專利名稱：矽肺人群血清蛋白指紋的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及矽肺人群血清蛋白指紋的構(gòu)建，使用該指紋可以實(shí)現(xiàn)對矽肺人群分類的高特異性與高敏感性，對矽肺患者早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供有益的幫助。
背景技術(shù)：
矽肺是吸入二氧化硅粉塵所致的以肺間質(zhì)纖維化為主的全身性疾病。衛(wèi)生部公布的2004年度我國職業(yè)病統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，全國累計(jì)塵肺病例數(shù)58萬人，可疑塵肺病例60多萬，新發(fā)塵肺病人目前仍以每年1.5萬至2萬例的速度增長。矽肺患者占了塵肺病例的近80％。塵肺病每年對國家造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約90億元人民幣，間接經(jīng)濟(jì)損失無法估算?？刂谱鳂I(yè)現(xiàn)場的粉塵濃度，是預(yù)防矽肺的最根本途徑。然而，由于客觀條件的種種限制，矽肺的發(fā)病率依然居高不下，所以對高危人群實(shí)施早期健康監(jiān)護(hù)就顯得尤為重要。尋找矽肺早期診斷(篩檢)的生物標(biāo)志物，并建立矽肺早期方便、快捷的、靈敏度、特異性俱佳的診斷(篩檢)模式，早期發(fā)現(xiàn)疑似病人，早治療，降低矽肺發(fā)病率，實(shí)現(xiàn)WHO提出的2030年全球消除矽肺目標(biāo)，有重大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。根據(jù)我國2002年頒布的塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)-《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)GBZ70-2002》，對矽肺診斷主要是依據(jù)職業(yè)暴露史和影像學(xué)檢查，影像學(xué)診斷勢必要遲于生化和組織活檢，但是組織活檢的侵入性操作使其很難在臨床真正得到推廣應(yīng)用，病人一經(jīng)診斷，纖維化多不可逆轉(zhuǎn)。運(yùn)用這些技術(shù)與方法，發(fā)現(xiàn)矽肺和可疑矽肺患者時(shí)，其肺組織纖維化病變已無法逆轉(zhuǎn)、也無藥物可以治療。許多學(xué)者從現(xiàn)有的矽肺發(fā)病機(jī)制或肺臟器特異產(chǎn)生的物質(zhì)出發(fā)尋找矽肺早期診斷生物標(biāo)志物，多為反應(yīng)氧/氮物質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn)與降解途徑相關(guān)物質(zhì)、肺表面活性蛋白等，盡管結(jié)果均有顯著性意義，但是不同類型的肺間質(zhì)病之間這些指標(biāo)重疊較大，作為生物標(biāo)記物尚不能較好的用于診斷和鑒別診斷。許多學(xué)者從現(xiàn)有的矽肺發(fā)病機(jī)制或肺臟器特異產(chǎn)生的物質(zhì)出發(fā)尋找用于矽肺早期診斷的生物標(biāo)志物，多為反應(yīng)氧/氮物質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn)與降解途徑相關(guān)物質(zhì)、肺表面活性蛋白等。盡管生物標(biāo)志物的結(jié)果均有顯著性意義，但是不同類型的肺間質(zhì)病之間這些指標(biāo)重疊較大，作為生物標(biāo)記物尚不能較好的用于診斷和鑒別診斷。
表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhance laserdesorption ionization time-of-fly mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)是將不同生物屬性(如疏水或金屬鰲合材料)芯片的預(yù)分離純化與高檢測靈敏度質(zhì)譜相結(jié)合的技術(shù)，其檢測材料來源廣泛，檢測前被測材料不需特殊處理，標(biāo)本加樣量極微(數(shù)微升，蛋白質(zhì)含量以fmole計(jì)算)，具有技術(shù)操作較簡便，可多樣本測定，檢測快捷等優(yōu)點(diǎn)。SELDI-TOF-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對低豐度、低分子量蛋白的有效檢測，而這些蛋白也恰恰是能展示疾病特異性的物質(zhì)。大量文獻(xiàn)報(bào)道了以蛋白指紋對感染性疾病、腫瘤、老年性癡呆等疾病診斷的優(yōu)異特異性與敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建人群的矽肺血清蛋白指紋，采用SELDI-TOF-MS技術(shù)獲取正常人群、接塵工人(矽肺0期)、可疑矽肺(矽肺0+期)和矽肺I期人群在CMI0芯片(弱陽離子芯片，Ciphergen Biosystem，USA)上的血清蛋白指紋圖譜，篩選出差異蛋白或多肽分子峰，以生物信息學(xué)軟件建立各期矽肺人群的分類樹狀圖，達(dá)到正常人群與矽塵暴露人群的區(qū)分、以及接塵工人(0期)、可疑矽肺(0+期)人群和矽肺I期人群之間的區(qū)分，進(jìn)而有益于矽肺早診斷、早防護(hù)、早治療。
本發(fā)明的矽肺人群血清蛋白指紋的構(gòu)建方法由以下步驟組成1、抽取正常對照人群組、接塵工人組(矽肺0期)、可疑矽肺組(矽肺0+期)和矽肺I期人群組的清晨空腹靜脈血液樣本，分別分離血清并分裝冷藏。
2、各組血清樣本分別加于CM10芯片(弱陽離子屬性)上，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白或多肽群的富集純化與雜蛋白的洗脫。
3、添加芥子酸能量吸收分子，以蛋白芯片閱讀儀掃描芯片，獲取各組實(shí)驗(yàn)人群的血清蛋白圖譜。
4、用生物信息學(xué)軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，篩選出差異蛋白或多肽峰，建立矽肺人群的血清蛋白分類和分期樹狀圖。
5、采用盲法以另外一批各期矽肺和正常人群的血液樣本對已經(jīng)建立的分類樹圖的特異性、敏感性進(jìn)行修正、驗(yàn)證。
本發(fā)明依據(jù)以下基本原理當(dāng)機(jī)體染矽塵后，肺泡巨噬細(xì)胞被激活，釋放細(xì)胞因子，趨化炎性細(xì)胞進(jìn)入肺泡，一些蛋白酶類物質(zhì)和毒性氧釋放，廣泛損傷肺實(shí)質(zhì)。同時(shí)，成纖維細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。矽塵暴露后所致宿主器官微環(huán)境的改變被一組低分子量的血清蛋白所反映，并被SELDI-TOF-MS質(zhì)譜所檢測，進(jìn)而以圖譜形式展現(xiàn)的特征蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的集合-即蛋白指紋。
本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明根據(jù)國家塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)選取無異常影像學(xué)表現(xiàn)的矽塵暴露環(huán)境下作業(yè)工人、矽肺0+期和矽肺I期患者作為研究對象，另選無矽塵暴露史的健康人做對照、采用SELDI-TOF-MS技術(shù)以CM10芯片(弱陽離子屬性)檢測各組人群的血清蛋白指紋，采用生物信息學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，找出與正常對照表現(xiàn)差異的蛋白或多肽峰，建立矽肺的血清蛋白指紋或診斷分類樹圖。以分子量為4183.65Da、6124.64Da和2745.72Da的蛋白或多肽所建立的血清蛋白指紋分類樹狀圖，對正常對照人群與矽肺人群之間區(qū)分的敏感性為100％，特異性為95％；以分子量為2745.72Da、4183.66Da、M/Z11723.7Da、15941.7Da、5487.28Da、2964.77Da、5071.15Da的蛋白或多肽為預(yù)測變量建立的矽肺分期的蛋白指紋分類樹狀圖，對正常對照、接塵工人、矽肺0+期和矽肺I期的正確分類率分別達(dá)100％、90％、85％和95％。
本發(fā)明首次利用表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)篩選到矽肺人群顯著差異峰，并用這些差異峰建立了矽肺人群的血清蛋白指紋分類和分期樹圖，取得分類與分期的優(yōu)異特異性和敏感性，明顯優(yōu)于單一指標(biāo)和現(xiàn)存的其它生物標(biāo)志物。所建血清蛋白分類樹圖較為穩(wěn)定，有益于矽肺的早發(fā)現(xiàn)，便于早治療、早防護(hù)。


附圖1血清蛋白指紋分類樹狀圖之一。
圖中各蛋白或多肽峰的分子量a2745.7 Da、b3711.73 Da、c為2954.78Da、d為3401.03 Da。
附圖2血清蛋白指紋分類樹狀圖之二。
圖中各蛋白或多肽峰的分子量e為5933.65Da、f為4183.66Da、g為5487.28Da、h為6124.64 Da、i為5915.14 Da。
附圖3與附圖1相對應(yīng)的分子差異峰圖譜。
附圖4與附圖2相對應(yīng)的分子差異峰圖譜。
附圖5正常對照-矽塵暴露人群分類樹圖。
附圖6各期矽肺暴露人群和正常對照人群作分期判斷樹圖具體實(shí)施方式
下面以具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例一.研究對象與分組方法1研究對象與分組。
嚴(yán)格按照國家塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)(GBZ70-2002)選擇矽塵作業(yè)工人人群(0期)、可疑矽肺(0+期)、矽肺I期人群，每組120人，均為男性，年齡41.3-66歲，檢查血壓、心電圖、血常規(guī)、肝功能和肺功能等，排除罹患心血管、肝臟等器質(zhì)性病變以及患有肺部其它疾病者，以問卷調(diào)查表形式逐一認(rèn)真登錄有關(guān)流行病學(xué)資料，統(tǒng)一攝高千伏X射線后前位胸片(120-150KV、100mA、0.03-0.05s)。另選擇年齡匹配、不接觸矽塵的健康男性120人作為正常對照組人群。
2材料與儀器尿素、乙腈、三氟乙酸、蛋白酶抑制劑、Hepers、芥子酸(Sinapinic acid，SPA)、CHAPS、醋酸鈉(NaAC)、Tris-HCl、二硫蘇糖醇(DTT)等均購自美國Sigma公司。CM10(弱陽離子)芯片和生物處理器(Bioprocessor)、PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀均為美國Ciphergen公司產(chǎn)品(CiphergenBiosystem，Inc.USA).
3血清樣品采集與處理。
研究對象前日晚餐后至少空腹8小時(shí)于次日清晨空腹采肘靜脈血5毫升，不抗凝；30分鐘內(nèi)放入4℃冰箱保存；1-3小時(shí)內(nèi)于4℃3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清分裝100ul/管-80℃保存。
4CM10芯片的處理。
于-80℃冰箱中取出各血清樣品，置冰盒上融解；以10,000轉(zhuǎn)、4℃離心分離2分鐘；每個(gè)樣本取血清10ul(微升)，用2倍體積U9緩沖液(9M尿素，2％CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0)稀釋，將樣品充分混勻后冰浴振蕩30分鐘，以使血清樣本變性；將30ul上述變性后樣品加入360ul結(jié)合緩沖液(50mM NaAc，pH4.0)，混勻，避免氣泡產(chǎn)生，使得血清的總稀釋倍數(shù)達(dá)到約40倍(即10ul血清最終被稀釋為400ul)在生物處理器中每加樣孔中加入100ul前述處理好的變性稀釋樣品，置振蕩器400-600轉(zhuǎn)/分，室溫下震蕩1小時(shí)(以塊鋁箔紙或者封口膜蓋在處理器加樣孔上)。棄去與芯片作用后的樣品，每孔加入200ul的結(jié)合緩沖液(50mM NaAc，pH4.0)置振蕩器400-600轉(zhuǎn)/分，室溫下震蕩5分鐘以洗滌，甩去孔中結(jié)合緩沖液，再次加入結(jié)合緩沖液200ul，重復(fù)操作一次以進(jìn)一步清洗。
每孔加入200ul高效液相色譜純度的水沖洗，立刻甩出，拆開芯片處理器，取出芯片后，待干后，在每個(gè)加樣孔上加能量吸收分子芥子酸(SPA0.5ul)，待自然干燥后，重復(fù)加SPA0.5ul一次。待干后，即可上PBSCII型芯片閱讀儀讀片測定。5芯片閱讀儀讀取CM10芯片生物信息。
用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，設(shè)定儀器為陽離子檢測模式，激光強(qiáng)度為220，敏感度為8，最佳質(zhì)荷比掃描范圍為2000-20000Da，利用PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)自動(dòng)收集各例血清樣本在CM10芯片蛋白質(zhì)峰。
6質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。
以Ciphergen公司專用數(shù)據(jù)處理軟件Ciphergen ProteinChip Software3.1及Biomarker Wizard軟件對所有測得蛋白質(zhì)峰進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以總離子流對各組質(zhì)譜數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理，定義首輪信噪比為5、最小出現(xiàn)頻率為15％，二次信噪比為2、質(zhì)荷比范圍為0.3％的峰為有效峰。調(diào)整后的蛋白峰數(shù)據(jù)經(jīng)軟件導(dǎo)出.csv格式文件，用樹狀圖分析構(gòu)建軟件Biomarker parttern software 5.0(Ciphergen Biosystem.Inc，USA)建立由差異峰組成的矽肺人群分類樹狀圖，設(shè)定根節(jié)點(diǎn)最小樣本數(shù)為4，終端節(jié)點(diǎn)最小樣本數(shù)為2，采用Gnini算法。
二結(jié)果1各期矽肺人群的蛋白指紋分類樹狀圖的建立結(jié)果依據(jù)設(shè)定的有效峰參數(shù)，各期矽肺人群與對照組人群相比，共有24個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異峰(取a＝0.05時(shí))，在9個(gè)差異性最為顯著的蛋白或多肽峰中，如圖1以及圖3所示差異峰的分子量分別為a、b、c、d即2745.7Da、3711.73Da、2954.78Da、3401.03Da的蛋白或多肽生物分子峰在矽肺人群中顯著升高。而如圖2以及圖4所示差異峰的分子量分別為e、f、g、h、i即5933.65Da、4183.66Da、5487.28Da、6124.64Da、5915.14Da時(shí)的蛋白或多肽生物分子峰在各期矽肺人群中顯著下降。
根據(jù)接收器工作曲線(Receiver Operator Curve，ROC)分析，上述9個(gè)顯著差異峰分別對分辯矽肺暴露人群與正常人群的敏感性與特異性見表1。
表1

注表中↑和↓分別表示與對照組相比，該生物分子峰在各組矽塵暴露人群中的升高或下降。
應(yīng)用BPS軟件，以各組矽塵暴露人群與對照組共同表現(xiàn)的差異峰作為分類變量、采用Geni算法建立的正常對照-矽塵暴露人群分類樹圖如圖5所示，樹型結(jié)構(gòu)較為簡單，采用了組間差異最顯著的峰M/Z4183.65、M/Z6124.64和M/Z2745.72。如圖5所示，若節(jié)點(diǎn)中預(yù)測變量取值小于拐點(diǎn)，則歸入左側(cè)，反之則歸入右側(cè)，直至完成正常人群與矽塵暴露人群間的分類。
以全部差異峰(24個(gè))作為預(yù)測分類指標(biāo)，采用BPS軟件對包含各期矽肺暴露人群和正常對照人群作分期判斷樹圖如圖6所示，樹型結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，共計(jì)用7個(gè)差異峰變量即分子量為2745.72Da、4183.66Da、M/Z11723.7Da、15941.7Da、5487.28Da、2964.77Da、5071.15Da。如圖6所示，若節(jié)點(diǎn)中預(yù)測變量取值小于拐點(diǎn)，則歸入左側(cè)，反之則歸入右側(cè)，直至完成正常人群、接塵人群、可疑矽肺人群與矽肺I人群間的區(qū)分。
2對矽肺人群血清蛋白指紋分類樹圖的驗(yàn)證與修正采用已經(jīng)確定的各期矽肺人群樣本和正常人群血清為檢驗(yàn)樣本，以同樣的標(biāo)本處理方法、儀器分析條件、軟件分析參數(shù)，采用盲法對已經(jīng)建立的矽肺人群血清蛋白分類樹狀圖的分類特異性、敏感性進(jìn)行驗(yàn)證并修正，證明圖1的血清蛋白指紋分類樹狀圖對正常對照人群與矽肺人群之間分類的敏感性為100％，特異性為95％；證明圖2的矽肺分期的蛋白指紋分類樹狀圖，對正常對照、接塵工人、矽肺0+期和矽肺I期的正確判別率分別達(dá)100％、90％、85％和95％。
權(quán)利要求
1.矽肺人群血清蛋白指紋的構(gòu)建方法，其特征在于由以下步驟組成(1)抽取正常對照人群組、接塵工人組(矽肺0期)、可疑矽肺組(矽肺0+期)和矽肺I期人群組的清晨空腹靜脈血液樣本，分別分離血清并分裝冷藏；(2)各組血清樣本分別加于CM10芯片(弱陽離子屬性)上，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白或多肽群的富集純化與雜蛋白的洗脫；(3)添加能量吸收分子(具體使用材料。有幾種，實(shí)施例)，以蛋白芯片閱讀儀掃描芯片，獲取各組實(shí)驗(yàn)人群的血清蛋白圖譜；(4)用生物信息學(xué)軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，篩選出差異蛋白或多肽峰，建立矽肺人群的血清蛋白分類和分期樹狀圖；(5)采用盲法以另外一批各期矽肺和正常人群的血液樣本對已經(jīng)建立的分類樹圖的特異性、敏感性進(jìn)行修正、驗(yàn)證。
全文摘要
本發(fā)明涉及矽肺人群血清蛋白指紋的構(gòu)建，方法組成(1)抽取對照組、接塵組、可疑矽肺組和矽肺I期組的清晨空腹靜脈血液樣本，分別分離血清并分裝冷藏；(2)各組每個(gè)血清樣本分別加于CM10芯片，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白或多肽群的富集純化與雜蛋白的洗脫；(3)以蛋白芯片閱讀儀掃描芯片，獲取各組實(shí)驗(yàn)人群的血清蛋白圖譜；(4)用生物信息學(xué)軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，篩選出差異蛋白或多肽峰，建立矽肺人群的血清蛋白分類和分期樹狀圖；(5)采用盲法以另外含有各期矽肺和正常人群的樣本對已經(jīng)建立的分類樹圖的特異性、敏感性進(jìn)行修正、驗(yàn)證。使用該指紋可以實(shí)現(xiàn)對矽肺人群分類的高特異性與高敏感性，對矽肺患者早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供有益的幫助。
文檔編號A61B5/157GK1936573SQ20061001619
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月23日
發(fā)明者王世鑫, 趙學(xué)峰, 何冰, 曾家偉, 王奕飛 申請人:中國人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院