本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，涉及用于鑒定鮭鱒魚(yú)卵和魚(yú)苗是否攜帶傳染性造血器官壞死病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus，ihnv)的檢測(cè)技術(shù)。

背景技術(shù)：

鮭鱒魚(yú)是鮭科(salmonidae)魚(yú)類的統(tǒng)稱，作為重要的冷水性名優(yōu)水產(chǎn)物種，在我國(guó)26個(gè)省市區(qū)都有人工養(yǎng)殖，養(yǎng)殖規(guī)模逐年穩(wěn)步擴(kuò)大，2015年總產(chǎn)量已達(dá)到41，607萬(wàn)噸。傳染性造血器官壞死病(infectioushematopoieticnecrosis，ihn)是一種嚴(yán)重威脅鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的暴發(fā)性疾病，能夠感染大多數(shù)鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖種，其中虹鱒(oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(salmosalar)等感染后死亡率高達(dá)90％以上，且缺乏有效的治療藥物。目前在鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)中，防控病害較為有效的方式是倡導(dǎo)“生物安保(biosecurity)”風(fēng)險(xiǎn)管理理念，從切斷病原傳播途徑入手，通過(guò)對(duì)特定病原的監(jiān)測(cè)，防范疫病傳入，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)健康養(yǎng)殖管理。

ihnv屬于彈狀病毒科(rhabdoviridae)，諾拉彈狀病毒屬(novirhabdovirus)，是一種單鏈負(fù)義rna病毒，20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，早期主要在北美傳播，1968年在日本北海道被報(bào)道，1987年傳入法國(guó)和意大利，隨后在歐洲暴發(fā)性流行。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒主要通過(guò)病魚(yú)或被污染的魚(yú)卵在不同地域傳播，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(法語(yǔ)officeinternationaldesépizooties，oie)將其列入《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》。

1985年我國(guó)首例虹鱒ihn疫情在黑龍江省爆發(fā)，事后調(diào)查其傳染源可能為自美國(guó)引種的銀鮭(oncorhynchuskisutch)，銀鮭能感染并攜帶ihnv，但不表現(xiàn)出嚴(yán)重癥狀，由于鮭鱒魚(yú)通常為流水養(yǎng)殖模式，病毒在同一水域養(yǎng)殖的鮭鱒魚(yú)間極易擴(kuò)散傳播，形成暴發(fā)性流行。此后三十余年間，ihnv曾在黑龍江、遼寧、青海、山西、北京、甘肅等多地出現(xiàn)，中國(guó)農(nóng)業(yè)部和國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局均將其列為二類動(dòng)物疫病。

oie《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》推薦的ihnv診斷方法包括臨床癥狀診斷、病毒分離、組織病理切片、電子顯微鏡、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscriptionpcr，rt-pcr)、間接免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、中和實(shí)驗(yàn)等，其中病毒分離結(jié)合rt-pcr為檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是，上述方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，病毒分離還需要在特定細(xì)胞系中進(jìn)行病毒培養(yǎng)，對(duì)檢測(cè)設(shè)備和操作人員的要求較高，不易在苗種場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)等生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)場(chǎng)所推廣。

因此，亟待開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便快速的ihnv檢測(cè)技術(shù)，在苗種場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)進(jìn)外來(lái)鮭鱒魚(yú)卵、魚(yú)苗時(shí)，用于鑒定苗種是否攜帶ihnv，降低疫病傳入的風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題和/或缺陷，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法。

為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，包括：

步驟一、提取到待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品的rna；

步驟二、以所述rna為模板，以如seqidno：1、2、3和4所示的核苷酸序列作為引物，且該引物中的至少一種引物上攜帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系，向該體系中添加部分帶有錨定標(biāo)記分子的dntp，對(duì)待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品的rna進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增反應(yīng)液；

步驟三、首先將所述擴(kuò)增反應(yīng)液加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行錨定反應(yīng)，之后檢測(cè)所述電極表面是否存在所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，若能夠檢測(cè)到所述電化學(xué)標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，表明所述待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品攜帶有ihnv。若檢測(cè)不到電化學(xué)電子標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，則表明所述待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品不攜帶有ihnv。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述步驟二中，還以如seqidno5和6所示的核苷酸序列作為引物。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述步驟二中，seqidno：3所示的核苷酸序列帶有所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述步驟二中，seqidno：4所示的核苷酸序列帶有所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述步驟二中，所述部分帶有錨定標(biāo)記分子標(biāo)定的的dntp的用量為總dntp用量的5％～8％。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述步驟二中，所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系的反應(yīng)溫度為60-65℃，反應(yīng)時(shí)間15-30min。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述步驟三中，所述錨定反應(yīng)條件為溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間15-30min。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述的電化學(xué)活性標(biāo)記分子為二茂鐵及其衍生物、鐵氰化鉀、硫堇、鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、稀土單酞菁、銥氯水配合物、血紅蛋白和肌紅蛋白中的任意一種。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述錨定分子為生物素、親和素、抗原、抗體、抗抗體、細(xì)胞因子、受體和核酸適配體中的任意一種。

優(yōu)選的是，所述的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法中，所述步驟三中，將所述擴(kuò)增反應(yīng)液加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行錨定反應(yīng)之后，洗脫掉電極表面未結(jié)合的擴(kuò)增反應(yīng)液，然后在進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)，其中，洗脫的方法為：使用ph7.0的tris-edta緩沖液洗脫3次，每次洗脫2min。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便易行的ihnv檢測(cè)技術(shù)，dna擴(kuò)增在恒溫下進(jìn)行，且無(wú)須精準(zhǔn)控溫和計(jì)時(shí)，可使用簡(jiǎn)易水浴鍋和普通計(jì)時(shí)器完成擴(kuò)增和錨定反應(yīng)，不涉及復(fù)雜操作和精密儀器，適用于苗種場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)等生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)性場(chǎng)所的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

本發(fā)明將rna逆轉(zhuǎn)錄與dna擴(kuò)增整合在同一體系中完成，并提供6條引物同時(shí)進(jìn)行環(huán)式擴(kuò)增，所需反應(yīng)時(shí)間短，包括rna提取在內(nèi)的全部檢測(cè)操作能夠在90min內(nèi)完成，適合快速檢測(cè)。

本發(fā)明中核酸擴(kuò)增靶標(biāo)為基質(zhì)蛋白(matrixprotein，m)編碼基因，通過(guò)對(duì)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中不同株系來(lái)源的357條ihnv基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，證實(shí)m基因在ihnv基因組內(nèi)的6個(gè)編碼基因中保守性最高，基于該基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，能夠有效避免由于病毒變異過(guò)快而造成的假陽(yáng)性結(jié)果，保證檢測(cè)準(zhǔn)確率。

本發(fā)明基于電化學(xué)生物傳感檢測(cè)原理，不使用任何有毒有害試劑，檢測(cè)操作全程不存在人身健康或環(huán)境污染隱患。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中ihnv特異性引物的基因組位置比對(duì)圖，所示為ihnv中國(guó)株ch20101008的m基因編碼區(qū)完整序列(ncbi序列號(hào)kj421216.1)，序列下方數(shù)字表示該堿基在m基因上的位置，序列下方星號(hào)顯示序列中的保守性堿基，序列下方下劃線顯示序列中的可變堿基，陰影區(qū)所示堿基為ihnv特異性引物片段；

圖2為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中檢測(cè)感染ihnv的虹鱒魚(yú)苗的循環(huán)伏安信號(hào)，線型ⅰ表示感染ihnv的虹鱒魚(yú)苗樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，線型ⅱ表示未攜帶ihnv病毒的虹鱒魚(yú)苗樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，線型ⅲ表示ihnv-m基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)(正對(duì)照)；

圖3為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中檢測(cè)攜帶ihnv的金鱒魚(yú)卵的循環(huán)伏安信號(hào)，線型ⅰ表示攜帶ihnv的金鱒魚(yú)卵樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，線型ⅱ表示未攜帶ihnv病毒的金鱒魚(yú)卵樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，線型ⅲ表示ihnv-m基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)(正對(duì)照)；

圖4為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中檢測(cè)ihnv傳感器工作曲線，右下插圖顯示線性范圍內(nèi)(每μl擴(kuò)增模板ihnv拷貝數(shù)為10²至10¹¹)的擬合直線y＝92.983+49.14823x(r²＝0.99653)，誤差棒顯示5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于鑒定鮭鱒魚(yú)苗種是否攜帶傳染性造血器官壞死病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus，ihnv)的生物傳感檢測(cè)方法。該方法基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中不同株系來(lái)源的ihnv基因序列保守性分析結(jié)果，設(shè)計(jì)了以ihnv病毒基質(zhì)蛋白(matrixprotein，m)編碼基因?yàn)閿U(kuò)增靶點(diǎn)的6條特異性引物，對(duì)待測(cè)魚(yú)卵或魚(yú)苗樣品總rna模板進(jìn)行快速的恒溫逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)間僅需15-30min。擴(kuò)增反應(yīng)中全部或部分引物帶有電化學(xué)活性標(biāo)記，核酸鏈延伸的底物dntp中部分帶有錨定標(biāo)記，因此成功擴(kuò)增的病毒m基因序列同時(shí)帶有電化學(xué)活性標(biāo)記和錨定標(biāo)記，能夠利用錨定標(biāo)記將擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲在電極表面，通過(guò)檢測(cè)電極表面的電化學(xué)信號(hào)，準(zhǔn)確判定樣品是否攜帶ihnv病毒。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，對(duì)設(shè)備精密度要求較低，適用于苗種場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)等生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)性場(chǎng)所的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

如圖1～4所示，本發(fā)明提供一種用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，包括：

步驟一、提取到待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品的rna；采集新鮮的待測(cè)魚(yú)卵或魚(yú)苗內(nèi)臟，直接提取rna，或于液氮、rna貯存液等保護(hù)劑中保存運(yùn)輸，3個(gè)月內(nèi)提取rna。

步驟二、以所述rna為模板，以如seqidno：1、2、3和4所示的核苷酸序列作為引物，且該引物中的至少一種引物上攜帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子，包括一種、兩種、三種、四種、五種或者全部引物都攜帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系，向該體系中添加部分帶有錨定標(biāo)記分子的dntp，及rna逆轉(zhuǎn)錄酶、bstdna聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dntp)、可溶性鎂鹽、bstdna聚合酶緩沖液和無(wú)菌去離子水等，對(duì)待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品的rna進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增反應(yīng)液；

步驟三、首先將所述擴(kuò)增反應(yīng)液加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行錨定反應(yīng)，之后檢測(cè)所述電極表面是否存在到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，若能夠檢測(cè)到所述電化學(xué)標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，表明所述待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品攜帶有ihnv。若檢測(cè)不到電化學(xué)電子標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，則表明所述待測(cè)鮭鱒魚(yú)樣品不攜帶有ihnv。

本發(fā)明基于生物傳感原理的檢測(cè)技術(shù)，使用ihnv病毒特異性引物對(duì)待測(cè)樣品核酸進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物帶有電化學(xué)活性標(biāo)記，而核酸鏈延伸的底物dntp中部分帶有錨定標(biāo)記，使得成功擴(kuò)增的病毒m基因序列同時(shí)帶有電化學(xué)活性標(biāo)記和錨定標(biāo)記，然后利用錨定標(biāo)記將擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲在電極表面，檢測(cè)電極表面的電化學(xué)活性，從而準(zhǔn)確判定樣品是否攜帶ihnv病毒。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述步驟二中，還以如seqidno：5和6所示的核苷酸序列作為引物。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述步驟二中，seqidno：3所示的核苷酸序列帶有所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子。

在上述方案中，作為優(yōu)選，所述步驟二中，seqidno：4所示的核苷酸序列帶有所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述步驟二中，所述部分帶有錨定標(biāo)記分子標(biāo)定的的dntp的用量為datp用量的20％～30％，占dntp用量的5％-8％。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述步驟二中，所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系的反應(yīng)溫度為60-65℃，反應(yīng)時(shí)間15-30min。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述步驟三中，所述錨定反應(yīng)條件為溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間15-30min。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述的電化學(xué)活性標(biāo)記分子為能夠發(fā)生可逆或準(zhǔn)可逆氧化還原反應(yīng)的分子，為二茂鐵及其衍生物、鐵氰化鉀、硫堇、鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、稀土單酞菁、銥氯水配合物、血紅蛋白、肌紅蛋白等，其中優(yōu)選的是，所述的電化學(xué)活性標(biāo)記分子為二茂鐵，對(duì)應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)為循環(huán)伏安信號(hào)或交流阻抗信號(hào)。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述的錨定分子為能夠與其受體發(fā)生特異性穩(wěn)定結(jié)合，且親和常數(shù)在10⁶m^-1以上的分子，為生物素、親和素、抗原、抗體、抗抗體、細(xì)胞因子、受體、核酸適配體等，其中優(yōu)選的是，所述的錨定標(biāo)記分子為生物素，對(duì)應(yīng)的錨定受體為親和素或鏈霉親和素。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述步驟三中，將所述擴(kuò)增反應(yīng)液加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行錨定反應(yīng)之后，洗脫掉電極表面未結(jié)合的擴(kuò)增反應(yīng)液，然后在進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)，其中，洗脫的方法為：使用ph7.0的tris-edta緩沖液洗脫3次，每次洗脫2min。

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，還提供如下說(shuō)明及實(shí)施例1至4。

本發(fā)明中，樣品前處理過(guò)程包括組織采集和rna提取。若待測(cè)樣品為魚(yú)卵或小規(guī)格苗種，直接收集并置于適量組織裂解液(或rna保護(hù)劑)中即可；若待測(cè)樣品為大規(guī)格苗種，需解剖采集內(nèi)臟并置于適量組織裂解液(或rna保護(hù)劑)中。rna提取可使用常規(guī)市售試劑盒完成。

本發(fā)明中，檢測(cè)對(duì)象ihnv為rna病毒，需將其逆轉(zhuǎn)錄為dna進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)反應(yīng)體系調(diào)整和優(yōu)化，逆轉(zhuǎn)錄和dna擴(kuò)增可在同一反應(yīng)體系中完成，且無(wú)須添加額外的隨機(jī)引物。反應(yīng)體系的必需組分包括4條ihnv特異性引物、待測(cè)樣本rna、rna逆轉(zhuǎn)錄酶、bstdna聚合酶、dntp、帶有錨定標(biāo)記分子的一種dntp(通常為dutp)、可溶性鎂鹽(提供鎂離子)、bstdna聚合酶緩沖液和無(wú)核酸酶滅菌去離子水，可添加組分為2條環(huán)引物和甜菜堿。

本發(fā)明中，各引物序列如下：

seqidno:1：acgaggagagggtgacaat

seqidno:2：tctgaggtgcgggtttcc

seqidno:3：gcagccgccagattcatagagtcagagggggagatcaaggt

seqidno:4：tcgtagggggagatctacaccctcttgggtgcttccgaact

seqidno:5：cctcaagtgtggttggtcttc

seqidno:6：aatccatgacctttctgttcca

其中，seqidno:1-4為必需引物，seqidno:5和seqidno:6為可選引物。

本發(fā)明中，全部或部分引物帶有電化學(xué)活性標(biāo)記，標(biāo)記位于引物5’端，不影響擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，底物中一定比例的dntp帶有錨定標(biāo)記，攜帶有ihnv的樣本將成功擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有電化學(xué)活性標(biāo)記，中段帶有錨定標(biāo)記，能夠被偶聯(lián)有錨定受體的電極表面所捕獲，并產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。而未攜帶ihnv的樣本無(wú)法擴(kuò)增，模板、引物及反應(yīng)液中的多數(shù)組分將被洗脫，無(wú)法留在電極表面，帶有錨定標(biāo)記的dntp雖然也能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在電極表面，但不帶有電化學(xué)活性標(biāo)記，因而無(wú)法產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用一個(gè)攜帶ihnv-m基因序列的質(zhì)粒充當(dāng)正對(duì)照，指示所有反應(yīng)流程正常進(jìn)行，若通用對(duì)照質(zhì)粒檢測(cè)電極無(wú)信號(hào)，提示應(yīng)排查試劑和儀器等檢測(cè)條件問(wèn)題。

實(shí)施例1鑒定虹鱒魚(yú)苗是否感染ihnv

1.溶液配制

定制合成堿基序列如seqidno：1-6所示引物(上海生工)，各引物5’端均帶有二茂鐵修飾，溶于無(wú)核酸酶的滅菌去離子水，配制成含有引物seqidno：1和seqidno：2各1μm，引物seqidno：3和seqidno：4各8μm，引物seqidno：5和seqidno：6各2μm的引物使用液，其中引物seqidno：3和seqidno：4上游帶有二茂鐵標(biāo)記。

使用無(wú)核酸酶的滅菌去離子水配制dntp使用液，該溶液含有datp、dctp、dgtp各10mm，dttp8mm，biotin-16-dutp2mm。

2.總rna提取

待測(cè)虹鱒魚(yú)苗體長(zhǎng)約2-3cm，解剖5尾取內(nèi)臟混合，液氮研磨，使用rnasimple總rna提取試劑盒(天根dp419)，按照說(shuō)明書(shū)步驟提取待測(cè)樣品總rna，溶于50μl無(wú)核酸酶滅菌去離子水，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，調(diào)整至rna濃度為100ng/μl左右。

3.核酸擴(kuò)增

待測(cè)樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

ihnv-m質(zhì)粒正對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

將各反應(yīng)管置于60℃水浴中反應(yīng)30min。

4.電極表面修飾

使用al2o3粉末對(duì)金電極進(jìn)行拋光，超聲波清洗5min，浸入納米金溶液(sigma，檸檬酸鈉還原氯金酸法制備，粒徑30nm)，+1.55v電位下沉積15min，靜置5min，無(wú)核酸酶滅菌去離子水清洗。

電極表面浸入含10mmα-硫辛酸的乙醇溶液活化20min，移入濃度為100g/l的edc/nhs混合液活化羧基，向電極表面滴加0.2g/l的親和素50μl，偶聯(lián)30min，去離子水洗脫未結(jié)合親和素。超凈臺(tái)風(fēng)干后可4℃長(zhǎng)期保存，12個(gè)月內(nèi)均可用于檢測(cè)。短期保存可置于室溫ph7.0磷酸緩沖液中。

將各管擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，分別滴加在不同的修飾電極表面，37℃溫育20min。

將dna修飾電極浸入ph7.0tris-edta緩沖液，洗脫2min，換新的緩沖液重復(fù)2次。

5.電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)

采用三電極測(cè)試系統(tǒng)，以dna修飾電極為工作電極，鉑絲(直徑1mm)為對(duì)電極，ag/agcl為參比電極，20mlph7.0磷酸緩沖溶液為支持電解質(zhì)，分別測(cè)定各電極的循環(huán)伏安曲線，初始電位設(shè)為0mv，折回電位設(shè)為+600mv，掃描速度設(shè)為50mv/s，記錄3個(gè)循環(huán)中的第3個(gè)。

6.檢測(cè)結(jié)果

虹鱒魚(yú)苗樣品檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，細(xì)實(shí)線表示感染ihnv的虹鱒魚(yú)苗樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，點(diǎn)線表示未攜帶ihnv病毒的虹鱒魚(yú)苗樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，粗虛線表示ihnv-m基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)(正對(duì)照)，圖中可見(jiàn)感染ihnv的虹鱒魚(yú)苗樣品曲線與正對(duì)照相似，呈現(xiàn)明顯的氧化還原峰，氧化峰電位位于+476mv，氧化峰電流值為+564na，還原峰電位位于+266mv，還原峰電流值為-594na，氧化還原峰電位差約為210mv；而未感染ihnv的虹鱒魚(yú)苗樣品曲線平緩，無(wú)明顯的氧化還原峰。

實(shí)施例2鑒定金鱒魚(yú)卵是否攜帶ihnv

1.溶液配制

定制合成堿基序列如seqidno：1-6所示引物(上海生工)，引物seqidno：1-4的5’端均帶有二茂鐵修飾，溶于無(wú)核酸酶的滅菌去離子水，配制成含有引物seqidno：1和seqidno：2各1μm，引物seqidno：3和seqidno：4各8μm，引物seqidno：5和seqidno：6各2μm的引物使用液，其中引物seqidno：3和seqidno：4上游帶有二茂鐵標(biāo)記。

使用無(wú)核酸酶的滅菌去離子水配制dntp使用液，該溶液含有datp、dctp、dgtp各10mm，dttp8mm，biotin-16-dutp2mm。

2.總rna提取

取待測(cè)金鱒魚(yú)卵約20?；旌?，液氮研磨，使用rnasimple總rna提取試劑盒(天根dp419)，按照說(shuō)明書(shū)步驟提取待測(cè)樣品總rna，溶于50μl無(wú)核酸酶滅菌去離子水，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，調(diào)整至rna濃度為100ng/μl左右。

3.核酸擴(kuò)增

待測(cè)樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

ihnv-m質(zhì)粒正對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

將各反應(yīng)管置于60℃水浴中反應(yīng)30min。

4.電極表面修飾

同實(shí)施例1。

5.電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)

同實(shí)施例1。

6.檢測(cè)結(jié)果

金鱒魚(yú)卵樣品檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，細(xì)實(shí)線表示攜帶ihnv的金鱒魚(yú)卵樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，點(diǎn)線表示未攜帶ihnv病毒的金鱒魚(yú)卵樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)，粗虛線表示ihnv-m基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)(正對(duì)照)，圖中可見(jiàn)攜帶ihnv的金鱒魚(yú)卵樣品曲線與正對(duì)照相似，呈現(xiàn)明顯的氧化還原峰，氧化峰電位位于+480mv，氧化峰電流值為+368.5na，還原峰電位位于+276mv，還原峰電流值為-303na，氧化還原峰電位差約為204mv，其氧化還原峰電流值顯著低于正對(duì)照，表明樣品中ihnv拷貝數(shù)較低；而未攜帶ihnv病毒的金鱒魚(yú)卵樣品曲線平緩，無(wú)明顯的氧化還原峰。

實(shí)施例3ihnv的定量檢測(cè)

1.溶液配制

同實(shí)施例1。

2.ihnv對(duì)照質(zhì)粒提取

依據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)ihnv中國(guó)株ch20101008全基因組序列(kj421216.1)，人工合成基質(zhì)(matrix，m)基因及其兩端側(cè)翼各10bp序列(2245-2852)，共計(jì)608bp，連接至pgm-t載體中，構(gòu)建成分子量為3639bp的ihnv對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化dh5α大腸桿菌，擴(kuò)大培養(yǎng)。使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒(天根dp108)提取質(zhì)粒，10倍濃度梯度稀釋，配制成每1μl體積分別含有1-10¹³個(gè)質(zhì)?？截惖娜芤?。

3.核酸擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

將各反應(yīng)管置于60℃水浴中反應(yīng)30min。

4.電極表面修飾

同實(shí)施例1。

5.電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)

同實(shí)施例1。

6.檢測(cè)結(jié)果

使用梯度稀釋的ihnv對(duì)照質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)cv信號(hào)，以氧化峰電流值構(gòu)建傳感器工作曲線，結(jié)果如圖4所示。在每μl模板ihnv拷貝數(shù)為10²至10¹¹的區(qū)間內(nèi)，模板拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與氧化峰電流值呈線性關(guān)系，擬合方程為y＝92.983+49.14823x(r²＝0.99653)，線性范圍之外工作曲線斜率降低。根據(jù)工作曲線，在信噪比為3的時(shí)，ihnv傳感器最低檢測(cè)限為6.2拷貝/μl。

實(shí)施例4ihnv診斷靈敏性和診斷特異性評(píng)估

1.真陽(yáng)性樣本采集

將按照oie《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》(2015版)病毒分離結(jié)合rt-pcr方法，檢測(cè)呈ihnv陽(yáng)性的樣本視為真陽(yáng)性樣本，收集真陽(yáng)性虹鱒魚(yú)苗樣本50例。

2.真陰性樣本采集

將ihnv不易感魚(yú)類鯉魚(yú)視為真陰性樣本，收集真陰性鯉魚(yú)魚(yú)苗樣本50例。

3.樣本ihnv檢測(cè)

應(yīng)用本發(fā)明對(duì)真陽(yáng)性和真陰性樣品各50例進(jìn)行ihnv檢測(cè)，具體步驟同實(shí)施例1。

本發(fā)明方法對(duì)所有真陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。對(duì)所有真陰性樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

4.診斷靈敏性和診斷特異性評(píng)估

依據(jù)oie《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》(2015版)第1.1.2章所規(guī)定，

診斷靈敏性＝真陽(yáng)性檢出數(shù)/(真陽(yáng)性檢出數(shù)+假陽(yáng)性檢出數(shù))

診斷特異性＝真陰性檢出數(shù)/(真陰性檢出數(shù)+假陰性檢出數(shù))

計(jì)算獲得本方法診斷靈敏度為100％，診斷特異性為100％。

這里說(shuō)明的模塊數(shù)量和處理規(guī)模是用來(lái)簡(jiǎn)化本發(fā)明的說(shuō)明的。對(duì)本發(fā)明的用于鮭鱒魚(yú)苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法的應(yīng)用、修改和變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。

如上所述，本發(fā)明基于電化學(xué)生物傳感檢測(cè)原理，不使用任何有毒有害試劑，檢測(cè)操作全程不存在人身健康或環(huán)境污染隱患，不涉及復(fù)雜操作和精密儀器，適用于苗種場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)等生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)性場(chǎng)所的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。

sequencelisting

<110>中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院

<120>鮭鱒魚(yú)中hinv的生物傳感檢測(cè)方法

<130>2016

<160>6

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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