本發(fā)明屬于海洋生物技術及功能食品技術領域，更具體地，涉及一種海參酶解物醇提取組分的制備方法及其制備得到的醇提取組分和應用。

背景技術：

隨著世界人口老齡化的加劇和老年癡呆（alzheimer’sdisease,ad）發(fā)病率的不斷增加，尋找抗老年癡呆的新藥已迫在眉睫。而海洋生物中蘊藏著豐富的活性物質(zhì)，可望在此方面造福人類。

不少研究發(fā)現(xiàn)，需氧細胞代謝過程中產(chǎn)生的超氧自由基會對腦組織造成損害，促進腦細胞的衰老和死亡，而且自由基還能損害細胞染色體，使第21號染色體畸變，從而發(fā)生ad。而抗氧化劑不僅能夠穩(wěn)定細胞膜，消除活性氧，同時還能抑制和清除腦內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積，從而來預防和保護神經(jīng)細胞免受損傷，從而延緩ad的發(fā)展進程。同時抗氧化劑對于延緩衰老及防治其他神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤等多種疾病均有重要的應用價值。

基于抗氧化劑的廣泛用途，因此篩選具有抗氧化功能的海洋功能食品或藥物具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種海參酶解物醇提取組分的制備方法。

本發(fā)明同時提供上述制備方法制備得到的醇提取組分。

本發(fā)明還提供上述醇提取組分的應用。

本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有抗氧化及老年癡呆功能食品與藥物的不足，提供海參來源的天然抗氧化活性成分，該活性成分具有很好的抗氧化活性，在制備抗氧化及相關的抗老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病的保健品與藥物方面具有很好的應用前景。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種海參酶解物醇提取組分的制備方法，包括如下步驟：

s1.采用混合酶進行海參的酶解，所述混合酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶的加入量依次為海參重量的0.15~0.25%，0.1~0.15%，0.05~0.15%；所述酶解的溫度為50~55℃，酶解的時間為3.5~4.5h，酶解的料液比為1：（1~3）；

s2.將酶解后的酶解液濃縮后，干燥至固體含水量低于5%；

s3.將干燥后的酶解液進行逐級溶液除雜提取，其中，一級除雜溶劑為正己烷，二級除雜溶劑為二氯甲烷，三級除雜溶劑為乙酸乙酯，除雜完成后，醇提2~3次，合并提取液，除去溶劑，得到海參酶解物醇提取組分。

優(yōu)選地，s3步驟一級除雜中每kg固體物料按照4~6l的溶劑比例加入溶劑，一級除雜為先將干燥后的酶解液用溶劑浸泡20~30h，然后超聲提取1~3次，超聲功率為200~400w，超聲提取的溫度為25~35℃，超聲提取時間為0.5~1.5h。

優(yōu)選地，s3步驟二級除雜和三級除雜的超聲提取次數(shù)，超聲功率，超聲溫度與一級除雜相同。

優(yōu)選地，s3步驟二級除雜和三級除雜的超聲提取時間為0.5h，二級除雜和三級除雜的溶劑浸泡時間為1h。

優(yōu)選地，s3步驟一級除雜的超聲提取時間為1h。

優(yōu)選地，s3步驟采用無水甲醇醇提3次。

優(yōu)選地，s1步驟中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶的加入量依次為海參重量的0.2%、0.125%和0.1%；所述酶解的溫度為52℃，酶解的時間為4h，酶解的料液比為1：1.5。

本發(fā)明同時保護所述的制備方法制備得到的海參酶解物醇提取組分。

進一步地，所述海參酶解物醇提取組分在制備抗氧化及抗老年癡呆類神經(jīng)退行性疾病的保健品與藥物中的應用。

茚三酮顯色表明，醇提取組分的主要成分為在gf254薄層層析硅膠板上顯紫紅色、rf值分別為0.31和0.55的肽類物質(zhì)，另外碘化鉍鉀試劑顯色表明該組分還含有少量在gf254薄層層析硅膠板上顯桔黃色、rf值為0.14的生物堿類成分。

本發(fā)明針對醇提取組分進行了hplc分析，綜合顯色和hplc結(jié)果表明，其活性組分的主要成分為小肽和生物堿。

本發(fā)明通過dpph（1,1-二苯基-2-苦肼基）自由基清除法和改良后的prieto法評價了醇提取組分的抗氧化活性。結(jié)果顯示，其在1mg/ml濃度下對dpph自由基的清除率為15%（同劑量下陽性對照維生素c的清除率為25%），在1mg/ml濃度下將mo(vi)還原成mo(v)絡合物達到的吸光度可達0.18（表征總抗氧化能力，優(yōu)于對照bht，同劑量下bht僅為0.08）。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明提取來源為天然物質(zhì)海參，安全可靠，且抗氧化活性好，經(jīng)過提取后的海參活性成分可以用于制備抗氧化及相關的抗老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病的保健品與藥物，為天然來源的抗氧化活性產(chǎn)品提供了很好的制備原料，具有較好的應用前景。

附圖說明

圖1為活性組分的hplc-dad分析譜圖。（檢測波長從上到下依次為254、210、260、280nm）

圖2為保留時間為1.3min的主要色譜峰的紫外光譜圖。

圖3為保留時間為1.5min的主要色譜峰的紫外光譜圖。

圖4為保留時間為1.9min主要色譜峰的紫外光譜圖。

圖5為保留時間為3.3min的主要色譜峰的紫外光譜圖。

圖6為保留時間為5.9min的主要色譜峰的紫外光譜圖。

圖7為保留時間為20.6min的主要色譜峰的紫外光譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例和附圖來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。

實施例1：

（1）海參酶解：每1kg鮮海參洗凈后，切碎投入酶解罐，加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶（加入量是按照海參重量依次為0.2%、0.125%和0.1%)，料液比為1:1.5，酶解溫度為52℃，酶解時間為4小時。

（2）酶解液干燥：將1l酶解液經(jīng)50℃以下減壓濃縮至較小體積，分裝入淺盤中，進行真空冷凍干燥至固體含水量低于5%；

（3）逐級溶劑除雜提?。簩Σ襟E（2）中所述固形物采用逐級溶劑除雜提取法得到活性組分，一級除雜溶劑為正己烷，溶劑與固體物料的液料比為5l/kg，先浸泡24h后，采用超聲波輔助提取1次，超聲功率300w，提取溫度為30℃，超聲提取1小時，超聲完畢經(jīng)抽濾得到固體用于下一次處理，第二次、第三次的浸泡時間為1小時、超聲處理時間為0.5小時；經(jīng)一級除雜溶劑處理得到的固體用于下一級除雜處理，二級除雜溶劑為二氯甲烷，類似超聲提取操作；三級除雜溶劑為乙酸乙酯，類似超聲提取操作；經(jīng)過上述除雜過程后，使用無水甲醇作為目標組分的提取溶劑，類似超聲提取操作，合并三次提取得到的醇提取液，即為含目標活性組分的提取液；

（4）目標組分的干燥：將步驟（3）所述醇提取液經(jīng)50℃以下減壓濃縮至干燥，除盡有機溶劑，即為所需目標活性組分。

茚三酮顯色表明，該組分的主要成分為在gf254薄層層析硅膠板上顯紫紅色、rf值分別為0.31和0.55的肽類物質(zhì)，另外碘化鉍鉀試劑顯色表明該組分還含有少量在gf254薄層層析硅膠板上顯桔黃色、rf值為0.14的生物堿類成分，上述層析分析所用展開劑為冰乙酸：正丁醇=1：1。

還對該組分進行了hplc分析，液相型號為agilent1260hplc-dad系統(tǒng)，色譜分析條件如下：色譜柱為poroshell120ec-c18，尺寸為150mm×4.6mm，粒徑4μm，系統(tǒng)為乙腈-水，0～10min5%乙腈等度洗脫，10～20min5%~100%乙腈線性梯度洗脫，20～30min100%乙腈等度洗脫，流速1ml/min，檢測波長210、254、260、280nm。圖1為活性組分的hplc-dad分析譜圖。結(jié)果表明：該組分含有的主要特征色譜峰保留時間為1.3、1.5、1.9、3.3、5.9和20.6min，其紫外特征光譜見圖2~圖7。其中保留時間為5.9min與20.6min的色譜峰在280nm附近有較強吸收峰，為典型的含芳香族氨基酸的肽類特征。

實施例2海參活性成分清除dpph自由基的活性測定

1、實驗方法（dpph自由基清除法）：

原理：1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(dpph)）是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液顯紫色，最大吸收波長接近540nm。當dpph溶液中加入自由基清除劑時，其孤對電子被配對時，吸收消失或減弱，導致溶液顏色變淺，顯黃色或淡黃色，在540nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關系，故該法可用清除率表示，清除率越大，表明該物質(zhì)清除能力越強。

操作步驟：在96孔板中依次加入系列劑量的樣品甲醇溶液，晾干后加入100μldmso，再加入100μl0.16mmol/ldpph甲醇溶液，混勻，一系列孔中樣品的終濃度依次為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mg/ml，對照用甲醇代替dpph溶液；空白組是在100μldpph中加入100μldmso混合，對照組用100μl甲醇溶液代替dpph。室溫暗處放置30min，于540nm處測定吸光度，分別記為a1、a2、a3、a4。

清除率%=100-(a1-a2)×100/(a3-a4)

式中，a1為實驗組的吸光值；a2為實驗對照組的吸光值；a3為空白組的吸光值；a4為空白對照組的吸光值。

平行測定3次，計算不同樣品濃度下對dpph自由基的清除率，并取相應平均值，并以vc作陽性對照(即用vc代替樣品液的測量）。

2、實驗結(jié)果

該組分具有抗氧化活性，其在1mg/ml濃度下對dpph自由基的清除率為15%（同劑量下陽性對照維生素c的清除率為25%）。

實施例3海參活性成分總抗氧化活性的測定

1、實驗方法（改良后的prieto法）：

原理：磷鉬絡合物測定方法的原理是mo(vi)被抗氧化物質(zhì)還原成綠色的mo(v)絡合物，其最大吸收波長為695nm?？寡趸镔|(zhì)活性越強，測定的吸光度值越大。

操作步驟：分別取不同濃度的各樣品溶液（0.24、0.48、0.72、0.96、1.20mg/ml）1.0ml，置10ml離心管中，加入3.0ml試劑溶液（試劑溶液中包括0.6mol/l的硫酸、28mmol/l的磷酸鈉、4mmol/l的鉬酸銨）?；旌弦河?5℃水浴鍋中分別水浴30min，60min、90min、120min、150min。

放冷至室溫，695nm處測吸光度值。以蒸餾水為空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越強。bht做為陽性對照。將實驗重復三次，求平均值。

2、實驗結(jié)果

在1mg/ml濃度下將mo(vi)還原成mo(v)絡合物達到的吸光度可達0.18（表征總抗氧化能力，優(yōu)于對照bht，同劑量下bht僅為0.08）。