本發(fā)明涉及一種產(chǎn)菊粉酶、酶解菊芋和釀酒酵母發(fā)酵三耦合制備乙醇的方法，屬于生物質(zhì)水解、發(fā)酵領域。

背景技術：

目前生物質(zhì)燃料存在的問題主要為生產(chǎn)成本高導致的市場競爭力不強^[1]，僅靠政府的扶持是不能使我國的能源重心從價格較低的石化和煤炭能源上移至目前生產(chǎn)成本較高的生物制乙醇上來的，在生物質(zhì)乙醇的生產(chǎn)中，糖源成本和乙醇的分離成本是關鍵。

近年來對于菊芋水解的研究仍主要集中在新菌株的篩選和水解條件的優(yōu)化上，二者的目的都是為了減少水解過程的酶耗成本，因為商業(yè)菊粉酶價格高昂，并不適用于工業(yè)生產(chǎn)^[2]。但即使獲得了高產(chǎn)酶活力的菌株，其培養(yǎng)產(chǎn)酶周期仍然很長，至少在72h以上，若要獲得更高的酶活，酵母需要在培養(yǎng)液里培養(yǎng)100h以上。粗酶液需要在4℃的低溫下才能長期保持活力，大量的液體培養(yǎng)基占用可觀的制冷空間，也是能耗。如果對菊粉酶進行提取和純化，其步驟復雜，又耗時耗力。水解條件的優(yōu)化可以提高菊粉的水解效率，但是價格高昂的菊粉酶仍然不能夠回收再利用，酶耗成本的下降空間并不大。雖然已有學者進行了菊粉酶固載的探討，但仍處在初期研究階段。

通過將產(chǎn)酶和水解過程進行耦合后仍然存在由于產(chǎn)物糖抑制導致的菊芋水解后期速率減緩和水解不徹底的問題。通常產(chǎn)物抑制的解決方法有二：一是將產(chǎn)物及時分離出來，打破反應平衡，推動反應繼續(xù)進行，但對于本研究體系此方法極難實現(xiàn)，體系中同時存在著還原糖、低聚果糖、菊粉及其他菊芋組分，包括大量的植物纖維，這使得單純的分離出水解產(chǎn)生的還原糖極其困難；另一種方法是將產(chǎn)物通過后續(xù)反應消耗掉，降低體系中產(chǎn)物濃度，減少產(chǎn)物抑制強度，促使反應繼續(xù)進行。

已有部分研究者采用同步糖化發(fā)酵法(ssf)，將多聚糖水解產(chǎn)生的還原糖進行實時發(fā)酵消耗。具體的實施方法可大致分為兩類：一類是在體系中同時加入水解酶和釀酒酵母，使得水解產(chǎn)生的還原糖即刻發(fā)酵產(chǎn)醇。但是此方法需要克服水解和發(fā)酵所需的不同條件，酶解的最佳溫度往往要高于釀酒酵母適宜的發(fā)酵溫度，若遷就水解的條件則釀酒酵母會由于高溫導致失活；若是遷就發(fā)酵的溫度，則會導致水解速率低，使得沒有足夠的還原糖生產(chǎn)出來供給產(chǎn)醇。再有，發(fā)酵所產(chǎn)生的乙醇對菊粉酶有一定的毒害作用，會導致菊粉酶失活，這就要求在反應初期添加足夠量的菊粉酶，增加了酶耗成本。另一類是對釀酒酵母進行基因重組，植入可分泌菊粉酶的基因。因為單細胞真核生物的酵母菌具有比較完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾能力，所以在發(fā)酵工程中釀酒酵母(s.cerevisiae)作為模式真核生物而被用作表達外源蛋白的優(yōu)良“工程菌”。然而，酵母的代謝產(chǎn)酶過程是好氧過程，體系中有足夠含量的氧存在是酵母產(chǎn)酶的必須條件，恰恰相反，發(fā)酵產(chǎn)醇是一個厭氧過程，氧氣的存在不利于糖向醇的轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)有技術常采用改變曝氣強度的方式來進行對兩種反應最適條件的協(xié)調(diào)，但是曝氣程度并不好控制，且往往此種重組菌株的產(chǎn)酶能力較弱，或產(chǎn)醇能力不高。

綜上所述，雖然已有不少研究者采用同步糖化發(fā)酵工藝對菊芋的產(chǎn)醇工藝進行了優(yōu)化，但在生產(chǎn)過程中會出現(xiàn)由于乙醇濃度升高導致的菊粉酶失活現(xiàn)象或由于非適宜培養(yǎng)條件導致的微生物代謝能力減弱問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術存在由于酶水解產(chǎn)物糖濃度升高抑制菊粉酶活性下降現(xiàn)象以及分步產(chǎn)酶、酶水解和發(fā)酵產(chǎn)乙醇的周期長問題，提供一種產(chǎn)菊粉酶、酶解菊芋和釀酒酵母發(fā)酵三耦合制備乙醇的方法。

本發(fā)明的目的是通過下述技術方案實現(xiàn)的。

一種實現(xiàn)快速菊芋酶解的方法，將酵母直接接種至菊芋料液中，得到混合溶液，本方法將產(chǎn)酶和水解環(huán)節(jié)耦合，能夠?qū)崿F(xiàn)快速菊芋酶解。

所述混合溶液中的水解液或料渣作為種子植入新一批次的菊芋料液中進行第二批次產(chǎn)酶水解耦合；重復此過程，即再取第二批次的水解液/料渣做為種子植入下一批次的菊芋料液中進行第三批次的耦合過程，實現(xiàn)連續(xù)接種的多批次產(chǎn)酶水解耦合工藝。

所述酵母為該酵母發(fā)酵后產(chǎn)生的酶能夠?qū)沼筮M行水解的酵母；

所述酵母包括克魯維酵母；

所述菊芋料液的制備方法為將菊芋粉末溶解在水中。

當酵母處于對數(shù)成長期的，取混合溶液中的固態(tài)物質(zhì)(料渣)直接接種至新的待水解的菊芋料液中，即可繼續(xù)對菊芋進行水解。

所述對數(shù)成長期為酵母接種至菊芋料液中12-28h時。

固態(tài)物質(zhì)的最佳接種量為1％-10％(v/v)。

菊芋料液中菊芋粉的質(zhì)量濃度為5％～40％。

一種產(chǎn)菊粉酶、酶解菊芋和釀酒酵母發(fā)酵三耦合制備乙醇的方法，產(chǎn)酶、酶解、發(fā)酵三耦合工藝(ssf)：將酵母直接接種至菊芋料液中，實現(xiàn)產(chǎn)酶水解耦合，得到料液；在產(chǎn)酶水解耦合工藝進行一段時間后，將料液移入發(fā)酵罐，再向發(fā)酵罐中加入復水活化后的釀酒酵母。

耦合發(fā)酵開啟時間為8-20h。

有益效果

菊芋酶解耦合釀酒酵母發(fā)酵制備乙醇的方法，采用分步糖化發(fā)酵法(shf)和產(chǎn)酶-水解-發(fā)酵“三耦合工藝”以菊芋為原料制得了生物質(zhì)乙醇。對于10wt％、15wt％、20wt％的菊芋料液，當采用shf工藝生產(chǎn)乙醇時，菊芋的水解率分別為92％、89.5％、89.2％，而三耦合體系中菊芋的水解率分別提高至92.3％、91.6％、94.1％；shf體系中乙醇的質(zhì)量分數(shù)分別達到了3.6wt％、5.3wt％、6.8wt％，為理論值的84％、81％、78％，在采用了三耦合工藝后，乙醇產(chǎn)量分別提高至理論值的87％、85％、81.6％。shf生產(chǎn)周期為60h，而三耦合工藝的生產(chǎn)周期縮短至50h。結果表明，包含產(chǎn)酶過程的三耦合工藝不斷有新酶產(chǎn)生，可以改善因發(fā)酵產(chǎn)物乙醇對菊粉酶抑制作用引起的水解率下降，縮短乙醇的生產(chǎn)周期。

附圖說明

圖1為菊芋酶解的cbp過程；

圖2為不同濃度菊芋水解液的發(fā)酵曲線，菊芋濃度：10wt％(a)，15wt％(b)，20wt％(c)；

圖3為菊芋濃度對三耦合工藝產(chǎn)醇的影響，開啟時間：10h(a)，14h(b)，18h(c)；

圖4為不同濃度菊芋的耦合發(fā)酵開啟時間對產(chǎn)醇的影響；菊芋濃度分別為10wt％(a)，15wt％(b)，20wt％(c)。

具體實施方式

下面結合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

釀酒酵母的復水活化：將干酵母置于10倍以上的2wt％葡萄糖水溶液中(此葡萄糖水溶液需進行高溫高壓滅菌并冷卻，即置于高溫蒸汽滅菌鍋中在121℃下滅菌20min，然后冷卻至室溫)在36～38℃下復水15～20分鐘，再置于34℃以下活化1h，然后以5‰(w/w)的比例添加到發(fā)酵體系中進行發(fā)酵。

分步糖化發(fā)酵(shf)：將產(chǎn)酶水解耦合工藝的水解料液滅菌后移入自制發(fā)酵罐中，再加入5‰(w/w)的釀酒酵母，在40℃下進行發(fā)酵，每隔一定時間取樣，離心后測定上清液的還原糖，總糖及乙醇濃度，離心條件為8000rpm，5min。

同步糖化發(fā)酵，即酶解耦合發(fā)酵工藝(ssf)：將克魯維酵母直接接種至菊芋料液中，實現(xiàn)產(chǎn)酶水解耦合，得到料液；在產(chǎn)酶水解耦合工藝進行到10h、14h以及18h后，將料液移入發(fā)酵罐，以5‰(w/w)的比例加入復水活化后的釀酒酵母，在40℃下進行發(fā)酵，每隔一定時間取樣，離心后測定上清液的還原糖，總糖及乙醇濃度，離心條件為8000rpm，5min。

在釀酒酵母加入菊芋水解液后，水解液中的糖分被酵母吸附并滲入細胞內(nèi)，經(jīng)過酵母細胞內(nèi)各種酶的作用快速發(fā)酵，產(chǎn)生乙醇、co2和能量，能量的一部分被釀酒酵母用作細胞新陳代謝的能源，余下的部分和乙醇及co2一起通過細胞膜排出細胞外。生成的乙醇和co2會快速滲透到周圍介質(zhì)中，當co2在發(fā)酵液中的溶解達到飽和時，就會附著在釀酒酵母細胞的表面，直至超過細胞的吸附力。當氣泡逐漸增大，產(chǎn)生的浮力克服了細胞重力時，氣泡就帶著細胞上浮，直至氣泡破裂，co2被釋放到發(fā)酵罐的上層氣相空間，隨著排氣管排出發(fā)酵罐，而釀酒酵母細胞則留在發(fā)酵液中慢慢下沉。由于co2的上升，帶動了發(fā)酵液中酵母細胞的移動，增加了酵母細胞與糖的接觸，有助于加速糖的發(fā)酵。

三種濃度(10wt％，15wt％，20wt％)菊芋水解液的發(fā)酵曲線如圖2所示。菊芋水解液發(fā)酵產(chǎn)醇的過程可以分為三個階段：(1)前發(fā)酵期，當釀酒酵母剛加入菊芋水解液的時候，體系中酵母細胞的濃度不大，在經(jīng)過短暫的停滯期后，釀酒酵母開始繁殖，此時發(fā)酵液中含有一定的溶解氧，營養(yǎng)成本也比較充分，所以釀酒細胞開始迅速繁殖，發(fā)酵作用不強。這時發(fā)酵液的表面很平靜，觀察不到明顯的氣泡產(chǎn)生。(2)主發(fā)酵期，經(jīng)過前發(fā)酵期釀酒酵母細胞的大量繁殖，細胞密度已經(jīng)較高，發(fā)酵作用增強，大量生成乙醇，co2的釋放帶動發(fā)酵料液上下翻動，還原糖濃度快速下降。(3)后發(fā)酵期，此時菊芋水解液中的大部分糖已經(jīng)被釀酒酵母用來發(fā)酵產(chǎn)醇，發(fā)酵速率減慢，觀察到的氣泡逸出速度也很慢，產(chǎn)生的熱量也大為減少。各濃度發(fā)酵液最終的乙醇收率及殘?zhí)且姳?。

不同濃度菊芋水解液在第36h的殘?zhí)橇亢鸵掖际章柿杏诒?中。可以看出，體系中的殘?zhí)橇侩S著菊芋濃度的增高而升高，但乙醇的“實際產(chǎn)醇/理論產(chǎn)醇”值隨著菊芋濃度的增高而下降。這是因為雖然發(fā)酵時乙醇從酵母細胞排出后以非?？斓乃俣葷B透到周圍介質(zhì)中，但是隨著發(fā)酵的進行，料液主體中乙醇濃度逐漸升高，最終會達到產(chǎn)生抑制的程度。體系中乙醇濃度越高，對發(fā)酵反應的抑制作用越強，乙醇收率越低。

表2第36h發(fā)酵體系殘?zhí)呛鸵掖际章?/p>

可知，shf的發(fā)酵終點選為36h，而ssf工藝的發(fā)酵終點選為50h。在這里，shf的36h只含有發(fā)酵一個步驟，而ssf的50h卻包括了酵母產(chǎn)酶、菊芋水解、糖的發(fā)酵三個步驟。

表3shf與ssf工藝的發(fā)酵終點各項指標比較

從表3所列實驗結果可以看出，通過將產(chǎn)酶過程耦合入發(fā)酵工藝，成功改善了產(chǎn)物抑制導致的水解率下降。

分別對10wt％、15wt％、20wt％的菊芋料液進行產(chǎn)酶水解發(fā)酵耦合操作，選取了三個時間點做為發(fā)酵的開始時間。從圖3中可以看出，菊芋濃度不同，耦合開啟后，還原糖變化趨勢的改變有所不同，當開啟時間為10h時，10wt％和15wt％料液中還原糖的增加趨勢所受影響不大，而20wt％菊芋料液的還原糖濃度升高明顯放緩，這是因為，濃度越高所需菊粉酶活力越高，而10h時體系中所產(chǎn)生的菊粉酶只能夠?qū)?0wt％菊芋料液的一小部分水解，且發(fā)酵時初始還原糖濃度越高，發(fā)酵速率越快，所以20wt％的菊芋料液受耦合時間的影響最大。當開啟發(fā)酵時間為14h時，由于體系中菊粉酶增加，20wt％菊芋料液在發(fā)酵同時仍然能夠快速水解，而此時，10wt％菊芋料液的水解速度已經(jīng)小于發(fā)酵速度，所以還原糖在開始發(fā)酵時就出現(xiàn)了下降的趨勢。當開啟時間為18h時，三種濃度的菊芋料液中還原糖在發(fā)酵開始時即開始下降，此時體系中大部分的菊芋已經(jīng)水解成還原糖，發(fā)酵速率快于后期的水解速率，還原糖開始呈消耗下降趨勢。

發(fā)酵的開啟時間對于耦合工藝來說非常重要，若耦合發(fā)酵時間過早，大部分菊芋尚未水解成可發(fā)酵糖，體系中還原糖濃度偏低，導致發(fā)酵速度緩慢，若耦合發(fā)酵時間過晚，發(fā)酵速度并無明顯提高反而導致時耗耦合過程時耗過長，與縮短反應時間意愿相悖。耦合發(fā)酵開啟時間對不同濃度菊芋“三耦合”過程的影響見圖4。在三個濃度下，初始的發(fā)酵速度均隨著耦合發(fā)酵時間開啟時間的延遲而增大。

實施例2

克魯維酵母在純菊芋提取物中的培養(yǎng)：取一環(huán)保存在yepd平板培養(yǎng)基上的克魯維酵母，接種至裝有100ml滅菌冷卻后的2wt％菊芋提取物的250ml錐形瓶中，在30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm。每隔一段時間取出3ml培養(yǎng)液，使用紫外可見分光光度計在600nm下進行od600的測定，測定所采用的空白樣為未進行克魯維酵母培養(yǎng)的菊芋提取物溶液。

克魯維酵母產(chǎn)酶及菊芋酶解過程的耦合(cbp)：取一環(huán)保存在yepd平板培養(yǎng)基上的克魯維酵母，直接接種至裝有100ml10wt％菊芋料液的250ml容器中。在30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm。此步稱為對產(chǎn)酶、水解環(huán)節(jié)的第一次整合生物工藝(thefirstconsolidatedbioprocessing，cbp)。每隔一定時間取樣，離心后測定上清液的還原糖，總糖，菊粉酶活力。離心條件：8000rpm，5min。

圖1所示，在耦合過程的前10個小時，因為體系中菊粉酶的含量較低，無法進行準確的測定，但是從菊粉酶酶活測量曲線可以看到，克魯維酵母在菊芋料液中培養(yǎng)時能夠快速的產(chǎn)酶，并且在培養(yǎng)后期仍呈現(xiàn)出一個快速的上升趨勢，在整個耦合工藝過程中，克魯維酵母保持著良好的產(chǎn)酶能力，使得體系中不斷有高活力的菊粉酶被生產(chǎn)出來，參與到水解反應中去，從體系的還原糖變化曲線也可以得到相同的結果，耦合過程中還原濃度不斷增加，并維持增高趨勢直至24h后達到一個穩(wěn)定期，此時的菊粉水解率已達到91.2％。通過對體系中的總糖濃度進行測定，發(fā)現(xiàn)在耦合工藝過程中并未觀察到總糖濃度的明顯降低，證明克魯維酵母并未消耗大量的還原糖。