種新型酶制劑，廣泛存在于動植物、微生物中的金屬酶，sod被視為生命科技中最具神奇魔力的酶，是機體內o2-的天然消除劑，在生物體的免疫系統(tǒng)中起著極為重要的作用。
牛血中營養(yǎng)豐富，蛋白含量高達20％左右，有“液體肉“之稱。牛血可以通過離心分離得到血漿和血球，血漿中主要含有白蛋白，血球中含有血紅蛋白、超氧化物歧化酶(sod)和過氧化氫酶等，其中血紅蛋白占血球總蛋白量的90％以上，sod占0.3％-0.5％。目前，已經有兩種方法提取sod，一種方法使用有機溶劑萃取sod，該方法處理量比較小，生產成本高，無法大規(guī)模生產；另一種方法使用銅鹽沉淀血紅蛋白純化sod，該方法生成的血紅蛋白含有大量的銅離子，無法被再利用，浪費了大量珍貴的蛋白資源，而且這些蛋白排放還會造成環(huán)境污染。
技術實現要素：
本發(fā)明針對現有技術中存在的問題，提供了一種從牛血中提取超氧化物歧化酶的方法。
本發(fā)明采用的技術方案：從牛血中提取超氧化物歧化酶的方法，包括如下步驟：
(1)將牛血進行抗凝處理，離心，沉淀物用生理鹽水洗滌，制得紅細胞，用超聲波破壁處理，加入去離子水，冰浴下靜置后得到溶血液；
(2)向溶血液中加入0-4℃的乙醇溶液，再加入0-4℃的氯仿，然后攪拌、靜置、離心后收集上清液獲得粗酶液；
(3)向粗酶液中加入丙酮，然后攪拌、離心，取沉淀物；
(4)將沉淀物用磷酸鹽緩沖液溶解，攪拌、離心后獲得上清液；
(5)通過透析除去鹽離子，再冷凍干燥，制得成品超氧化物歧化酶。
優(yōu)選，超聲波破壁處理的具體過程為超聲功率為100-200w，超聲5-20min。
優(yōu)選，抗凝劑采用檸檬酸三鈉，其濃度為0.5-2％，其體積是牛血體積的10-20％。
優(yōu)選，磷酸鹽緩沖液為k2hpo4-kh2po4的混合溶液。
優(yōu)選，上述步驟(4)獲得上清液可采用柱層析法進一步提純。
本發(fā)明與現有技術相比達到的有益效果:本發(fā)明采用超聲破壁處理，采用高效分離、提取，生產方法簡單、周期短、污染小，適用于sod的工業(yè)化生產。經檢測，采用本方法提取的牛血sod，其單位酶活可以達到4000u/mg以上。
具體實施方式
實施例1
向牛血中加入20％體積的0.5％檸檬酸三鈉，4000rpm離心10min去血漿，收集紅細胞。然后加入5倍的0.9％nacl溶液進行清洗，期間不斷攪拌后，4000rpm離心20min，棄去上清液后，收集紅細胞，用功率為200w的超聲波破壁處理10min，并加入2倍體積比的去離子水，4℃水浴下靜置12h后得到溶血液；向溶血液中緩慢加入4℃下冷預過的0.25體積的95％乙醇后，再緩慢加入預冷過的0.2體積的氯仿，攪拌30min；靜置1h后，4000rmp離心10min，收集上清液獲得粗酶；向粗酶液中加入3倍體積的丙酮，攪拌20min后，4000rmp離心10min，取沉淀物；將沉淀物用加入2倍體積的去離子水進行溶解，并在60℃溫度下熱處理15min后，迅速冰浴至4℃以下。然后，加入15倍體積的k2hpo4-kh2po4的混合緩沖溶液，攪拌5min后，4000rmp離心10min，獲得上清液。通過透析工藝除去鹽離子，并最終將精致酶液進行冷凍干燥，可以獲得sod成品。
實施例2
向牛血中加入10％體積的2％檸檬酸三鈉，5000rpm離心5min去血漿，收集紅細胞。然后加入5倍的0.9％nacl溶液進行清洗，期間不斷攪拌后，5000rpm離心5min，棄去上清液后，收集紅細胞，用功率為100w的超聲波破壁處理20min，并加入2倍體積比的去離子水，4℃水浴下靜置10h后得到溶血液；向溶血液中緩慢加入4℃下冷預過的0.5體積的95％乙醇后，再緩慢加入預冷過的0.3體積的氯仿，攪拌20min；靜置2h后，5000rmp離心5min，收集上清液獲得粗酶；向粗酶液中加入3倍體積的丙酮，攪拌10min后，5000rmp離心5min，取沉淀物；將沉淀物用加入3倍體積的去離子水進行溶解，并在60℃溫度下熱處理15min后，迅速冰浴至4℃以下。然后，加入20倍體積的k2hpo4-kh2po4的混合緩沖溶液，攪拌5min后，4000rmp離心20min，獲得上清液。上清液可通過柱層析法進一步提純，提純后通過透析工藝除去鹽離子，并最終將精致酶液進行冷凍干燥，可以獲得sod成品。