本發(fā)明涉及一種gyv8新型環(huán)形病毒vp3可溶性蛋白的制備方法。此發(fā)明可直接提供vp3可溶性蛋白作為gyv8診斷抗原；作為免疫原獲得抗vp3多克隆抗體；為開展gyv8血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查及vp3功能研究提供有效免疫學(xué)試劑，填補(bǔ)國內(nèi)外空白。

背景技術(shù)：

環(huán)形病毒(gyrovirus)隸屬于環(huán)狀病毒科環(huán)形病毒屬是一種小型無囊膜二十面體對稱的單股環(huán)狀dna病毒，大小超過2kb。雞傳染性貧血病毒(chickeninfectiousanemiavirus，cav)一直被認(rèn)為是圓環(huán)病毒科(circoviridae)中環(huán)形病毒屬(gyrovirus)唯一成員。直到2011年，rijsewijk等從發(fā)病雞的血清樣品中檢測到新型環(huán)形病毒序列，即環(huán)形病毒屬中第二個成員，命名為agv2。同年，sauvage等在健康人的皮膚棉試樣品中檢測到首個與agv2高度同源的人源環(huán)形病毒hgyv序列。自2012年，其它新型環(huán)形病毒包括gyv3，gyv4，gyv5，gyv6，gyv7，gyv8及gyv9被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)鑒定，并具有潛在的公共衛(wèi)生意義。2015年，li等人通過序列非依賴性基因體擴(kuò)增技術(shù)在暴雪鹱組織中發(fā)現(xiàn)了gyv8的序列。gyv8屬于環(huán)形病毒系統(tǒng)發(fā)育樹第三分支的第一個成員，是第一個來源于其他禽類而非雞的環(huán)形病毒。gyv8基因組為2218bp，(gyv8，genbank登錄號no.kr137527)三個重疊的開放閱讀框編碼vp1(478-aa)、vp2(232-aa)、vp3(103-aa)，與其他環(huán)形病毒的同源性很低，僅其vp1片段有38％-42％的同源性。hgyv的vp3具有和cav的vp3相似的亞細(xì)胞分布模式和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)功能，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路也已闡明。然目前尚無檢測gyv8抗原及其抗體的血清學(xué)方法。因此，對gyv8病毒早期表達(dá)蛋白vp3基因在體外進(jìn)行克隆，構(gòu)建vp3表達(dá)載體，實現(xiàn)其表達(dá)，將為深入開展gyv8蛋白抗原及其抗體檢測、血清學(xué)調(diào)查，明確gyv8在雞群以及人群中的感染復(fù)制情況提供有效診斷試劑；并為探究gyv8vp3生物學(xué)功能具有重要意義。

在傳統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建中，往往需要設(shè)計選擇限制性內(nèi)切酶酶切位點，通過酶切、連接的方法構(gòu)建載體，實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。但有時由于找不到合適的酶切位點，往往導(dǎo)致克隆過程繁瑣，效率低下。本發(fā)明中將利用不依賴于酶切位點及限制性內(nèi)切酶的重組酶exnasetmii體外重組技術(shù)克隆gyv8病毒vp3基因，簡化克隆過程，實現(xiàn)vp3基因快速克隆表達(dá)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供一種gyv8型環(huán)形病毒vp3蛋白及其制備方法。

本發(fā)明所述的gyv8型環(huán)形病毒vp3蛋白的制備方法。是利用pgex-6p-1線性化載體以及gyv8病毒vp3基因片段的引物，利用商品化的重組酶exnasetmii不經(jīng)酶切連接反應(yīng)，直接在體外快速重組克隆vp3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)、實現(xiàn)gyv8的vp3蛋白與gst的融合可溶性表達(dá)，并獲得純化的vp3融合蛋白。

本發(fā)明的方法具體包括以下步驟：

1)利用下述引物，以pgex-6p-1質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增pgex-6p-1線性化載體；

上游引物：5’-taatgacggtgaaaacctctgacacatgc-3’；

下游引物：5’-catgggcccctggaacagaacttccagat-3’。

2)利用下述引物，以puc57-av8vp3質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增出vp3基因；

上游引物：5’-gttccaggggcccatgttgccagatctgac-3’；

下游引物：5’-gttttcaccgtcattaaaaaggggtcgatt-3’。

3)利用重組酶exnasetmii對步驟1)和2)得到的pcr產(chǎn)物在體外進(jìn)行快速重組克隆vp3，陽性克隆經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)，實現(xiàn)gyv8的vp3蛋白與gst的融合可溶性表達(dá)，并獲得純化的vp3可溶性蛋白。

本發(fā)明的方法中，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

40μl水，5μl10倍緩沖液，1μl10mmdntp，1μl10μmol上游引物，1μl10μmol下游引物,1μl10ng/μl的pgex-6p-1質(zhì)?；騪uc57-av8vp3質(zhì)粒，1μl商品化的phantasuper-fidelitydna聚合酶。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃變性3分鐘,隨后進(jìn)行30個循環(huán)，所述循環(huán)為95℃變性10秒,57℃退火30秒，72℃延伸3分鐘；最后72℃延伸10分鐘。

該發(fā)明設(shè)計的引物及基于重組酶exnasetmii的克隆策略，可快速構(gòu)建gyv8病毒vp3基因的原核可溶性表達(dá)載體。本發(fā)明獲得的gyv8vp3可溶性表達(dá)及純化的蛋白，可直接提供vp3可溶性蛋白作為gyv8診斷抗原；作為免疫原獲得抗vp3多克隆抗體；為開展gyv8流行病學(xué)調(diào)查提供有效診斷試劑；并為進(jìn)一步探究vp3生物學(xué)功能具有重要意義。

附圖說明

圖1一種gyv8新型環(huán)形病毒vp3蛋白制備方法策略

步驟1：含gyv8病毒vp3基因的puc57-av8vp3為模版，利用表1中引物，pcr分別擴(kuò)增出含pgex-6p-1線性化載體以及gyv8病毒vp3基因片段。

步驟2：利用重組酶exnasetmii進(jìn)行快速重組克隆。

步驟3：陽性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，實現(xiàn)vp3蛋白可溶性表達(dá)。

步驟4：gyv8病毒vp3可溶性蛋白純化。

圖2pcr擴(kuò)增gyv8病毒vp3片段

泳道1，gyv8病毒vp3片段pcr產(chǎn)物；泳道m(xù)，dnamarker。

圖3pcr擴(kuò)增線性化載體pgex-6p-1

泳道1，線性化載體pgex-6p-1的pcr產(chǎn)物；泳道m(xù)，dnamarker。

圖4sds-page分析gyv8病毒vp3基因的表達(dá)

泳道1，vp3超聲裂解上清；泳道2，gst超聲裂解上清；泳道3，純化的vp3蛋白；泳道m(xù)，蛋白marker。

圖5westernblot鑒定抗gyv8vp3蛋白多克隆抗體

1,轉(zhuǎn)染egfp-vp3表達(dá)質(zhì)粒的293t細(xì)胞裂解物；2，轉(zhuǎn)染對照egfp表達(dá)質(zhì)粒的293t細(xì)胞裂解物。

具體實施方式

為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，以下實施方式結(jié)合附圖給出了gyv8新型環(huán)形病毒vp3可溶性蛋白制備的示例。

實施例

1)設(shè)計擴(kuò)增pgex-6p-1線性化載體以及gyv8病毒vp3基因片段引物：擴(kuò)增pgex-6p-1線性化載體上游引物位于pgex-6p-1質(zhì)粒1022-1047位；且在5’端帶有額外taa堿基；擴(kuò)增pgex-6p-1線性化載體下游引物位于pgex-6p-1質(zhì)粒916-941位；且在5’端帶有額外cat堿基。擴(kuò)增gyv8病毒vp3基因上游引物包括vp3基因起始密碼atg及其后14個堿基，且在5’端帶有15個與pgex-6p-1線性化載體下游引物反向互補(bǔ)的額外堿基；擴(kuò)增gyv8病毒vp3基因下游引物包括vp3基因終止密碼taa及其前14個堿基，且在5’端帶有15個與pgex-6p-1線性化載體上游引物反向互補(bǔ)的額外堿基。具體引物序列見附表1，由金唯智公司合成。

表1.擴(kuò)增pgex-6p-1線性化載體和gyv8病毒vp3片段引物設(shè)計

2)gyv8新型環(huán)形病毒vp3蛋白可溶性表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白純化：以商品化的pgex-6p-1質(zhì)粒以及含gyv8病毒vp3基因的puc57-av8vp3(由金唯智公司合成)為模版，利用表1中引物，按照圖1技術(shù)路線，通過pcr分別擴(kuò)增出含pgex-6p-1線性化載體以及gyv8病毒vp3基因片段；并利用重組酶exnasetmii進(jìn)行快速重組克隆；陽性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，實現(xiàn)vp3蛋白可溶性表達(dá)。

pgex-6p-1線性化載體以及gyv8病毒vp3基因片段pcr擴(kuò)增：以pgex-6p-1質(zhì)粒以及agyv8-vp3質(zhì)粒為模版，表1所述引物為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：40μl水，5μl10倍緩沖液，1μl10mmdntp，1μl10μmol上游引物，1μl10μmol下游引物,1μl10ng/μl的pgex-6p-1質(zhì)?；騪uc57-gyv8vp3質(zhì)粒，1μl商品化的phantasuper-fidelitydna聚合酶。pcr擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃變性3分鐘,隨后進(jìn)行30個循環(huán)(95℃變性10秒,57℃退火30秒，72℃延伸3分鐘),最后72℃延伸10分鐘。pcr結(jié)束后，pcr產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。如圖2所示，a.1、2、3代表線性化pgex-6p-1載體pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，m為gene1kbmarker；b.gyv8-vp3片段pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，m為100bpmarker。

gyv8病毒vp3片段快速克隆進(jìn)pgex-6p-1載體：將以上純化的表達(dá)線性化載體pgex-6p-1以及gyv8病毒vp3片段pcr產(chǎn)物在商品化重組酶exnasetmii的作用下進(jìn)行重組克隆，如圖2、3。具體重組反應(yīng)體系如下：純化的gyv8病毒vp3片段產(chǎn)物50-100ng，純化的pgex-6p-1表達(dá)線性化載體50ng，2μl商品化的exnasetmii酶，4μl5倍的緩沖液，其它補(bǔ)加水至20μl。反應(yīng)物于37℃作用30分鐘后，置冰上5分鐘。隨后將20μl反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到常規(guī)感受態(tài)細(xì)菌，涂lb板。次日挑取細(xì)菌克隆進(jìn)行質(zhì)粒制備，陽性克隆鑒定。

gyv8病毒vp3可溶性蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及其純化:將獲得的含gyv8病毒vp3基因的陽性克隆(命名為pgex-vp3)轉(zhuǎn)化bl21細(xì)菌，按1:100轉(zhuǎn)接種到含有amp+的lb培養(yǎng)基中，搖菌3h后，加入iptg(1mmol/ml)誘導(dǎo)5h后收集細(xì)菌，進(jìn)行超聲40hz，40min破碎。將超聲破碎樣品離心6000r/min,10min后,將超聲破碎樣品離心后分上清與沉淀進(jìn)行sds-page(5％的濃縮膠，10％的分離膠)鑒定其可溶性表達(dá)。在確定vp3的可溶性表達(dá)基礎(chǔ)上，將超聲破碎樣品上清通過gst純化柱進(jìn)行了vp3蛋白的純化，蛋白濃度測定發(fā)現(xiàn)純化后的蛋白濃度為1.0mg/ml。如圖4，可見vp3蛋白在超聲破碎樣品上清中以可溶性形式存在。泳道3是vp3蛋白純化后sds-page分析結(jié)果。

為進(jìn)一步測定純化后蛋白的抗原性，評價其能否作為免疫原及診斷用抗原，將純化的vp3蛋白免疫小鼠，并通過westernblot驗證小鼠血清中抗vp3抗體的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染pcegfp-vp3質(zhì)粒的293t細(xì)胞進(jìn)行裂解，細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行wb的分析，一抗用小鼠三免后的血清，二抗為羊抗鼠hrp標(biāo)記的igg。如圖5，小鼠多抗血清能與轉(zhuǎn)染egfp-vp3的293t細(xì)胞中的約為40kd的特異性蛋白條帶反應(yīng)。結(jié)果表明本發(fā)明表達(dá)的vp3蛋白具有很好的反應(yīng)及免疫原性，在gyv8血清學(xué)診斷中將具有良好的應(yīng)用前景。

sequencelisting

<110>揚(yáng)州大學(xué)

<120>一種gyv8型環(huán)形病毒vp3可溶性蛋白的制備方法

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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