專利名稱：一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種內切型菊粉酶菌株，具體是涉及一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株及其制備方法，屬遺傳技術領域。
背景技術：
低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，可做為功能性食品或者飼料的原料或添加劑。低聚果糖具有抗腫瘤、刺激雙歧桿菌生長、防治便秘、抑制腸內腐敗物質形成、提高機體免疫力、改善脂質代謝、降低膽固醇等作用，同時可作為膳食纖維用于防治糖尿病和減肥，也可用來改善腸胃功能，降低血脂和預防高膽固醇病等。因此，具有重要的健康、藥用開發(fā)價值。傳統(tǒng)工業(yè)化大規(guī)模生產低聚果糖是由蔗糖經果糖基轉移酶合成，反應的副產物葡萄糖是酶的抑制劑，反應進行不徹底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占總量< 55%-60%(干基)，且工藝復雜、生產成本高。目前，如何提高內切型菊粉酶的酶活，是這個新工藝能否用于工業(yè)化生產的關鍵。據(jù)文獻報道，現(xiàn)在利用細胞誘變和工藝條件的優(yōu)化來提高微生物生產內切型菊粉酶酶活的較多，但未有利用原生質體融合技術進行菌株酶活的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株及其制備方法。它以二種黑曲霉為菌種，經含有菊糖的培養(yǎng)基活化、牛蒡汁液體搖瓶培養(yǎng)后，利用纖維素酶和蝸牛酶水解黑曲霉菌絲細胞的細胞壁，在恒溫下振蕩，制備原生質體；經原生質體融合后，內切型菊粉酶的酶活比二個出發(fā)菌株分別提高了 33. 41%和47. 44%。原生質體融合后再生，經過傳代后，內切型菊粉酶的酶活與再生菌株相比偏差較小，遺傳性狀穩(wěn)定。該菌株可用于工業(yè)化生產內切型菊粉酶。原生質體融合的意義在于打破了微生物的種界界限，可實現(xiàn)遠緣菌株的基因重組?？墒惯z傳物質傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機會。可與其他育種方法相結合，如把常規(guī)誘變和原生質體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個單株中，經過原生質體的融合和再生選育出酶活最高的菌株。本發(fā)明是以如下技術方案實現(xiàn)的一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株，其特征是它以二種黑曲霉為菌種，經含菊糖初篩培養(yǎng)基活化、誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)、牛蒡汁液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)后，利用復合酶液水解黑曲霉菌絲體，制備原生質體；將二種原生質體溶液各取lml，加入30%聚乙二醇6000 2ml和0. 01mol/L氯化鈣lml，使二種原生質體進行融合，再將原生質體混合液加入到再生培養(yǎng)基中，經再生培養(yǎng)、搖瓶液體深層發(fā)酵獲得內切型菊粉酶發(fā)酵液，過濾取上清液，用3，5- 二硝基水楊酸比色定糖法測定內切型菊粉酶的酶活。所述的一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株，其特征是所述復合酶液為蝸牛酶和纖維素酶。一種制備權利要求1所述的黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株的方法，其特征是按如下步驟進行
(1)二個菌種分別接種于含菊糖的初篩培養(yǎng)基上活化1-2次，誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)1 次，取菌塊接種于牛蒡汁液體培養(yǎng)基中，28-30°C進行搖瓶培養(yǎng)4-5天；
(2)二個菌種分別取一瓶液體培養(yǎng)的菌絲，過濾，收集菌絲球，用無菌水沖洗2-3次，在無菌濾紙上吸干水分，稱濕重；
(3)各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液1:20的IOOml錐形瓶中，在^-32 水浴、lOOr/min振蕩器中震蕩2_4h，用冰浴終止酶解，經雙層無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入200ml高滲緩沖溶液，此為原生質體溶液；
(4)將兩種原生質體溶液各Iml+ 30%聚乙二醇6000 2ml + 0. Olmol/L氯化鈣lml， 30°C靜置15—20min，2000r/min離心lOmin，用無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液洗滌2_3 次，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于5個再生培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)2_3 天；
(5)選擇20株透明圈大的菌株，每個菌株移入2個初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長出來后每個菌株挖取1 cm 2置于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過濾取上清液， 測定內切型菊粉酶的酶活。本發(fā)明的優(yōu)點是采用該技術所獲得的黑曲霉菌株通過深層發(fā)酵后在培養(yǎng)液中生產內切型菊粉酶，經提取、分離后可水解菊糖生產低聚果糖，廣泛應用于食品工業(yè)，該方法具有較高的可重復性。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明 實施例1、
將二個黑曲霉出發(fā)菌株在30 下保溫培養(yǎng)活化7天，取活化菌塊于250ml搖瓶中，28°C 搖床培養(yǎng)5天。過濾，收集菌絲球，用無菌水沖洗；各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、l%酶解液(1:20)的100ml錐形瓶中，在32 下振蕩酶解池，用冰浴終止酶解，經雙層無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入高滲緩沖溶液，此為原生質體溶液。將兩種原生質體溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和CaCl2溶液，2000r/min離心 lOmin，用無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于再生培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)2天。選擇透明圈大的菌株，轉入初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長出來后，菌株挖取1 cm2菌塊轉入搖床培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過濾取上清液，測定內切型菊粉酶的酶活，多數(shù)再生菌株的內切型菊粉酶的酶活比二個出發(fā)菌株提高30%和42%以上。實施例2、
將在^tlC下保溫培養(yǎng)活化的二個黑曲霉出發(fā)菌株，取活化菌塊于250ml搖瓶中，30 搖床培養(yǎng)4天。過濾，收集菌絲球，用無菌水沖洗；各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液(1:20)的100ml錐形瓶中，在30 下振蕩酶解池，用冰浴終止酶解，經雙層無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入高滲緩沖溶液，制備出原生質體溶液。將兩種原生質體溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和氯化鈣溶液，2000r/min離心lOmin，用無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于再生培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)4天。選擇透明圈大的菌株，轉入初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長出來后，菌株挖取1 cm2菌塊轉入搖床培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過濾取上清液，測定內切型菊粉酶的酶活，多數(shù)再生菌株的內切型菊粉酶的酶活比二個出發(fā)菌株提高3 和40%以上。
實施例3、
將在^tlC下保溫培養(yǎng)活化的二個黑曲霉出發(fā)菌株，取活化菌塊于250ml搖瓶中，^tlC搖床培養(yǎng)4天。過濾，收集菌絲球，用無菌水沖洗；各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液(1 20)的IOOml錐形瓶中，在^tlC下振蕩酶解4h，用冰浴終止酶解，經雙層無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入高滲緩沖溶液，制備出原生質體溶液。將兩種原生質體溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和氯化鈣溶液，2000r/min離心lOmin，用無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于再生培養(yǎng)基中， ^tlC培養(yǎng)3天。選擇透明圈大的菌株，轉入初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長出來后，菌株挖取1 cm 2菌塊轉入搖床培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過濾取上清液，測定內切型菊粉酶的酶活，多數(shù)再生菌株的內切型菊粉酶的酶活比二個出發(fā)菌株提高30%和43%以上。再生菌株用石蠟油斜面保存。
權利要求
1.一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株，其特征是它以二種黑曲霉為菌種，經含菊糖初篩培養(yǎng)基活化、誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)、牛蒡汁液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)后， 利用復合酶液水解黑曲霉菌絲體，制備原生質體；將二種原生質體溶液各取lrnl，加入30% 聚乙二醇6000 2ml和O.Olmol/L氯化鈣lml，使二種原生質體進行融合，再將原生質體混合液加入到再生培養(yǎng)基中，經再生培養(yǎng)、搖瓶液體深層發(fā)酵獲得內切型菊粉酶發(fā)酵液，過濾取上清液，用3，5- 二硝基水楊酸比色定糖法法測定內切型菊粉酶的酶活。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株，其特征是所述復合酶液為蝸牛酶和纖維素酶。
3.一種制備權利要求1所述的黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株的方法，其特征是按如下步驟進行(1)二個菌種分別接種于含菊糖的初篩培養(yǎng)基上活化1-2次，誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)1 次，取菌塊接種于牛蒡汁液體培養(yǎng)基中，28-30°C進行搖瓶培養(yǎng)4-5天；(2)二個菌種分別取一瓶液體培養(yǎng)的菌絲，過濾，收集菌絲球，用無菌水沖洗2-3次，在無菌濾紙上吸干水分，稱濕重；(3)各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液1:20的IOOml錐形瓶中，在^-32 水浴、lOOr/min振蕩器中震蕩2_4h，用冰浴終止酶解，經雙層無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入200ml高滲緩沖溶液，此為原生質體溶液；(4)將兩種原生質體溶液各Iml+ 30%聚乙二醇6000 2ml + 0. Olmol/L氯化鈣lml， 30 靜置15—20min，2000r/min離心lOmin，用無菌鏡頭紙過濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌 2-3次，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于5個再生培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng) 2-3 天；(5)選擇20株透明圈大的菌株，每個菌株移入2個初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長出來后每個菌株挖取1 cm 2置于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過濾取上清液， 測定內切型菊粉酶的酶活。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種內切型菊粉酶菌株，具體是涉及一種黑曲霉原生質體融合選育高產內切型菊粉酶菌株及其制備方法，屬遺傳技術領域。該制備方法以二種黑曲霉為菌種，經含有菊糖的培養(yǎng)基活化、牛蒡汁液體搖瓶培養(yǎng)后，利用纖維素酶和蝸牛酶水解黑曲霉菌絲細胞的細胞壁，在恒溫下振蕩，制備原生質體；經原生質體融合后，內切型菊粉酶的酶活比二個出發(fā)菌株分別提高了33.41%和47.44%。原生質體融合后再生，經過傳代后，內切型菊粉酶的酶活與再生菌株相比偏差較小，遺傳性狀穩(wěn)定。該菌株可用于工業(yè)化生產內切型菊粉酶。
文檔編號C12R1/685GK102559515SQ20111045648
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月31日
發(fā)明者曹澤虹, 李勇, 楊萬根, 王衛(wèi)東, 董玉瑋 申請人:徐州工程學院