本發(fā)明涉及利用mirna檢測肺癌細胞對放射治療敏感性的方法、芯片及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。根據(jù)全國腫瘤防治研究辦公室的報告，北京、上海、天津、哈爾濱等城市肺癌的發(fā)病率和死亡率為所有惡性腫瘤之首，占全部惡性腫瘤的20％～30％。臨床ⅰ期和ⅱ期肺癌手術(shù)治療5年生存率約為40％。放射治療是肺癌治療的主要手段，約70％的病人需接受放射治療。在肺癌的放射治療中，目前仍延續(xù)應(yīng)用幾十年一貫的治療模式，2gy/次，每周5次，總劑量60～70gy/6～7周。而事實上不同個體對放射敏感性是存在差異的，在相同的治療劑量下，有的病人有效、有的病人則無效，有的病人可能出現(xiàn)嚴重的副作用。如果在治療前可預(yù)測病人對放射的敏感性，那么就可能擬定既對腫瘤有最高療效又對正常組織損傷最低的放射劑量。然而，目前國內(nèi)外還沒有可用于臨床預(yù)測放療敏感性的指標(biāo)。因此，尋找與放療敏感性相關(guān)的一些生物標(biāo)志物對改善和指導(dǎo)臨床腫瘤放射治療，增進療效和降低副作用具有重要的理論意義和實用價值。microrna是一類小的(19～24nt)非編碼rnas，負責(zé)調(diào)控靶基因mrnas的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄效率，在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、發(fā)育、分化及代謝等方面發(fā)揮重要作用。目前已知541種人類microrna，最近一項研究預(yù)測其數(shù)目可能達到1000種。一種microrna能夠調(diào)節(jié)數(shù)百個下游基因，研究預(yù)測高達30％的人類基因受microrna的調(diào)節(jié)，因此，它們是基因組調(diào)節(jié)分子中最大的一個家族。人類microrna的加工由drosha和dicer完成，其中drosha在核中將pri-microrna加工成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長約70nt的pre-microrna，然后運至胞漿中由dicer進一步加工成22nt左右的成熟microrna。近幾年的發(fā)現(xiàn)使microrna成為分子腫瘤學(xué)研究的熱點之一。隨著microrna表達譜研究的開始，許多研究工作逐漸將microrna表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后聯(lián)系起來。microrna與腫瘤相關(guān)的最早證據(jù)來自2002年calin等的研究，他們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)慢性淋巴細胞性白血病患者的mir-15a和mir-16-1表達降低或缺失。2004年，tadamizawa等首次報道let-7microrna在肺癌中表達下調(diào)。在143例肺癌病人中l(wèi)et-7低表達與術(shù)后生存期縮短相關(guān)，多變量cox回歸分析顯示這個預(yù)后因素是獨立于腫瘤分期的。2005年iorio等利用芯片技術(shù)比較了76例乳腺癌組織和10例正常乳腺組織中microrna表達差異，其中29個microrna在腫瘤中表達下調(diào)，15個microrna能將兩者正確分開。變異最為明顯的microrna包括mir-125b、mir-145、mir-155和mir-21，它們的表達與乳腺癌特異的病理參數(shù)如er狀態(tài)、分期、增殖指數(shù)、血管侵潤等有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)let-7在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或高增殖指數(shù)的樣品中低表達，提示let-7低表達與不良預(yù)后相關(guān)，這與肺癌中的報道一致。2006年yanaihara等采用傳統(tǒng)的芯片技術(shù)分析104對原發(fā)肺癌組織及癌旁組織的microrna表達，得到一組由42個microrna構(gòu)成的組合，能夠正確地將肺癌與正常組織分開。通過單變量和多變量分析，發(fā)現(xiàn)microrna表達譜與肺腺癌病人的生存期相關(guān)：mir-155的高表達和let-7a-2的低表達與不良預(yù)后相關(guān)。為了探索microrna表達譜是否可以用于預(yù)測非小細胞肺癌病人的臨床結(jié)果，2008年yu等利用real-timert-pcr技術(shù)檢測了112例非小細胞肺癌病人microrna的表達情況，得到一個可獨立預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)及生存期的microrna組合(hsa-let-7a、hsa-mir-221、hsa-mir-137、hsa-mir-372、hsa-mir-182)。該組合包括hsa-let-7a，與前兩個肺癌研究的結(jié)果一致，低表達與生存期縮短相關(guān)。2008年1月發(fā)表在nature上的一篇文章通過芯片技術(shù)比較不同轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細胞系microrna表達差異，發(fā)現(xiàn)一組microrna在具有轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細胞中不表達。將這些microrna導(dǎo)入癌細胞中，可以抑制腫瘤細胞的肺轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移。導(dǎo)入mir-126后可降低腫瘤的生長和增殖，而導(dǎo)入mir-335后可抑制轉(zhuǎn)移細胞的侵襲，兩者均鑒定為人類乳腺癌的轉(zhuǎn)移抑制microrna。2008年1月blood雜志報道研究者利用芯片技術(shù)分析了122例未處理的急性髓細胞樣白血病樣品中microrna的表達，發(fā)現(xiàn)mir-191和mir-199a高表達的病人總生存期和無病生存期遠遠低于低表達的病人。綜上所述，microrna是細胞內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)因子，調(diào)控許多基因的表達，與腫瘤關(guān)系密切，而且一些microrna的組合可預(yù)測腫瘤病人的預(yù)后。鑒于此，我們推測microrna很可能也調(diào)控一些與腫瘤放射敏感性相關(guān)的基因的表達，可能用來預(yù)測腫瘤病人的放療敏感性。目前microrna與腫瘤關(guān)系的研究大多集中在與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系方面，國內(nèi)外還未見有microrna與腫瘤放療敏感性關(guān)系的研究報導(dǎo)。技術(shù)實現(xiàn)要素：在本發(fā)明中，發(fā)明人通過選擇對放射治療異常敏感和耐受的肺癌細胞，用microrna表達譜芯片檢測了兩組細胞microrna的表達差異，并用real-timepcr技術(shù)對芯片結(jié)果進行了驗證，最終篩選出11個表達有顯著差異的microrna?；谥辽偕鲜鰞?nèi)容完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下幾方面。本發(fā)明的一方面，提供檢測待測肺癌細胞對x射線放射敏感性的非診斷性方法，其包括測量所述待測肺癌細胞中mirna表達譜的步驟，其中所述mirna表達譜由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成。根據(jù)本發(fā)明的非診斷性方法，優(yōu)選地，(1)所述mirna表達譜包括has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變低；和/或(2)所述mirna表達譜包括has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變高。根據(jù)本發(fā)明的非診斷性方法，優(yōu)選地，檢測待測肺癌細胞對x射線放射敏感性的方法進一步包括從待測肺癌細胞中提取總rna的步驟。根據(jù)本發(fā)明的非診斷性方法，優(yōu)選地，檢測待測肺癌細胞對x射線放射敏感性的方法進一步包括將待測肺癌細胞中的mirna表達譜與標(biāo)準(zhǔn)mirna表達譜比較的步驟。根據(jù)本發(fā)明的非診斷性方法，優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)mirna表達譜來自放療不敏感的肺癌細胞。根據(jù)本發(fā)明的非診斷性方法，優(yōu)選地，(1)當(dāng)has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151各自的表達水平小于所述標(biāo)準(zhǔn)mirna表達譜中對應(yīng)mirna的表達水平時為表達變低；和/或(2)當(dāng)has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192各自的表達水平大于所述標(biāo)準(zhǔn)mirna表達譜中對應(yīng)mirna的表達水平時為表達變高。本發(fā)明的另一方面，提供判斷待測肺癌細胞對x射線放射敏感性發(fā)生變化的非診斷性方法，其包括：測量所述待測肺癌細胞在不同時間點的mirna表達譜，獲得在先mirna表達譜和在后mirna表達譜，所述在先mirna表達譜和所述在后mirna表達譜各自由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成。根據(jù)本發(fā)明的非診斷性方法，優(yōu)選地，當(dāng)滿足以下條件中的一個或兩個時，判斷所述待測肺癌細胞對x射線放射的敏感性變強：(1)與所述在先mirna表達譜相比，所述在后mirna表達譜中的has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變低，(2)與所述在先mirna表達譜相比，所述在后mirna表達譜中的has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變高。根據(jù)本發(fā)明的非診斷性方法，優(yōu)選地，當(dāng)滿足以下條件中的一個或兩個時，判斷所述待測肺癌細胞對x射線放射的敏感性變?nèi)酰?1’)當(dāng)與所述在先mirna表達譜相比，所述在后mirna表達譜中的has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變高，(2’)當(dāng)與所述在先mirna表達譜相比，所述在后mirna表達譜中的has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變低。本發(fā)明的其它方面，提供鑒定引起肺癌細胞對x射線放射敏感性發(fā)生變化的物質(zhì)的方法，其包括：測量在待測物質(zhì)施用到所述肺癌細胞前后的mirna表達譜，獲得施用前后兩種mirna表達譜，其中所述施用前后兩種mirna表達譜各自由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成；當(dāng)滿足以下條件中的一個或兩個時，將所述物質(zhì)鑒定為引起所述肺癌細胞對x射線放射的敏感性變強的物質(zhì)：(1)當(dāng)與施用前的mirna表達譜相比，施用后的mirna表達譜中has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變低，(2)當(dāng)與施用前的mirna表達譜相比，施用后的mirna表達譜中has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變高；當(dāng)滿足以下條件中的一個或兩個時，將所述物質(zhì)鑒定為引起所述肺癌細胞對x射線放射的敏感性變?nèi)醯奈镔|(zhì)：(1’)當(dāng)與施用前的mirna表達譜相比，施用后的mirna表達譜中has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變高，(2’)當(dāng)與施用前的mirna表達譜相比，施用后的mirna表達譜中has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變低。本發(fā)明的再一方面，提供檢測mirna表達譜的試劑在制備用于預(yù)測肺癌細胞對x射線放射敏感性的診斷劑中的用途，其中所述mirna表達譜由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成。本發(fā)明的又一方面，提供芯片，所述引物組的各個引物特異性結(jié)合選自由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成的組中的至少一種；所述探針組的各個探針特異性結(jié)合選自由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成的組中的至少一種。本發(fā)明的檢測待測肺癌細胞對x射線放射敏感性的非診斷性方法可用于可預(yù)測肺癌細胞對放射治療的敏感性。通過預(yù)測不同肺癌細胞對放射治療的敏感性，從而為肺癌的個體化放射治療提供前期的實驗基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法可用于治療前預(yù)判對細胞進行x射線放射治療的有效性。在相同的治療劑量下，有的病人有效而有的病人則無效，有的病人可能出現(xiàn)嚴重的副作用。如果在治療前可預(yù)測病人對放射的敏感性，那么就可能擬訂即對腫瘤有最高療效又對正常組織損傷最低的放射劑量。本發(fā)明可用于鑒定或篩選引起肺癌細胞對x射線放射敏感性變化的物質(zhì)，并進一步將其開發(fā)為例如用于使肺癌病人脫敏的藥物，從而輔助對肺癌病人的x射線放射治療。本發(fā)明可用于判斷在治療過程中個體對x射線放射敏感性是否發(fā)生變化，從而能夠及時調(diào)整治療方案，避免因個體敏感性發(fā)生變化，而使x射線放射治療無效或使x射線放射治療惡化的風(fēng)險。測量mirna表達水平的方法簡單易行，如用real-timepcr方法檢測，所以實用性很強。附圖說明圖1、放療敏感和不敏感肺癌細胞microrna表達差異。深色代表高表達，淺色為低表達。其中11個mirna表達差異有顯著意義(敏感細胞為實驗組，不敏感細胞為對照組)。圖2、real-timepcr結(jié)果。圖3、x射線照射后細胞增殖能力的變化。圖4、x射線照射后細胞輻射敏感性的變化。圖5、mir-126高表達對輻射誘導(dǎo)的sk-mes-1細胞凋亡的影響(parental位于左側(cè)；vector+mir-126位于右側(cè))。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。如本發(fā)明所用術(shù)語“mirna表達譜”，有時也稱作“microrna表達譜”，是指以多種microrna的表達為特征的指標(biāo)，其中mirna表達譜包括多種microrna的表達以及表達量。mirna表達譜中的mirna在對x射線放射敏感的細胞和不敏感的細胞中表達有差異。其中所述差異包括表達的有無，以及表達量的增加或降低。所述差異優(yōu)選通過統(tǒng)計學(xué)計算的顯著差異，例如用t-test進行分析時，p<0.05，優(yōu)選p<0.001，更優(yōu)選p<0.0008。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，mirna表達譜由例如表1所示的microrna組成。表1如本發(fā)明所用術(shù)語“x射線放射”是指用于疾病例如腫瘤(特別是肺癌)治療的x射線放射。x射線放射的治療方式包括目前已知或可推知的任何方式，包括例如2gy/次，每周5次，總劑量60～70gy/6～7周。需要說明的是，不同個體之間或相同個體在不同時間段內(nèi)可存在差異。在本發(fā)明中，檢測待測肺癌細胞對x射線放射敏感性的方法包括測量所述待測肺癌細胞中mirna表達譜的步驟，其可采用本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的任何方法，包括但不限于采用microrna表達譜芯片的方法，和real-timepcr技術(shù)等。作為測量mirna水平的實例包括與選擇性探針的雜交(如，使用rna印跡法、基于珠的流式細胞儀、寡核苷酸微芯片[微陣列]或溶液雜交試驗如ambionmirvanamirna檢測試劑盒)、基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的檢測(如，莖-環(huán)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[rt-pcr]、基于定量rt-pcr的陣列法[qpcr-陣列])或通過下一代測序技術(shù)之一的直接測序法。在本發(fā)明中，在定量前純化mirna?？赏ㄟ^各種方法從樣品分離并純化mirna，包括使用商品化試劑盒(如，mirneasy試劑盒[qiagen]、mirvanarna分離試劑盒[ambion/abi]、miracle[agilent]、高純mirna分離試劑盒[roche]和mirna純化試劑盒[norgenbiotekcorp])、trizol提取(參見下述實施例)、基于陰離子交換劑的濃縮和純化、由rna結(jié)合底物覆蓋的磁珠或基于互補寡核苷酸的某一mirna的吸附。在本發(fā)明中，減少或消除樣品中和/或mirna純化期間的mirna降解。用于減少或消除mirna降解的方法，包括，但不限于，添加rnase抑制劑，使用氯化胍、異硫氰酸胍、n-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸鈉(sds)或其組合。當(dāng)在mirna純化前需要樣品儲運時減少樣品中mirna的降解特別重要。需要說明的是，不同的提取純化方法對于microrna表達譜的測量結(jié)果可能略有差異，但并不影響最終的結(jié)論。為了消除不同方法產(chǎn)生的此類差異，在同一試驗或方法涉及多次測量microrna表達譜的步驟時，優(yōu)選采用相同的提取或純化方法。在本發(fā)明中，檢測待測肺癌細胞對x射線放射敏感性的方法可進一步包括將待測肺癌細胞中的mirna表達譜與標(biāo)準(zhǔn)mirna表達譜比較的步驟。優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)mirna表達譜來自放療不敏感的肺癌細胞(n-a549)。在本發(fā)明中，標(biāo)準(zhǔn)mirna表達譜由表1中所示的11種mirna及其表達量組成。待測肺癌細胞的mirna表達譜中每一種mirna的表達量與標(biāo)準(zhǔn)mirna中對應(yīng)mirna的表達量進行比較，并根據(jù)比較結(jié)果判斷對x射線放射敏感性。優(yōu)選地，has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151各自的表達水平變低時，或者has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192各自的表達水平變高時，認定待測肺癌細胞對x射線放射敏感或者變?yōu)槊舾?。更?yōu)選地，當(dāng)has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151各自的表達水平變低，且has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192各自的表達水平變高時，認定待測肺癌細胞對x射線放射敏感或者變?yōu)槊舾?。本發(fā)明的檢測mirna表達譜的試劑包括用于檢測mirna表達的引物、探針以及提供引物延伸和擴增反應(yīng)的試劑。其中提供引物延伸和擴增反應(yīng)的試劑包括逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶(諸如熱穩(wěn)定性dna聚合酶等)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液和脫氧核苷三磷酸(dntp)?？蛇x地(或另外地)，可包括用于進行雜交分析的試劑。檢測試劑可包括核苷酸類似物和/或標(biāo)記部分，如直接可檢測部分如熒光團(熒光染料)或放射性同位素，或者間接可檢測部分，如結(jié)合對的成員例如生物素，或能夠催化非可溶性比色或發(fā)光反應(yīng)的酶。另外，可進一步包括包含用于核酸電泳檢測的試劑，此類試劑包括直接檢測核酸的那些，如熒光嵌合劑或銀染試劑，或用于檢測標(biāo)記的核酸的那些試劑，例如但不限于ecl試劑。在本發(fā)明中，可進一步包括mirna分離或純化手段以及陽性和陰性對照。在本發(fā)明中，本發(fā)明的試劑可提供為干粉。當(dāng)試劑和/或組分提供為干粉時，粉末可通過添加適合的溶劑來恢復(fù)原狀。在超過一種試劑的情況下，各試劑可以單獨或混合狀態(tài)存在。在本發(fā)明中，本發(fā)明的試劑還可包括保持或維持dna或rna的組分，例如抗核酸降解的試劑。其可為例如或無rnase或具有抗rnase的保護的核酸酶。本發(fā)明的芯片中包括引物組和/或探針組，所述引物組和/或探針組中的各引物和/或探針特異性結(jié)合選自由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成的組中的至少一種。在本發(fā)明中，芯片上設(shè)置有一系列多重(例如，上千)的微小的寡核苷酸點陣列，這些寡核苷酸點各自包含與本發(fā)明所述11種mirna互補的特異序列(探針或引物)。在高嚴格條件下探針-靶標(biāo)雜交后，所得雜交體通常通過定量熒光團、銀或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的靶標(biāo)來檢測和定量。在本發(fā)明中，定制和商購可得的mirna陣列均可使用。本發(fā)明的鑒定引起肺癌細胞對x射線放射敏感性發(fā)生變化的物質(zhì)的方法中包括測量在待測物質(zhì)施用到肺癌細胞前后的mirna表達譜，獲得在施用前后兩種mirna表達譜，其中施用前后兩種mirna表達譜各自由has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22、has-mir-151、has-mir-126、has-mir-96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192組成。在本發(fā)明中，如果與施用前的mirna表達譜相比，施用后的mirna表達譜中，has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變低；和/或has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變高，則將所述物質(zhì)鑒定為引起肺癌細胞對x射線放射的敏感性變強的物質(zhì)。在本發(fā)明中，如果與施用前的mirna表達譜相比，施用后的mirna表達譜中，has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變高；和/或has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變低，則將所述物質(zhì)鑒定為引起肺癌細胞對x射線放射的敏感性變?nèi)醯奈镔|(zhì)。實施例1本實施例中可采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組dna技術(shù)。此類技術(shù)完整解釋于文獻中。參見，例如，sambrook，fritsch&maniatis，分子克?。簩嶒炇沂謨?，第二版，冷泉港，ny：冷泉港實驗室出版社，1989；dna克?。簩嵱梅椒ǎ趇和ii卷(d.n.glover編輯，1985)；寡核苷酸合成(m.j.gait編輯，1984)；核酸雜交[b.d.hames&s.j.higgins編輯(1985)]；轉(zhuǎn)錄和翻譯[b.d.hames&s.j.higgins編輯(1984)]；b.perbal，分子克隆實用指南(1984)；ausubel,f.m.等(編輯)；分子生物學(xué)現(xiàn)有操作手冊，johnwiley&sons,inc.，1994。1、標(biāo)本：選擇對放射治療敏感(s-a549)和放射治療不敏感的肺癌細胞系(n-a549)，-80℃低溫冰箱保存。2、總rna提取1)加入1mltrizonl(inivtrogen)試劑，反復(fù)吹打細胞數(shù)次，使細胞裂解。收集細胞裂解液入離心管中。2)加入800μl氯仿，振蕩，1600g，離心10分鐘。3)吸取上清，加入2.4ml(0.6倍體積)異丙醇。4)上下轉(zhuǎn)動離心管，強烈混勻。5)置-72℃冰箱一小時。6)1600g離心20分鐘。7)小心棄去上清，可見管底有白色沉淀，加入75％乙醇4ml。8)振蕩，1600g離心20分鐘。9)小心棄去上清，倒立離心管于吸水紙上，室溫下晾干后，加入200μl經(jīng)depc處理的水溶解沉淀。3、mirna芯片雜交采用美國lc公司的mparaflotmmirna微流體芯片10.1版本，包含2000個人類mirna。該芯片基于mparaflotm微流體技術(shù)，使陣列上的樣品溶液分布均一，同時促進了雜交反應(yīng)。每張芯片對同一樣品重復(fù)4次檢測。以對放射治療敏感的肺癌細胞為實驗組，以不敏感細胞為對照組，分別取10μg總rna，用ym-100微孔離心濾器(gemillipore,billerica,ma)將其片段化，用poly(a)聚合酶加上poly(a)尾，利用mircurytmarraylabellingkit(ambion)標(biāo)記cy3和cy5熒光。然后進行芯片雜交，雜交液為100μl含25％甲醛的6×sspe緩沖液(0.90mnacl，60mmna2hpo4，6mmedta，ph6.8)，反應(yīng)溫度34℃。雜交后的芯片用genepix4000b進行圖像掃描，采用genepixpro6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計算兩種熒光信號的比值，用t-test進行差異顯著性分析，p<0.05為有顯著性差異。其中在數(shù)據(jù)處理時，使用聚類分析方法分析放療敏感和不敏感細胞microrna表達譜的差異。4、real-timepcr驗證4.1逆轉(zhuǎn)錄取5μg無dna的總rna，加水至10μl，加2μloligo(dt)或3’primer(50μm)。70℃，10分鐘，立即置冰上2分鐘。按順序加入下列溶液：10×pcrbuffer2μl25mmmgcl22μl10mmdntp1μl0.1mdtt2μl混勻并離心。37℃保溫5分鐘，加入1μlsupercriptii(200u)，混勻。37℃保溫5分鐘，42℃繼續(xù)保溫50分鐘。70℃，15分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，可存于-20℃。加入1μlrnaseh，37℃，20分鐘。存于-20℃或者-70℃冰箱中。4.2real-timepcr反應(yīng)4.2.1pcr反應(yīng)體系使用的試劑為sybrpremixextaqtm(perfectrealtime)(appliedbiosystems)配制反應(yīng)體系。4.2.2pcr反應(yīng)程序使用abi7500型real-time擴增儀，兩步法pcr擴增標(biāo)準(zhǔn)程序：stage1(預(yù)變性)：95℃10秒，1cycle；stage2(pcr擴增)：95℃5秒，60℃34秒，40cycles；stage3(溶解曲線分析，監(jiān)控pcr反應(yīng)特異性)：95℃15秒，60℃20秒，95℃15秒。4.2.3結(jié)果分析使用sds1.2軟件，得到ct值,同一樣品重復(fù)3次。實驗組δct＝δct(target)-δct(gapdh)；對照組δct＝δct(target)-δct(gapdh)；δδct＝δct(實驗)-δct(對照)；相對表達量＝2-δδct5、結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個microrna在放療敏感和不敏感細胞中表達有顯著差異，如表2所示。表2放射敏感和不敏感肺癌細胞差異表達的microrna實施例21、構(gòu)建mir-126(亦即mirna-126)的過表達載體，轉(zhuǎn)染sk-mes-1肺癌細胞，以空載和母系作為參照，用mtt實驗檢測了5gyx射線照射后細胞增殖能力的變化，發(fā)現(xiàn)mir-126高表達顯著抑制sk-mes-1細胞的增殖能力(參見圖3)。用克隆形成實驗檢測0、2、4、8gyx射線照射后細胞輻射敏感性的變化，發(fā)現(xiàn)mir-126高表達顯著增加sk-mes-1細胞的輻射敏感性(參見圖4)。隨后，檢測mir-126高表達對輻射誘導(dǎo)的sk-mes-1細胞凋亡的影響。我們發(fā)現(xiàn)，mir-126過表達可以顯著促進4gy和8gyx射線照射誘導(dǎo)的肺癌細胞的凋亡(p<0.05)(參見圖5)。以上實驗表明，mir-126高表達可以增加腫瘤肺癌細胞的輻射敏感性。2、取對輻射敏感性未知的a549細胞，以與實施例1中類似的方法測量11種mirna的表達情況，篩選出與上述n-a549細胞相比，has-mir-130a、has-mir-29a、has-mir-543、has-mir-22和has-mir-151的表達變低以及has-mir-126、has-mir96、has-mir-let7a、has-mir-216a、has-mir-451和has-mir-192的表達變高的a549細胞作為待測細胞。分別用0gy、2gy、4gy和8gyx射線照射誘導(dǎo)所述待測細胞、和n-a549，其細胞凋亡(p<0.05)結(jié)果如下表3所示。表3由表3可以看出，通過11種mirna的表達量的變化可以檢測細胞對x射線放射敏感性。在詳細說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述申請專利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說明書中所舉實例實施方式的限制。當(dāng)前第1頁12