本發(fā)明一般涉及乙型病毒性肝炎的診斷和治療，以及感染病學、分子生物學、細胞生物學等領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種血液中乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)pgrna的熒光定量pcr檢測方法。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)感染呈世界流行，但不同地區(qū)hbv感染的流行強度差異很大。我國屬于hbv感染中高流行地區(qū)。2006年全國hbv血液流行病學調(diào)查顯示，我國1～59歲一般人群中hbsag攜帶率為7.18％。據(jù)此推算，我國慢性hbv感染者約為9300萬人，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者約2000萬例。在我國，慢性hbv感染與肝硬化、肝癌等終末期肝病的發(fā)生密切相關。目前治療慢乙肝的藥物主要為干擾素和核苷(酸)類似物兩類。兩類藥物均可高效抑制hbv復制，但由于肝細胞內(nèi)共價閉合環(huán)狀dna(covalentlyclosedcirculardna,cccdna)的持續(xù)存在，使得目前慢乙肝治療的臨床治愈率很低(<5％)，停藥后慢乙肝復發(fā)率較高，因此慢乙肝患者需要長期甚至終身服藥。長期服藥會給患者甚至社會帶來極大的負擔，并且在治療過程中有可能會導致hbv耐藥株的出現(xiàn)?；诖?，目前迫切需要一種更加靈敏和精確的血液學指標，用于監(jiān)測慢乙肝治療的療效和安全停藥。

多篇文章已經(jīng)證實血液中存在hbvrna，具體的，hbvrna可以存在于血清和/或血漿中，并且其水平與慢乙肝治療的療效和預后密切相關。然而，目前用于檢測血液hbvrna的熒光定量pcr方法的靈敏度和特異度均有待改善。發(fā)明人在前期研究中系統(tǒng)證實了血液中hbvrna的存在形式和產(chǎn)生機制，其是存在于核衣殼內(nèi)的hbvpregenomerna(pgrna)在未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄或不完全逆轉(zhuǎn)錄的情況下分泌至細胞外的。由此可見，血液中的hbvrna實際上為pgrna。定量檢測血液hbvpgrna的水平可更好地監(jiān)測肝細胞內(nèi)hbvcccdna的水平，不失為一種良好的檢測慢乙肝治療療效和安全停藥的預測指標。開發(fā)定量檢測血液中pgrna的診斷試劑或試劑盒對于臨床上慢乙肝的有效治療和安全停藥具有重要的指導意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明一方面提供了一種血液hbvpgrna熒光定量pcr檢測體系包括：正向引物，其核苷酸序列如seqno:1所示；反向引物，其核苷酸序列如seqno:2所示；以及反向錨定引物，其核苷酸序列如seqno:3所示。

其中，正向引物seqno:1為agaccaccaaatgcccct；反向引物seqno:2為(n)16-30。(n)16-30是指作為隨機錨定序列的核苷酸序列，n可為a、t、c或g，且下角標處16-30表示堿基數(shù)目。反向錨定引物seqno:3為(n)16-30-aggcgagggagttcttcttcta。seqno:2和seqno:3中的(n)16-30表示相同的隨機錨定序列。本領域技術(shù)人員知曉，雖然(n)16-30為隨機序列，但為了保證擴增的效率，其應避免設計成為與hr-f或probe-hr形成引物二聚體。此外，為了增加擴增的效率，在引物兩端添加隨機堿基后形成的引物序列也涵蓋在本發(fā)明中。

在本發(fā)明的一些實施例中，血液hbvpgrna熒光定量pcr檢測體系還包括探針，其核苷酸序列如seqno:4所示。其中，探針seqno:4為caacacttccggaractactgttgttagacg。

在本發(fā)明的一些具體實施例中，血液hbvpgrna熒光定量pcr檢測體系中，所述探針為taqman探針、mgb探針、雜交探針中的一種。標記所述探針5’端的是一種熒光發(fā)光基團，其是fam、vic、tet、joe、rox、cy3、cy5、hex中的一種；并且標記所述探針3’端的是一種熒光猝滅基團，其是bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl、nfq中的一種。

本發(fā)明的另一方面還提供了如前所述的血液hbvpgrna熒光定量pcr檢測體系在制備hbv診斷試劑或試劑盒中的應用。

本發(fā)明的又一方面還提供了一種血液hbvpgrna熒光定量pcr檢測方法，包括：

步驟1.以待測血液hbvpgrna為模板，用序列如seqno：3的引物進行逆轉(zhuǎn)錄；

步驟2.以獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用序列如seqno：1和2的引物和序列如seqno：4的探針進行擴增，以定量檢測血液中的hbvpgrna。

在本發(fā)明的一些實施例中，步驟2還可以為以獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用序列如seqno：1和2的引物進行擴增，并摻入熒光染料，以sybrgreen法定量檢測血液中的hbvpgrna。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明首次根據(jù)hbvpgrna的特點在pgrna的5’端設計了針對不同基因型hbv高度保守的特異性引物和探針，這樣就排除了其它hbvrna帶來的可能干擾。除此之外，本發(fā)明還在逆轉(zhuǎn)錄引物上加上了一段人工設計的錨定序列用來排除在檢測過程中hbvdna帶來的可能干擾，確保了血液hbvpgrna檢測的特異性。

本發(fā)明的特異性引物和探針可檢測我國存在的所有基因型hbv，包括我國主要存在的b型和c型hbv、在我國新疆、西藏等地分布的d型hbv、以及散發(fā)分布的a型hbv。

本發(fā)明的引物、探針和錨定序列是在最初設計的多條序列的基礎上，通過多輪篩選和優(yōu)化后確定的特異性和靈敏度最優(yōu)的序列。

附圖說明

圖1示出正方向引物，逆轉(zhuǎn)錄引物和對應的探針的設計，其中圖1a通過megalign軟件分析不同基因型hbv的保守序列，圖1b和1c分別示出利用primerpremier5軟件分析錨定序列(反方向引物)和正方向引物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體和錯配的分析情況。

圖2示出利用本發(fā)明實施的血清hbvpgrna熒光定量pcr檢測體系對血液hbvpgrna進行檢測的流程圖。

圖3a示出利用hr-f和hr-r擴增時的溶解曲線；圖3b示出利用非專利文獻1(vanf,etal.serumhepatitisbvirusrnalevelsasanearlypredictorofhepatitisbenvelopeantigenseroconversionduringtreatmentwithpolymeraseinhibitors,hepatology.2015；61:66-76.)中的引物擴增時的溶解曲線；圖3c示出檢測體系中探針用量對熒光定量pcr反應的影響，其中1為體系中加入0.6μl濃度為10μm的探針，2為體系中加入0.8μl濃度為10μm的探針，兩者擴增曲線基本重疊；圖3d示出檢測體系中退火溫度對熒光定量pcr反應的影響，其中分別利用56、58、60、62攝氏度的退火溫度進行定量pcr反應，所得擴增曲線基本重疊。

圖4示出診斷試劑標準品測序結(jié)果。

圖5示出本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法的靈敏度檢測，其中圖5a示出不同終濃度質(zhì)粒經(jīng)過檢測后的ct值，圖5b示出利用濃度和ct值構(gòu)建的標準曲線，圖5c示出熒光定量pcr最終得到的擴增曲線。

圖6示出非專利文獻1中報道的血清hbvrna熒光定量檢測方法的靈敏度評價，其中，圖6a示出不同終濃度質(zhì)粒經(jīng)過檢測后的ct值，圖6b示出利用濃度和ct值構(gòu)建的標準曲線，圖6c示出熒光定量pcr最終得到的擴增曲線。

圖7示出對不同基因型hbvpgrna的水平檢測，其中，圖7a示出慢性乙肝患者血清中b基因型hbv的檢測結(jié)果，圖7b示出慢性乙肝患者血清中c基因型hbv的檢測結(jié)果，圖7c示出hepad38細胞上清的檢測結(jié)果，該種細胞分泌產(chǎn)生d基因型hbv。

圖8示出本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法對hbvpgrna的特異性評價，其中，圖8a示出利用本發(fā)明的定量pcr體系檢測不同的模板，其中1為將提取出的hbv核酸混合物經(jīng)dnasei處理后利用引物hr-rt進行逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物；2為提取出的、未經(jīng)處理的hbv核酸混合物；3為經(jīng)dnasei處理后的hbv核酸混合物，圖8b示出正常人血液經(jīng)過核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄處理后進行定量檢測的結(jié)果，其中4為慢性乙肝患者血清的陽性對照；5和6為正常人血清的檢測結(jié)果。

圖9示出質(zhì)粒濃度為1×103copies/ml標準品的重復性檢測結(jié)果。

具體實施方式

除非特別說明，本發(fā)明的術(shù)語具有本領域通常使用的含義。

術(shù)語“核苷酸”旨在包括那些不僅含有已知的嘌呤和嘧啶堿基還含有經(jīng)修飾的其他雜環(huán)堿基的部分。此類修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶、?；堰驶蜞奏?、烷基化核糖或其他雜環(huán)化合物。此外，術(shù)語“核苷酸”包括那些含有半抗原或熒光標記以及可以不僅含有常規(guī)核糖和脫氧核糖還含有其他糖的部分。修飾的核苷或核苷酸還可以在糖部分上包含修飾，例如，其中一個或多個羥基被鹵素原子或脂族基團取代，被官能化為醚、胺等等。

術(shù)語“引物”是指長度通常為約20至30個堿基的、短的、化學合成的寡核苷酸。它們與靶dna雜交，然后靶dna通過dna聚合酶復制產(chǎn)生互補的dna鏈。“正向引物”和“反向引物”構(gòu)成pcr中所用的“pcr引物組”，其中它們與互補的dna鏈雜交，并指導向著彼此復制，分別產(chǎn)生上鏈和下鏈，導致靶dna片段以指數(shù)增長。

根據(jù)本發(fā)明的方法包含對rna的(優(yōu)選地3'聚腺苷酸)尾和用于反轉(zhuǎn)錄的(聚腺苷酸)尾上游的最近的1到10個核苷酸，優(yōu)選地1到5個核苷酸，更優(yōu)選地3到5個核苷酸特異的引物和/或一個對cdna的相應的(5'聚胸苷酸)序列特異的擴增引物，該序列對rna尾(3'聚腺苷酸)尾和cdna的相應的(5'聚胸苷酸)序列下游的最近的的1到10個核苷酸，優(yōu)選1到5個核苷酸，更優(yōu)選3到5個核苷酸互補。相應地，除前述公開的引物外，可增加引物對的選擇能力并因而增加被最接近末端序列錨點的特定核苷酸所確定的cdna群的數(shù)目。

術(shù)語“錨定引物”是指在基因特異性引物的5’末端加入一段修飾序列(包括酶切位點、標簽序列和人工設計的隨機序列等)，然后通過逆轉(zhuǎn)錄或pcr擴增將該修飾序列錨定在目的基因上，最終以該錨定序列作為引物進行后續(xù)檢測。在一定程度上可提高特定基因檢測的特異性。

術(shù)語“探針”是指用捕獲標記或檢測標記來標記引物，檢測引物產(chǎn)物。探針序列用于與引物序列所產(chǎn)生的序列進行雜交，并且通常與不包括引物序列的序列雜交。與引物序列類似，探針序列也用捕獲標記或檢測標記來標記，需說明的是當引物用捕獲標記來標記時，用檢測標記來標記探針，反之亦然。在本發(fā)明中探針可以為taqman探針、mgb探針、雜交探針中的一種。比如，所述探針為taqman探針，標記探針5’端的為一種熒光發(fā)光基團，其是fam、vic、tet、joe、rox、cy3、cy5、hex中的一種；標記探針3’端為一種熒光猝滅基團，其是bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl、nfq中的一種。

下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步的闡述說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不在于限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的。

1.引物和探針的設計

目前，hbv分為至少10種基因型，在我國存在a～d4種基因型。根據(jù)我國存在的hbv基因型，發(fā)明人從genbank中下載多條a～d基因型hbv參考序列，通過megalign軟件分析不同基因型hbv基因組的保守區(qū)域。遵循引物和探針的設計原則，在這些保守區(qū)域中通過primerpremier5軟件設計出針對pgrna檢測的特異性引物和探針序列。為排除hbvdna的干擾，發(fā)明人在逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端加入了一段隨機錨定序列。在上述引物、探針和隨機錨定序列設計過程中，盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯配的形成。此外，發(fā)明人通過ncbiblast在線數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)對上述設計的hbv特異性引物和探針序列以及隨機錨定序列進行比對分析避免與其它病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。通過多輪篩選和優(yōu)化，最終確定一套靈敏度和特異度最優(yōu)的引物、探針和隨機錨定序列，序列如表1所示。hbv特異性序列均為a～d基因型hbv的高度保守序列(見圖1a)。

表1.引物序列

其中，probe-hr的5’端熒光探針為fam，3’端熒光探針為bhq1。hr-r1、hr-rt1序列的下劃線部分為相同的隨機錨定序列，hr-r2、hr-rt2序列的下劃線部分為相同的隨機錨定序列。如本領域技術(shù)人員所知，發(fā)明人通過實驗進一步證實，隨機錨定序列不影響檢測的效率，只要盡量不與hr-f或probe-hr形成引物二聚體即可。

2.檢測方法及體系的建立

采用的taqman探針法定量檢測血液hbvpgrna的原理是：先利用加入錨定序列的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物hr-rt將提取出的rna逆轉(zhuǎn)錄為帶有錨定序列的cdna。

具體操作如下，提取后的核酸混合物利用dnasei(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)處理。

dnasei處理體系(10μl)為：

將混合物置于37℃孵育30分鐘后再加入

edtalμl

hr-rt(10μm)lμl

65℃孵育10分鐘

隨后通過revertaidfirststranddnasynthesiskit(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)用將其逆轉(zhuǎn)錄成為cdna。

逆轉(zhuǎn)錄反應體系(20μl)為：

反應條件為：25℃5分鐘，42℃60分鐘，70℃5分鐘。

然后利用hbv特異性正向序列和錨定序列分別作為定量pcr檢測的正向和反向引物進行擴增，taqman探針序列緊靠正向引物(圖2)。為了確定本發(fā)明所確定引物和探針的檢測體系，發(fā)明人首先采用sybrgreen的方法檢測了引物的特異性，并將其擴增的溶解曲線與非專利文獻1中報道的引物做了比較。結(jié)果顯示，本發(fā)明中引物的特異性(圖3a)優(yōu)于非專利文獻1中所使用的引物(圖3b)。此外，發(fā)明人分別嘗試了檢測體系中探針用量和退火溫度兩個關鍵因素對熒光定量pcr反應的影響。結(jié)果顯示，不同濃度的探針(圖3c)和不同退火溫度(圖3d)對于熒光定量pcr反應的擴增強度和靈敏度無明顯影響，所得擴增曲線基本重疊。

最終，采用的熒光定量pcr的反應體系(30μl)如下：

在abisteponeplus熒光定量pcr儀上進行擴增，擴增循環(huán)參數(shù)為50℃，5分鐘，94℃，2分鐘；然后94℃，15秒，58℃，45秒，45個循環(huán)；在每個循環(huán)的延伸階段(58℃)同步多次采集熒光。

另外，可以使用sybr-greeni進行熒光染色。反應體系(20μl)如下：

在abisteponeplus熒光定量pcr儀上進行擴增，擴增循環(huán)參數(shù)為50℃，5分鐘，94℃，2分鐘；然后94℃，15秒，58℃，45秒，45個循環(huán)；在每個循環(huán)的延伸階段(58℃)同步多次采集熒光。加設溶解曲線步驟：95℃，15秒，60℃，1分鐘，然后從60℃梯度升溫，每升高0.3℃采集一次熒光信號，直到溫度升高到到95℃，95℃維持15秒。

3.構(gòu)建診斷試劑標準品

提取hbv穩(wěn)定復制細胞系hepad38細胞培養(yǎng)上清中的hbvpgrna，利用hr-rt逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄后，用hr-f和hr-r進行擴增，將擴增后的目的片段切膠回收后連接至peasy-blunt克隆載體上。經(jīng)測序驗證為裝入的目的片段后，作為實驗室內(nèi)部檢測血液hbvpgrna的標準品使用。

最終目的片段序列為：

agaccaccaaatgcccctatcctatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctgtgtcgtgtgttacggtgtga(seqno:9)

測序驗證的峰圖如圖4所示。

4.靈敏度的檢測

將構(gòu)建好的標準品進行10倍倍比稀釋，濃度分別為1.00e+08、1.00e+07、1.00e+06、1.00e+05、1.00e+04、1.00e+03、1.00e+02、1.00e+01copies/ml。用上述確定的檢測體系和循環(huán)參數(shù)對倍比稀釋的標準品進行定量檢測。結(jié)果顯示，本發(fā)明的熒光定量檢測方法具有較高的靈敏度，線性范圍可低至1.00e+01copies/ml；標準曲線的線性回歸方程為：y＝-3.2645x+40.393，相關系數(shù)的平方r²＝0.9993(圖5)。

與非專利文獻1中報道的血液hbvrna熒光定量檢測方法進行比較，結(jié)果顯示，非專利文獻1所建立的熒光定量pcr方法的擴增標準曲線的線性回歸方程為：y＝-3.4315x+45.463，相關系數(shù)的平方r²＝0.9952(圖6)。以同等濃度的標準品，本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法擴增的ct值較非專利文獻1所建方法低3個循環(huán)以上，表明本發(fā)明的檢測方法更加靈敏。

在檢測質(zhì)粒標準品的基礎上，利用本發(fā)明建立的熒光定量pcr方法檢測了不同基因型(b、c和d基因型)的hbvpgrna的水平，并對其靈敏度進行了評價。

其中b、c型來源于病人的血液，hbvpgrna經(jīng)本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法測量后的濃度分別為1.33e+06、1.50e+06copies/ml，以10倍倍比稀釋，稀釋后的濃度分別為1.33e+05、1.33e+04、1.33e+03、1.33e+02copies/ml，1.50e+05、1.50e+04、1.50e+03、1.50e+02copies/ml。

d型來源是hepad38細胞的上清，hbvpgrna經(jīng)本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法測量后的濃度為3.26e+05copies/ml，以10倍倍比稀釋，稀釋后的濃度為3.26e+04、3.26e+03、3.26e+02、3.26e+01copies/ml。

結(jié)果顯示，在b、c和d基因型hbvpgrna的定量檢測中，本發(fā)明建立的熒光定量pcr方法仍顯示出較高的靈敏度(圖7)。

5.特異性的檢測

使用easypureviralrnakit(transgen，貨號：er201-01)核酸提取試劑盒提取hbv感染者血液中的核酸(包括dna和rna)。該血液中hbvdna載量為9.45e+07copies/ml，hbvpgrna經(jīng)本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法測量所得載量為1.48e+06copies/ml，核酸提取后分為3組，第1組經(jīng)dnasei處理后進行逆轉(zhuǎn)錄反應，第2組不做任何處理，第3組進行dnasei處理；三組同時利用本發(fā)明所建立的熒光定量pcr方法檢測。

結(jié)果顯示，在hbvdna水平(9.45e+07copies/ml)高于hbvpgrna(1.48e+06copies/ml)的血液中，即使提取的核酸不進行dnase的處理，其對hbvpgrna檢測的干擾很小(圖8a中的2)，經(jīng)dnase處理后干擾消失(圖8a中的3)。

除此之外，還檢測了兩例正常人的血液，結(jié)果均低于檢測下限(圖8b中的5和6)。

上述結(jié)果表明，本發(fā)明建立的血液hbvpgrna熒光定量檢測方法具有較高的特異度，即使不經(jīng)dnase預處理，hbvdna對pgrna檢測的干擾微不足道。

6.重復性檢測

選取質(zhì)粒濃度為1.00e+03copies/ml的標準品進行檢測，重復30次。結(jié)果顯示，30次重復檢測的ct值的標準差(sd值)為0.275537，重復性較好(圖9)。

7.臨床樣本的檢測

用本發(fā)明的熒光定量pcr方法對5例未經(jīng)抗病毒治療的慢乙肝患者血液hbvpgrna進行了檢測。同時，血液hbvdna水平經(jīng)商品化的hbvdna定量檢測試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)檢測。

結(jié)果顯示，未經(jīng)抗病毒治療的慢乙肝患者血液中存在一定水平的hbvpgrna，其水平低于hbvdna水平(表2)。

隨后，將上述血液進行10倍倍比稀釋，然后用本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法對不同稀釋度的血液樣本進行檢測。結(jié)果如表3所示，本發(fā)明的熒光定量pcr檢測方法對于臨床樣本的檢測應顯示出較高的靈敏度。

表2.未經(jīng)抗病毒治療的慢乙肝患者血液中hbvdna和hbvpgrna水平

表3.梯度稀釋后的慢乙肝患者血液中hbvpgrna水平

同樣可用sybr-green法定量檢測血清hbvpgrna水平。首先用sybr-green法檢測標準品，并繪制標準曲線，然后按照上述步驟檢測臨床樣本，即可定量檢測血液中的hbvpgrna水平。

sequencelisting

<110>北京大學

<120>一種高度靈敏和特異的血液hbvpgrna熒光定量pcr檢測體系和檢測方法

<130>1700051cn

<150>cn201610202753.x

<151>2016-04-01

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agaccaccaaatgcccct18

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(16)

<223>n=a或g或c或t

<400>2

nnnnnnnnnnnnnnnn16

<210>3

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(16)

<223>n=a或g或c或t

<400>3

nnnnnnnnnnnnnnnnaggcgagggagttcttcttcta38

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

caacacttccggaractactgttgttagacg31

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

agtcagccttacagacgagac21

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tctcagaccgtagcacacgacac23

<210>7

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gtagtcagccttacagacgagacaggcgagggagttcttcttcta45

<210>8

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

attctcagaccgtagcacacgacacaggcgagggagttcttcttcta47

<210>9

<211>114

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

agaccaccaaatgcccctatcctatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacga60

ggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctgtgtcgtgtgttacggtgtga114