專利名稱：一種小牛血清去蛋白注射液及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小牛血清去蛋白注射液及其生產(chǎn)方法。
技術(shù)背景以小牛血清為原料經(jīng)過除蛋白后得到的提取物具有改善細(xì)胞代謝的生理作用， 在臨床上廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科疾病的治療。目前所有的小牛血清類產(chǎn)品的研究都認(rèn)為 小分子肽是這類產(chǎn)品的主要有效成份，因此所有的產(chǎn)品提取工藝都將提高小分子肽 含量作為目標(biāo)，在生產(chǎn)工藝中使用酸解、酶解等技術(shù)將大分子蛋白及多肽切成小分 子肽；還有些產(chǎn)品將控制小分子肽含量作為控制有效成分的手段。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種小牛血清去蛋白注射液及其生產(chǎn)方法。 本發(fā)明所提供的小牛血清去蛋白注射液的制備方法，包括如下步驟1) 去除小牛血清中的蛋白，然后進(jìn)行粗濾，收集濾液；2) 對(duì)所述濾液依次用甲苯、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，每次萃取中棄去有 機(jī)相保留水相；3) 對(duì)所述水相采用BI0-GEL-P2凝膠進(jìn)行層析，以純化水為流動(dòng)相，收集280nm 檢測(cè)波長的吸光度曲線上的第二吸收峰，得到小牛血清去蛋白注射液。所述制備方法中還包括將所得到的小牛血清去蛋白注射液進(jìn)行病毒滅活的步 驟。增加病毒滅活步驟可殺滅非脂包膜病毒和脂包膜病毒，保證產(chǎn)品的生物安全性。 所述病毒滅活條件為6(TC水浴中保存10小時(shí)。上述步驟2)中，加入的甲苯、乙酸乙酯和正丁醇的體積均大于等于所述濾液 的體積。當(dāng)所述BIO-GEL-P2凝膠層析中柱床高度為120—140 cm,柱的直徑為4-5 cm，所述純化水的洗脫流速為40ml/h。由所述的制備方法制備的小牛血清去蛋白注射液也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述方法制備的小牛血清去蛋白注射液的活性成分為多糖，所述多糖的含量為 1.0-1.2mg/ml，優(yōu)選為1. 17mg/ml。除所述多糖外，所述注射液中還含有小分子肽 類物質(zhì)；所述小分子肽類物質(zhì)含量為小于等于0.05 mg/ml，優(yōu)選為0. 04rag/ml。本發(fā)明所述的小牛血清去蛋白注射液可用于治療如下疾病a)腦缺血缺氧性疾??；b)營養(yǎng)障礙性疾病所引起的神經(jīng)功能缺損(缺血性損害、顱腦外傷)； C)末梢動(dòng)脈循環(huán)障礙及其引起的動(dòng)脈血管病；d) 靜脈循環(huán)障礙及其引起的動(dòng)脈血管病；e) 皮膚燒傷、燙傷、糜爛(創(chuàng)傷、褥瘡)；放射所致的皮膚、粘膜損傷； e)老年癡呆；本發(fā)明所述的小牛血清去蛋白注射液還可促進(jìn)傷口愈合，可在皮膚移植術(shù)中應(yīng)用。對(duì)不同患者可依據(jù)不同病情給予有效治療量的小牛血清去蛋白注射液，如每日 3次，每次10ml靜脈滴注。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)存在于小牛血清中的天然多糖的生物活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小分子肽。它 改變了以往對(duì)小牛血清類產(chǎn)品的認(rèn)識(shí)，證明了多糖的生物活性比小分子肽更強(qiáng)，而 且二者存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此，本發(fā)明改進(jìn)了制備小牛血清去蛋白注射液的方法， 改變了傳統(tǒng)的提取方法把增加小分子肽作為目標(biāo)的技術(shù)方向，通過萃取和層析步 驟，使多糖成為所制備的產(chǎn)品的主要有效成分。這種制備方法，通過萃取去除了低 極性的酯類等雜質(zhì)，提高純度；通過層析去除了高極性的肽類雜質(zhì)，解除其對(duì)于多 糖活性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使產(chǎn)品生物活性進(jìn)一步提高，療效更好。本發(fā)明產(chǎn)品的主要 有效成分是多糖，除多糖外小分子肽類物質(zhì)的含量極低，因此，不容易發(fā)生聚合反 應(yīng)，增加了產(chǎn)品的穩(wěn)定，同時(shí)減少了小分子肽類物質(zhì)的含量，使發(fā)生過敏反應(yīng)的幾 率大大降低，產(chǎn)品更加安全；并且產(chǎn)品的呼吸活性指數(shù)由3. 0左右提高到7. 0以上， 產(chǎn)品療效進(jìn)一步提高。本發(fā)明所述的小牛血清去蛋白注射液可在腦部缺血性損害， 動(dòng)脈血管病，燒傷等疾病的治療中應(yīng)用。


圖l為吸光度曲線圖2為小牛血清去蛋白注射液的高效液相色譜圖具體實(shí)施方式
本發(fā)明的小牛血清去蛋白注射液的生產(chǎn)方法如下除蛋白按照乙醇和血清比例為2: 1的量向血清中加入96%的乙醇，離心(4000轉(zhuǎn)/分，IO分鐘)后留上清棄沉淀。利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37°C， l個(gè)大氣壓減壓 除乙醇，蒸發(fā)至血清體積的60%。粗濾用截留分子量100000D的中空纖維柱粗濾，收集濾液。萃取依次加入甲苯、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每次都是除掉有機(jī)溶劑保留水 溶液。層析將萃取所得溶液濃縮至初始血清體積的1/10，用BIO-GEL-P2凝膠層析分離。上述BI0-GEL-P2凝膠層析的收集液，即為小牛血清去蛋白提取液。 病毒滅活上述提取液在6(TC水浴中保存10小時(shí)，殺滅病毒。 小牛血清去蛋白提取液經(jīng)病毒滅活后，再經(jīng)過0. 2微米孔徑的微孔濾膜過濾， 無菌操作分裝至清洗干凈的5ml安瓿中，充氮封口，即得小牛血清去蛋白注射液。 下面通過實(shí)施例具體闡明本發(fā)明的技術(shù)方案。 實(shí)施例l、生產(chǎn)小牛血清去蛋白注射液 a)生產(chǎn)小牛血清去蛋白注射液(1) 除蛋白取小牛血清1000ml (購于內(nèi)蒙科左中旗錦康牛制品開發(fā)有限公 司)，加入2000ml 96。/。的乙醇，混勻后，靜置30分鐘；離心(4000轉(zhuǎn)/分，10分 鐘)后留上清，棄沉淀；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37°C， l個(gè)大氣壓減壓蒸餾除乙醇， 蒸餾濃縮到體積600ml 。(2) 粗濾用截留分子量100000D的中空纖維柱粗濾，收集濾液；得到濾液 500ml。(3) 萃取依次加入甲苯、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，三種有機(jī)溶劑加入 量均為500ml，每次萃取充分混勻后靜置20分鐘等待混合液分層，然后用分液漏斗分離，每次都是除掉有機(jī)溶劑保留水溶液。(4) 層析將萃取所得溶液在37'C， l個(gè)大氣壓減壓蒸餾濃縮至100ml備用； 用BIO-GEL-P2凝膠層析分離(按照凝膠說明書將膠處理好，灌柱平衡)，層析柱 長150 cm，直徑4. 5 cm，膠床高度124 cm;將上述濃縮液100ml加到膠床上，待其 完全滲到膠面以下，連接流動(dòng)相；以純化水作為流動(dòng)相，流速40ml/h;用自動(dòng)餾分 收集器收集層析液，20inl/管，通過紫外分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)層析液吸光度，檢測(cè)波長 為280nm;所得吸光度曲線如圖1所示。完全收集吸光度曲線上的第二吸收峰(F2) 10管，收集液200ral。圖1中，點(diǎn)號(hào)表示收集洗脫液的試管。(5) 病毒滅活上述收集液在60。C水浴中保存10小時(shí)，即得小牛血清去蛋白 提取液。小牛血清去蛋白提取液再經(jīng)過0. 2微米孔徑的微孔濾膜過濾，無菌操作分裝至清洗干凈的5ml安瓿中，充氮封口，即得小牛血清去蛋白注射液。取上述小牛血清去蛋白注射液作為供試品溶液上樣100 W，按照高效液相色譜 法(《中國藥典》2005年版二部附錄VD),采用凝膠色譜柱(如TSK-G2000sw柱)； 流動(dòng)相為pH7. 0的0. 1 mol/L磷酸鹽進(jìn)行高效液相色譜分析；用示差檢測(cè)器檢測(cè)， 記錄色譜圖，記錄保留時(shí)間至第一主峰保留時(shí)間的2倍。以蔗糖色譜峰計(jì)算理論塔 板數(shù)應(yīng)不低于1000。按照面積歸一法計(jì)算，主峰面積應(yīng)占93.0%以上。色譜圖如圖 2所示，主峰面積占總面積的95%，說明所得產(chǎn)品中主糖相對(duì)于總糖的純度為95%。b) 小牛血清去蛋白注射液的生物活性指標(biāo)的分析選取IO瓶小牛血清去蛋白注射液通過測(cè)定小分子肽含量、多糖含量和呼吸活 性指標(biāo)分析小牛血清去蛋白注射液生物活性指標(biāo)。小分子肽含量測(cè)定采用lowry測(cè) 蛋白法檢測(cè)；多糖含量測(cè)定采用苯酚一硫酸比色法檢測(cè)；呼吸活性檢測(cè)按照如下文 獻(xiàn)方法進(jìn)行，于洪儒、肖建英，促細(xì)胞代謝素注射液生物活性的實(shí)驗(yàn)研究，《中國 新藥雜志》2000年第2期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的小牛血清去蛋白注射液小分子肽含量為1. 17±0. 02、 多糖含量為0. 043±0. 006及呼吸活性為7. 2±0. 02。c) 小牛血清去蛋白注射液的穩(wěn)定性取本發(fā)明的小牛血清去蛋白注射液10支，置于人工氣候箱內(nèi)，在溫度為5(TC ±2°C，相對(duì)濕度為75%±5%的環(huán)境中放置3個(gè)月，分別于第l個(gè)月、2個(gè)月、3 個(gè)月取樣一次，檢測(cè)性狀、澄明度、呼吸活性指標(biāo)，檢測(cè)結(jié)果與0月比較。性狀用 肉眼觀察，呼吸活性檢測(cè)按照實(shí)施例2中所述文獻(xiàn)的方法，澄明度按照《中國藥典》 2005版2部的方法檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明在5(TC士2X:，相對(duì)濕度為75%±5%的環(huán)境中放置3個(gè)月，本發(fā) 明的小牛血清去蛋白注射液仍然很穩(wěn)定性，呼吸活性為7.2士0.03 (0月時(shí)，呼吸 活性為7.2士0.02)。d) 病毒滅活有效性測(cè)定本發(fā)明生產(chǎn)的小牛血清去蛋白注射液，在病毒滅活前向其中加入腦心肌炎病毒 (EMCV)和牛腹灣病毒(BVDV)為指示病毒，然后經(jīng)過6(TC水浴中保存10小時(shí)，通過病毒對(duì)照培養(yǎng)，結(jié)果顯示，本發(fā)明的病毒滅活方法可以使腦心肌炎病毒滴度下 降^5.00LgTCID5。/0. lml;可以使牛腹瀉病毒滴度下降》4. OOLgTCIDso/O. lml。因此，本發(fā)明的病毒滅活工藝能夠有效滅活非脂包膜病毒和脂包膜病毒，能保證產(chǎn)品的安全性。對(duì)比例、小牛血清去蛋白注射液的生產(chǎn) a)生產(chǎn)小牛血清去蛋白注射液(1) 除蛋白取小牛血清1000ml (購于內(nèi)蒙科左中旗錦康牛制品開發(fā)有限公 司)，加入2000ml 96%的乙醇，混勻后，靜置30分鐘；離心(4000轉(zhuǎn)/分，10分 鐘)后留上清，棄沉淀；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37°C， 1個(gè)大氣壓減壓蒸餾除乙醇， 蒸餾濃縮到體積600ml 。(2) 粗濾用截留分子量100000D的中空纖維柱粗濾，收集濾液；得到濾液 500ml。(3) 層析將粗濾所得濾液在37。C， l個(gè)大氣壓減壓蒸餾濃縮至100ml備用； 用BI0-GEL-P2凝膠層析分離(按照凝膠說明書將膠處理好，灌柱平衡)，層析柱 長150cm，直徑4.5cm,膠床高度124cm;將上述濃縮液100ml加到膠床上，待其 完全滲到膠面以下，連接流動(dòng)相；以純化水作為流動(dòng)相，流速40ml/h;用自動(dòng)餾分 收集器收集層析液，20ml/管，通過紫外分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)層析液吸光度，檢測(cè)波長 為280nm;完全收集吸光度曲線上的第二吸收峰(F2) 10管，收集液200ml。(4) 病毒滅活上述收集液在6(TC水浴中保存10小時(shí)，即得小牛血清去蛋白 提取液。小牛血清去蛋白提取液再經(jīng)過0. 2微米孔徑的微孔濾膜過濾，無菌操作分裝至 清洗干凈的5ml安瓿中，充氮封口，即得小牛血清去蛋白注射液。 實(shí)施例2、本發(fā)明的小牛血清去蛋白注射液的療效 選擇小白鼠常壓耐缺氧能力影響實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)本發(fā)明產(chǎn)品的療效。 一、實(shí)驗(yàn)材料1、 實(shí)驗(yàn)藥品實(shí)施例l生產(chǎn)的小牛血清去蛋白注射液和對(duì)比例生產(chǎn)的小牛血 清去蛋白注射液。2、 動(dòng)物昆明種一級(jí)小白鼠(購于遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重18 22g， 雌雄各半。3、 堿石灰及250ml廣口瓶。 二、實(shí)驗(yàn)方法1、動(dòng)物分組選擇健康的昆明種一級(jí)小白鼠60只，體重18 22g，雌雄各半， 分成三組，即實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組，每組20只。2、 實(shí)驗(yàn)方法I、 II、 III三組分別為實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組，每只小鼠一天給藥一次，給藥方式為尾靜脈注射，每次O. lml。實(shí)驗(yàn)組用實(shí)施例l生產(chǎn)的小牛血清去蛋白注射液給藥；陽性對(duì)照組用對(duì)比例生產(chǎn)的注射液給藥；空白對(duì)照組以注射用水配制的生理鹽水給藥。3、 各組小白鼠連續(xù)給藥11天，于末次給藥后30分鐘將所有小白鼠放入裝有 10g堿石灰的250ml廣口瓶中，密閉常壓缺氧，觀察小白鼠存活時(shí)間，小白鼠死亡 后測(cè)定腦組織中葡萄糖和乳酸的含量；腦乳酸和葡萄糖含量測(cè)定按照如下文獻(xiàn)所述 方法進(jìn)行毛捷、陳勁草，GM1對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的乳酸及葡萄糖含量的影 響，《安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2004年39巻6期。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果常壓缺氧小白鼠存活時(shí)間測(cè)定結(jié)果見表1;常壓缺氧小白鼠腦乳酸含量測(cè)定結(jié) 果見表2;常壓缺氧小白鼠腦葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果見表3。表l、 2和3中的數(shù)據(jù)為 平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。表1.常壓缺氧小'白鼠存活時(shí)間組別例數(shù)給藥途徑給藥量存活時(shí)間(min)I20靜脈注射0. lml53. 63±7. 03*AII20靜脈注射0. lml44. 44±8. 82*III20靜脈注射0. lml35. 65±5. 61表i中*表示同111組比較尸<0.01 ; A表示同n組比較尸〈0.01。表1表明，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組小白鼠存活時(shí)間均明顯長于空白對(duì)照組；而實(shí)驗(yàn)組小白鼠存活時(shí)間又明顯長于陽性對(duì)照組。表2.常壓缺氧小白鼠腦乳酸含量組別例數(shù)給藥途徑給藥量腦乳酸含量 (mmo1/g. wet. wt)I20靜脈注射0. lml9. 68±0. 61*AII20靜脈注射0. lml11. 3±0. 80*III20靜脈注射0. lml12. 36±0. 85表2中*表示同111組比較尸<0.01 ; A表示同II組比較尸〈0.01。表2表明，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組小白鼠腦乳酸含量明顯低于空白對(duì)照組；而實(shí)驗(yàn)組小白鼠腦乳酸含量明顯低于陽性對(duì)照組。表3.常壓缺氧小白鼠腦葡萄糖含量組別例數(shù)給藥途徑給藥量腦葡萄糖含量 (mmol/g. wet. wt)I20靜脈注射0. lml5. 65 ±0. 72*AII20靜脈注射0. lml4. 65±0. 6CTIII20靜脈注射0. lml3. 74±0. 18表3中*表示同111組比較尸<0. 01 ; A表示同II組比較尸〈0. 01。表3表明，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組小白鼠腦葡萄糖含量明顯高于空白對(duì)照組，實(shí) 驗(yàn)組小白鼠腦葡萄糖含量又明顯高于陽性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1生產(chǎn)的小牛血清去蛋白注射液能夠明顯延長常壓缺氧 小白鼠的存活時(shí)間，而且能夠提高常壓缺氧小白鼠腦葡萄糖含量并能降低腦乳酸含 量，說明實(shí)施例l生產(chǎn)的小牛血清去蛋白注射液能夠促進(jìn)葡萄糖的吸收和代謝，對(duì) 抗腦缺氧，抑制無氧代謝。因此實(shí)施例l生產(chǎn)的小牛血清去蛋白注射液對(duì)腦缺血缺 氧性疾病具有確切的治療作用，并且實(shí)施例1生產(chǎn)的小牛血清去蛋白注射液的穩(wěn)定 性優(yōu)于用其他方法獲得的小牛血清類產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1. 一種小牛血清去蛋白注射液的制備方法，包括如下步驟1)去除小牛血清中的蛋白，然后進(jìn)行粗濾，收集濾液；2)對(duì)所述濾液依次用甲苯、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，每次萃取中棄去有機(jī)相保留水相；3)對(duì)所述水相采用BIO-GEL-P2凝膠進(jìn)行層析，以純化水為流動(dòng)相，收集280nm檢測(cè)波長的吸光度曲線上的第二吸收峰，得到小牛血清去蛋白注射液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述制備方法中還包括將所得到 的小牛血清去蛋白注射液進(jìn)行病毒滅活的步驟。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述病毒滅活為6(TC水浴中保存 10小時(shí)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，加入的 甲苯、乙酸乙酯和正丁醇的體積均大于等于所述濾液的體積。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述BI0-GEL-P2凝膠層 析中柱床高度為120-140 cm，柱的直徑為4-5 cm;所述純化水的洗脫流速為40ml/h。
6、 由權(quán)利要求1至5任一所述的制備方法制備的小牛血清去蛋白注射液。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的小牛血清去蛋白注射液，其特征在于所述小牛血清 去蛋白注射液的活性成分為多糖，所述多糖的含量為1.0-1.2mg/ml，優(yōu)選為1.17mg/ml。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的小牛血清去蛋白注射液，其特征在于所述注射液中 還含有小分子肽類物質(zhì)；所述小分子肽類物質(zhì)含量為小于等于0.05 mg/ml，優(yōu)選為 0.04mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小牛血清去蛋白注射液及其生產(chǎn)方法。該注射液是按照如下方法制備的1)去除小牛血清中的蛋白，然后進(jìn)行粗濾，收集濾液；2)對(duì)所述濾液依次用甲苯、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，每次萃取中棄去有機(jī)相保留水相；3)對(duì)所述水相采用BIO-GEL-P2凝膠進(jìn)行層析，得到小牛血清去蛋白注射液。所述小牛血清去蛋白注射液的活性成分為多糖，所述多糖的含量為1.0-1.2mg/ml，優(yōu)選為1.17mg/ml。
文檔編號(hào)A61P17/00GK101264104SQ20081009448
公開日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2008年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月4日
發(fā)明者于洪儒, 修元澎, 菁 楊, 王洪新 申請(qǐng)人:遼寧睿來醫(yī)藥科技有限公司