本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雞毒支原體培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
雞毒支原體(mycoplasmagalliseptium，mg)感染又稱雞慢性呼吸道病(chronicrespiratorydisease，crd)，廣泛流行于世界上所有的養(yǎng)禽國(guó)家。雞場(chǎng)感染mg后，雛雞的弱雛率升高、蛋雞的產(chǎn)蛋率、肉雞的體重及飼料轉(zhuǎn)化率均下降，且易繼發(fā)病毒或細(xì)菌感染，造成雞只死亡率升高，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重危害，疫苗接種是防制本病的最根本措施。
mg由于其基因組較小，造成基因組中編碼氨基酸和輔助因子生物合成的基因就少，從而導(dǎo)致能量代謝能力有限，屬于氨基酸、脂類和某些輔助因子營(yíng)養(yǎng)缺陷型，需要從外界攝取多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)繁殖，因此對(duì)體外培養(yǎng)基的要求相當(dāng)苛刻。目前，臨床已有的分離培養(yǎng)mg和生產(chǎn)mg疫苗使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基一般均由frey或pplo培養(yǎng)基改良而來(lái)。
但已有的傳統(tǒng)培養(yǎng)基所培養(yǎng)的mg活菌滴度低(在1.0×109～12ccu/ml)，制苗用菌液(半成品)生產(chǎn)滅活疫苗時(shí)不能直接使用，需對(duì)半成品進(jìn)行一定濃縮后方可制備成品疫苗，而半成品的濃縮操作繁瑣、濃縮過(guò)程損失較大，最終影響成品疫苗的保護(hù)效力，并且使疫苗生產(chǎn)成本提高；已有的傳統(tǒng)培養(yǎng)基其制苗添加的血清量普遍為10～30％之間，過(guò)量的血清制備的疫苗無(wú)疑給雞只增加異源體對(duì)雞體的過(guò)敏應(yīng)激反應(yīng)，最終影響疫苗的免疫效力，且增加生產(chǎn)成本；已有的傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行mg臨床分離時(shí)，病原檢出率低且生長(zhǎng)緩慢(初次分離所需時(shí)間平均為7～12d)，不利于診斷及臨床藥物篩選。
因此，本領(lǐng)域亟需低血清高效快速分離培養(yǎng)mg的培養(yǎng)基，進(jìn)而開(kāi)展mg感染的診斷與防控研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種雞毒支原體培養(yǎng)基及其制備方法，其既簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)培養(yǎng)基的復(fù)雜成分物質(zhì)、降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本，又減少了豬血清的使用量，降低了豬血清對(duì)雞只的過(guò)敏反應(yīng)。同時(shí)，使用本發(fā)明培養(yǎng)基可使雞毒支原體的活菌滴度高達(dá)1023ccu/ml以上，活菌滴度和分離的敏感性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基，更適于雞毒支原體的分離鑒定和疫苗生產(chǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種雞毒支原體培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基，
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：
所述輔助培養(yǎng)基包括：
根據(jù)本發(fā)明的雞毒支原體培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：
所述輔助培養(yǎng)基包括：
豬血清30ml/l
spf胚尿囊液70ml/l
10萬(wàn)單位/ml青霉素10ml/l。
根據(jù)本發(fā)明的雞毒支原體培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：
所述輔助培養(yǎng)基包括：
根據(jù)本發(fā)明的雞毒支原體培養(yǎng)基，所述spf胚尿囊液為12-14日齡spf胚尿囊液。
根據(jù)本發(fā)明的雞毒支原體培養(yǎng)基，所述spf胚羊水為12-14日齡spf胚羊水。
本發(fā)明還提供上述雞毒支原體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
a、配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基：
將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各成分混合后充分?jǐn)嚢瑁怪耆芙?，?16℃下滅菌20min，置2～8℃下保存；
b、配制輔助培養(yǎng)基：
將輔助培養(yǎng)基的各成分混合后攪拌均勻，利用過(guò)濾除菌裝置進(jìn)行殺菌處理；
c、于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入輔助培養(yǎng)基，混合均勻后，用過(guò)濾除菌的1mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph值至7.6-7.8，定量分裝。
本發(fā)明通過(guò)spf胚尿囊液和spf胚羊水改善了現(xiàn)有技術(shù)中用于雞毒支原體的培養(yǎng)基，得到一種新的培養(yǎng)基配方，該培養(yǎng)基包括由氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、醋酸鉈乳蛋白水解物與酵母粉等組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和由豬血清、spf胚尿囊液、spf胚羊水和青霉素組成的輔助培養(yǎng)基；同時(shí)本發(fā)明還提供上述培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明所得培養(yǎng)基在已有培養(yǎng)mg培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，降低了豬血清用量，去掉了氨基酸(l-半胱氨酸和精氨酸)，增加了12-14日齡spf胚尿囊液和胚羊水，并對(duì)培養(yǎng)基的ph值、滲透壓、離子強(qiáng)度等進(jìn)行了比較，研究出了一種生長(zhǎng)周期短、活菌滴度高、血清含量及成本低的mg高效液體培養(yǎng)基。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售；如無(wú)特殊說(shuō)明，文中的“％”為質(zhì)量百分比。
本發(fā)明提供了一種雞毒支原體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基。
其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：
輔助培養(yǎng)基包括：
為了使mg的生長(zhǎng)周期短、活菌滴度高，上述輔助培養(yǎng)基中的spf胚尿囊液與spf胚羊水分別優(yōu)選12-14日齡spf胚尿囊液、12-14日齡spf胚羊水。
另外還需說(shuō)明，為了更好的體現(xiàn)本技術(shù)方案的優(yōu)越性，上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中醋酸鉈與葡萄糖優(yōu)選美國(guó)sigma公司所產(chǎn)；乳蛋白水解物與酵母粉優(yōu)選英國(guó)oxoid公司所產(chǎn)；豬血清優(yōu)選北京鼎國(guó)生物公司所產(chǎn)。
同時(shí)，本發(fā)明還提供了上述雞毒支原體培養(yǎng)基的制備方法。該制備方法包括以下步驟：
步驟一、配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各成分混合后充分?jǐn)嚢?，使之完全溶解，?16℃下滅菌20min，置2-8℃下保存。
步驟二、配制輔助培養(yǎng)基。
將輔助培養(yǎng)基的各成分混合后攪拌均勻，利用過(guò)濾除菌裝置進(jìn)行殺菌處理。
步驟三、于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入輔助培養(yǎng)基，混合均勻后，用過(guò)濾除菌的1mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph值至7.6-7.8，定量分裝。
本發(fā)明技術(shù)方案具體實(shí)施例1：
步驟一、配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下：
將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各成分混合后充分?jǐn)嚢瑁怪耆芙?，?16℃下滅菌20min，置2-8℃下保存。
步驟二、配制輔助培養(yǎng)基。
輔助培養(yǎng)基配方如下：
豬血清30ml/l
spf胚尿囊液70ml/l
10萬(wàn)單位/ml青霉素10ml/l
將輔助培養(yǎng)基的各成分混合后攪拌均勻，利用過(guò)濾除菌裝置進(jìn)行殺菌處理。
步驟三、于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入輔助培養(yǎng)基，混合均勻后，用過(guò)濾除菌的1mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph值至7.6-7.8，定量分裝。
所得雞毒支原體培養(yǎng)基呈粉紅色，將其置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明技術(shù)方案具體實(shí)施例2：
步驟一、配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下：
將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各成分混合后充分?jǐn)嚢?，使之完全溶解，?16℃下滅菌20min，置2-8℃下保存。
步驟二、配制輔助培養(yǎng)基。
輔助培養(yǎng)基配方如下：
將輔助培養(yǎng)基的各成分混合后攪拌均勻，利用過(guò)濾除菌裝置進(jìn)行殺菌處理。
步驟三、于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入輔助培養(yǎng)基，混合均勻后，用過(guò)濾除菌的1mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph值至7.6-7.8，定量分裝。
所得雞毒支原體培養(yǎng)基呈粉紅色，將其置于-20℃下保存?zhèn)溆??！?/p>
為了更好的體現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)越性和技術(shù)效果，現(xiàn)將實(shí)施例1、實(shí)施例2所得培養(yǎng)基與改良frey氏培養(yǎng)基分別進(jìn)行活菌滴度和對(duì)mg分離敏感性的對(duì)比試驗(yàn)。
試驗(yàn)一：本發(fā)明培養(yǎng)基與改良frey氏培養(yǎng)基活菌滴度的對(duì)比試驗(yàn)
1方法
1.1mg質(zhì)控菌株及培養(yǎng)條件
質(zhì)控菌株為mg疫苗6/85株(購(gòu)自英特威國(guó)際有限公司)、mgs6株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、mg臨床分離lj株(由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存)。將mg疫苗6/85株、mgs6株及mg臨床分離lj株分別接種本發(fā)明培養(yǎng)基(實(shí)施例1)、本發(fā)明培養(yǎng)基(實(shí)施例2)、改良frey氏培養(yǎng)基，種子繼代復(fù)壯后，分別按10％(v/v)的比例接種，37℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的顏色變黃、ph由7.7降至6.5時(shí)，無(wú)菌取出培養(yǎng)物。
1.2活菌滴度(ccu)測(cè)定
每個(gè)菌株取24支5ml滅菌試管，每管裝1.8ml(含mg培養(yǎng)基)，在第1支管中加入0.2ml生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)物，混合均勻后，吸取0.2ml加入第2支管，如此進(jìn)行10倍系列稀釋至第23支管，第24支管不加菌液作為陰性對(duì)照。試驗(yàn)試管設(shè)三個(gè)重復(fù)。之后，將試管放置在37℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)，每日觀察1次，主要觀察培養(yǎng)基的顏色變化，連續(xù)觀察時(shí)間為10天，最后發(fā)生顏色變化的試管稀釋度即為該培養(yǎng)物的ccu滴度。此試驗(yàn)共進(jìn)行了3次。
2結(jié)果
2.1mg疫苗6/85株接種3種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)的(顏色變化單位)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
表1mg疫苗6/85株接種3種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)ccu測(cè)定結(jié)果
2.2mgs6株接種3種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)的(顏色變化單位)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。
表2mgs6株接種3種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)ccu測(cè)定結(jié)果
2.3mg臨床分離lj株接種3種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)的(顏色變化單位)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。
表3mg臨床分離lj株接種3種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)ccu測(cè)定結(jié)果
試驗(yàn)二：本發(fā)明培養(yǎng)基與改良frey氏培養(yǎng)基對(duì)mg分離敏感性的對(duì)比試驗(yàn)
從疑似mg感染的發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)收集發(fā)病典型的患病雞，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)至少采集3只。每只雞無(wú)菌操作采集肺和氣囊，將其充分剪碎后加到2ml支原體液體培養(yǎng)基中，攪拌混勻后取上清液用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，取1μl濾液進(jìn)行mgpcr鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的濾液按1:10的比例分別加到本發(fā)明培養(yǎng)基和改良frey氏液體培養(yǎng)基中，放入37℃恒溫箱中振蕩培養(yǎng)。每天檢查液體培養(yǎng)基的顏色變化，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色變成黃色，立即移植于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)5～7d后，在10倍倒置顯微鏡下觀察到mg典型菌落(“荷包蛋樣”菌落)的則鑒定為mg分離陽(yáng)性。對(duì)于液體培養(yǎng)物在14d內(nèi)未發(fā)生顏色變化、固體培養(yǎng)基上14d內(nèi)無(wú)典型菌落生長(zhǎng)的，則認(rèn)為分離結(jié)果為陰性；三種培養(yǎng)基對(duì)mg分離敏感性的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
表43種培養(yǎng)基對(duì)mg分離敏感性的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果
從mg分離敏感性對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，本發(fā)明培養(yǎng)基檢出率顯著高于改良frey氏培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)所需的時(shí)間明顯短于改良frey氏培養(yǎng)基。
從本發(fā)明培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)中改良frey氏培養(yǎng)基進(jìn)行mg培養(yǎng)的活菌滴度及分離敏感性對(duì)比試驗(yàn)來(lái)看，本發(fā)明具有以下有益效果：
(1)本發(fā)明可明顯提高mg培養(yǎng)的活菌滴度(高達(dá)1.0×1023ccu/ml以上)，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)培養(yǎng)基的復(fù)雜成分物質(zhì)及生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。
(2)本發(fā)明降低了異源血清的用量，不僅降低了成本，且減少了異源血清對(duì)雞體的過(guò)敏應(yīng)激反應(yīng)。
(3)本發(fā)明所制備的培養(yǎng)基分離敏感性高，能明顯縮短雞毒支原體的生長(zhǎng)時(shí)間，加快鑒別mg的生長(zhǎng)判斷，從而利于mg的分離鑒定及臨床藥物篩選。
由此得出，本發(fā)明培養(yǎng)基顯著優(yōu)于改良frey氏培養(yǎng)基，其具有更廣泛的使用性，既適合科學(xué)研發(fā)，又適合大規(guī)模的生產(chǎn)。
綜上所述，本發(fā)明通過(guò)spf胚尿囊液和spf胚羊水改善了現(xiàn)有技術(shù)中用于雞毒支原體的培養(yǎng)基，得到一種新的培養(yǎng)基配方，該培養(yǎng)基包括由氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、醋酸鉈乳蛋白水解物與酵母粉等組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和由豬血清、spf胚尿囊液、spf胚羊水和青霉素組成的輔助培養(yǎng)基；同時(shí)本發(fā)明還提供上述培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明所得培養(yǎng)基在已有培養(yǎng)mg培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，降低了豬血清用量，去掉了氨基酸(l-半胱氨酸和精氨酸)，增加了12-14日齡spf胚尿囊液和胚羊水，并對(duì)培養(yǎng)基的ph值、滲透壓、離子強(qiáng)度等進(jìn)行了比較，研究出了一種生長(zhǎng)周期短、活菌滴度高、血清含量及成本低的mg高效液體培養(yǎng)基。
當(dāng)然，本發(fā)明還可有其它多種實(shí)施例，在不背離本發(fā)明精神及其實(shí)質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。