一種人體血清miRNA的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人體血清miRNA的提取方法，主要針對實(shí)驗(yàn)室常用的Trizol法提取血清miRNA的純度和濃度較低進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化環(huán)節(jié)包括血清的制備、血清的預(yù)處理和具體的提取過程。優(yōu)化后的方法操作步驟簡單、成本較低，效果較好，穩(wěn)定性也較好，尤其是血清經(jīng)過預(yù)處理后，效果尤為明顯，所得血清miRNA純度高（OD260/OD280值為1.85-1.95）且產(chǎn)率也較高（RNA提取率為45-60μg/ml血清），用qRT-PCR檢測血清的內(nèi)參基因 miR-16 的Ct值在24-26之間，表明該方法提取的血清miRNA完全滿足qRT-PCR的需要。
【專利說明】一種人體血清miRNA的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種人體血清miRNA的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微小RNAUicroRNA或miRNA)是一類長度很短的具有調(diào)控基因表達(dá)功能的內(nèi)源性 非編碼單鏈小RNA，長約19-25個核苷酸不等，幾乎參與了調(diào)控細(xì)胞活動的各個環(huán)節(jié)。在人 體血清等體液中檢測到的穩(wěn)定性良好的miRNA稱為循環(huán)miRNA。Lawrie等（2008)首先發(fā)現(xiàn) 癌細(xì)胞可釋放miRNA進(jìn)入血液，認(rèn)為此類miRNA可被開發(fā)用于檢測早期癌癥。近年來，血清 miRNA作為一種新的生物標(biāo)志物被廣泛用于診斷各種癌癥、感染性疾病等人類重大疾病。采 用的方法主要是提取血清miRNA，利用基因芯片或?qū)崟r熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測miRNA 的表達(dá)水平變化。分離獲得高純度和完整的miRNA是開展此類臨床診斷的關(guān)鍵。人體血清 中富含蛋白質(zhì)，增加了提取和分離miRNA的難度。實(shí)驗(yàn)室常用的RNA提取方法，如酚/氯仿 和Trizol試劑分離獲得的miRNA純度和濃度均較低，而目前市場上的一些血清miRNA提取 試劑盒可用于獲得較高純度的miRNA，但價格昂貴，一定程度上限制了對miRNA的研宄。因 此，針對實(shí)驗(yàn)室常用的Trizol提取血清miRNA的方法進(jìn)行優(yōu)化，使之適合于分離獲得高純 度和完整的血清miRNA，并能滿足qRT-PCR需要，可大大節(jié)約科研或臨床miRNA檢測成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供了一種人體血清miRNA的提取方法，該方法 成本低廉且能夠高效獲得高純度和完整的人體血清miRNA。
[0004] 本發(fā)明采用正交法從血清體積、溫度、時間和轉(zhuǎn)速等因素，優(yōu)化Trizol提取人體 血清miRNA的方法，優(yōu)化的環(huán)節(jié)包括血清的制備、血清的預(yù)處理和具體的提取過程。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種人體血清miRNA的提取方法，其特征在于包括以下步驟：（1)人體血清的制備，使 用血清采集管采集靜脈空腹血，顛倒混勻后，于30-38°C溫浴10_30min，室溫2000-5000rpm 離心3-10min ; (2)人體血清的預(yù)處理，取步驟（1)制得的人體血清，添加滅菌的體積濃度 為0. 1%的焦炭酸二乙酯水溶液，并混合均勻，其中人體血清與焦炭酸二乙酯水溶液的體積 配比為1:1-10 ; (3)人體血清miRNA的提取，向步驟（2)預(yù)處理的人體血清中加入等體積 的Trizol，室溫放置5min后，加入1/5 Trizol體積的氯仿，劇烈震蕩并室溫放置2-3min 后，4°C 12000X#離心15min，取上清液至新的離心管中，加入1/2 Trizol體積的異丙醇以 沉淀RNA，并于-20°C放置0. 5-12h后于4°C 12000 X ^離心lOmin，然后倒掉上清，加入與 Trizol等體積的體積濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，4°C 7500 X ^離心5min后倒掉上清，4°C 12000Xg離心2min，將殘留乙醇用吸頭除盡，并于室溫放置使乙醇徹底揮發(fā)，然后用滅菌 的體積濃度為0. 1%的焦炭酸二乙酯水溶液于55-60°C溫浴15min充分溶解RNA，用于檢測 純度和含量，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于qRT-PCR檢測。
[0006] 本技術(shù)方案中，由于血清含有較豐富的蛋白質(zhì)，降低了 Trizol法獲得的血清 miRNA的純度和濃度，影響qRT-PCR的檢測，故對該方法進(jìn)行優(yōu)化。收集的血漿樣品于 30-38°C溫浴10_30min，使血清在接近人體溫度環(huán)境下析出，有利于miRNA的穩(wěn)定；向獲得 的血清中按1:1-10 (V/V)的不同比例添加滅菌的體積濃度為0. 1%的焦炭酸二乙酯（DEPC) 水溶液，將血清適當(dāng)?shù)叵♂?，可在離心分離后獲得較多的上清(含miRNA)，提高了 miRNA的 產(chǎn)率，此外可將血清中所含蛋白稀釋，使離心后所得上清中蛋白含量降低，從而提高血清 miRNA的純度。與現(xiàn)有血清miRNA提取試劑盒相比，在低成本的前提下可獲得高效高純的血 清 miRNA〇

【具體實(shí)施方式】
[0007] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說 明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0008] 實(shí)施例1 采用正交法對實(shí)驗(yàn)室常用的Trizol提取血清miRNA的方法進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的具體操作 步驟如下： (1) 血清的制備 所用血液樣品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集靜脈空腹血，顛倒混勻后，放 于 30°C溫浴 30min，室溫 2000rpm 離心 IOmin ; (2) 血清的預(yù)處理 取血清，按I: I (V/V)的比例加入滅菌的體積濃度為0. 1%的DEPC水溶液，并充分混合 均勻； (3) 血清miRNA的提取 步驟a :向預(yù)處理的血清中加入等體積的Trizol，室溫放置5min ; 步驟b :加入1/5 Trizol體積的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2-3min后，4 °C 12000 X1^?離心 15min ; 步驟c :取上清液至新的離心管中，加入1/2 Trizol體積的異丙醇，-20°C放置30min， 4°C 12000 Xg離心 IOmin ; 步驟d :倒掉上清，加入與Trizol等體積的體積濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，4°C YSOOXg'^I^Smin; 步驟e :倒掉上清，4°C 12000Xg離心2min，將殘留乙醇用吸頭除盡，并室溫放置使乙 醇徹底揮發(fā)； 步驟f :加入15 μ 1滅菌的體積濃度為0. 1%的DEPC水溶液，55-60°C溫浴15min充分 溶解，用于檢測純度和含量，并用于qRT-PCR檢測。
[0009] 實(shí)施例2 采用正交法對實(shí)驗(yàn)室常用的Trizol提取血清miRNA的方法進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的具體操作 步驟如下： (1) 血清的制備 所用血液樣品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集靜脈空腹血，顛倒混勻后，放 于 38°C溫浴 lOmin，室溫 5000rpm 離心 3min ; (2) 血清的預(yù)處理 取血清，按1:10 (V/V)的比例添加滅菌的體積濃度為0. 1%的DEPC水溶液，并充分混 合均勻； (3)血清miRNA的提取 步驟a :向預(yù)處理的血清中加入等體積的Trizol，室溫放置5min ; 步驟b :加入1/5 Trizol體積的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2-3min后，4 °C 12000 X1^?離心 15min ; 步驟c :取上清液至新的離心管中，加入1/2 Trizol體積的異丙醇，-20°C放置過夜 (12h)，4°C 12000Xg離心 IOmin; 步驟d :倒掉上清，加入與Trizol等體積的體積濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，4°C YSOOXg'^I^Smin; 步驟e :倒掉上清，4°C 12000Xg離心2min，將殘留乙醇用吸頭除盡，并室溫放置使乙 醇徹底揮發(fā)； 步驟f :加入15 μ 1滅菌的體積濃度為0. 1%的DEPC水溶液，55-60°C溫浴15min充分 溶解，用于檢測純度和含量，并用于qRT-PCR檢測。
[0010] 實(shí)施例3 采用正交法對實(shí)驗(yàn)室常用的Trizol提取血清miRNA的方法進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的具體操作 步驟如下： (1) 血清的制備 所用血液樣品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集靜脈空腹血，顛倒混勻后，放 于 37°C 溫浴 20min，室溫 3000rpm 離心 5min ; (2) 血清的預(yù)處理 取血清，按1:5 (V/V)的比例添加滅菌的體積濃度為0. 1%的DEPC水溶液，并充分混合 均勻； (3) 血清miRNA的提取 步驟a :向預(yù)處理的血清中加入等體積的Trizol，室溫放置5min ; 步驟b :加入1/5 Trizol體積的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2-3min后，4 °C 12000 X1^?離心 15min ; 步驟c :取上清液至新的離心管中，加入1/2 Trizol體積的異丙醇，-20°C放置lh，4°C 12000 X1^?離心 IOmin ; 步驟d :倒掉上清，加入與Trizol等體積的體積濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，4°C YSOOXg'^I^Smin; 步驟e :倒掉上清，4°C 12000Xg離心2min，將殘留乙醇用吸頭除盡，并室溫放置使乙 醇徹底揮發(fā)； 步驟f :加入15 μ 1滅菌的體積濃度為0. 1%的DEPC水溶液，55-60°C溫浴15min充分 溶解，用于檢測純度和含量，并用于qRT-PCR檢測。
[0011] 實(shí)施例4 (1)血清的制備 所用血液樣品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集靜脈空腹血，顛倒混勻后，室 溫放置lh，室溫3000rpm離心5min ; (2)血清miRNA的提取 步驟a :向血清中加入等體積的Trizol，室溫放置5min ; 步驟b :加入1/5 Trizol體積的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2-3min后，4 °C 12000 X1^?離心 15min ; 步驟c :取上清液至新的離心管中，加入1/2 Trizol體積的異丙醇，室溫放置lOmin， 4°C 12000 Xg離心 IOmin ; 步驟d :倒掉上清，加入與Trizol等體積的體積濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，4°C YSOOXg'^I^Smin; 步驟e :倒掉上清，4°C 12000Xg離心2min，將殘留乙醇用吸頭除盡，并室溫放置使乙 醇徹底揮發(fā)； 步驟f :加入15 μ 1滅菌的體積濃度為0. 1%的DEPC水溶液，55-60°C溫浴15min充分 溶解RNA，用于檢測純度和含量，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于qRT-PCR檢測。
[0012] 附表說明： 表1按本發(fā)明實(shí)施例3和實(shí)施例4的方法提取血清miRNA的純度和濃度比較

【權(quán)利要求】
1. 一種人體血清miRNA的提取方法，其特征在于包括以下步驟：（1)人體血清的 制備，使用血清采集管采集靜脈空腹血，顛倒混勻后，于30-38 °C溫浴10_30min，室溫 2000-5000rpm離心3-10min ; (2)人體血清的預(yù)處理，取步驟（1)制得的人體血清，添加滅菌 的體積濃度為0. 1%的焦炭酸二乙酯水溶液，并混合均勻，其中人體血清與焦炭酸二乙酯水 溶液的體積配比為1:1-10 ; (3)人體血清miRNA的提取，向步驟（2)預(yù)處理的人體血清中加 入等體積的Trizol，室溫放置5min后，加入1/5 Trizol體積的氯仿，劇烈震蕩并室溫放置 2-3min后，4°C 12000X1§?離心15min，取上清液至新的離心管中，加入1/2 Trizol體積的異 丙醇以沉淀RNA，并于-20°C放置0. 5-12h后于4°C 12000X^?離心lOmin，然后倒掉上清，加 入與Trizol等體積的體積濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，4°C 7500X ^?離心5min后倒掉上 清，4°C 12000X^?離心2min，將殘留乙醇用吸頭除盡，并于室溫放置使乙醇徹底揮發(fā)，然后 用滅菌的體積濃度為0. 1%的焦炭酸二乙酯水溶液于55-60°C溫浴15min充分溶解RNA，用 于檢測純度和含量，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于qRT-PCR檢測。
【文檔編號】C12N15/10GK104480102SQ201410662430
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】王麗, 李迎迎, 仉曉文, 彭方林, 袁園園, 王曦?zé)? 王林嵩 申請人:河南師范大學(xué)