本發(fā)明屬于環(huán)保和新技術(shù)能源領(lǐng)域，具體涉及一種以布朗葡萄藻生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油原料的方法。
背景技術(shù)：
微藻生物柴油作為石化柴油的替代品，就應(yīng)該滿足石化柴油的使用要求，即其理化性質(zhì)應(yīng)該與石化柴油接近，才能保證其燃料特性。衡量生物柴油性質(zhì)的指標(biāo)主要包括：密度、運(yùn)動(dòng)黏度、閃點(diǎn)、餾程、低溫性能、殘?zhí)?、灰分、十六烷值、甲醇含量、脂含量、磷含量、甘油含量、碘值和游離脂肪酸等，其中以十六烷值來評價(jià)生物柴油的燃燒性能。燃燒性能是生物柴油最重要的品質(zhì)之一，而十六烷值主要是受原料的影響。此外，生物柴油生產(chǎn)原料中不飽和脂肪酸的種類和數(shù)量很大程度上決定了生物柴油產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性。然而，微藻在培養(yǎng)的過程中，其脂肪酸含量和分布容易隨環(huán)境條件改變而發(fā)生變化。如在一般的生長條件下，微藻積累的油脂相對較少，而在環(huán)境脅迫條件下，油脂的積累則可成倍增長。影響微藻油脂含量的因素有很多，例如化學(xué)因素、物理因素以及微藻自身的不同生長階段等。目前，國內(nèi)外對微藻生物柴油研究，主要集中在如何提高油脂含量和如何將油脂催化轉(zhuǎn)化成生物柴油上，而在微藻的培養(yǎng)階段，如何在提高油脂含量的基礎(chǔ)上，同時(shí)也能改善油脂的品質(zhì)方面幾乎成為空白。
因此，如何從微藻的培養(yǎng)環(huán)境和工藝方面著手，設(shè)計(jì)一種以布朗葡萄藻生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油的原料方法，即成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的主要目的在于提供一種以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中微藻生物油脂含量低的缺陷。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，該方法包括以下步驟：
(1)將無菌布朗葡萄藻種子接種于密閉的光生物反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)大再培養(yǎng)；光源為led燈或熒光燈，光質(zhì)為白光或藍(lán)光，光照強(qiáng)度為8-10klux；種子培養(yǎng)基成分為：海鹽24-34g/l，ch3coona0.3-0.5g/l，nano3200-300mg/l，nah2po450-100mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，維生素b10.006-0.06mg/l，維生素b20.00005-0.0005mg/l；培養(yǎng)初始ph為6.0-8.0，通氣強(qiáng)度為0.2-0.7vvm，co2濃度為0-0.5％，培養(yǎng)溫度為23-26℃，培養(yǎng)6-8天，直到細(xì)胞生長到對數(shù)期；
(2)對步驟(1)產(chǎn)出的布朗葡萄藻種子進(jìn)行收集；
(3)在開發(fā)式光生物反應(yīng)器中對步驟(2)收集的布朗葡萄藻種子進(jìn)行光自養(yǎng)培養(yǎng)；光源為led燈或熒光燈，光照強(qiáng)度為8-10klux，光質(zhì)為白光或藍(lán)光；光自養(yǎng)培養(yǎng)基成分為：海鹽28-34g/l，nano3350-550mg/l，nah2po430-80mg/l，na2edta10-30mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，cuso4·5h2o0.01mg/l，znso4·7h2o0.03-0.06mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.05mg/l，mncl2·4h2o0.2-0.6mg/l，na2moo4·2h2o0.1-0.3mg/l，維生素b10.006-0.06mg/l，維生素b20.00005-0.0005mg/l，生物素0.00005-0.0005mg/l，其中氮磷元素之比為15-25；培養(yǎng)初始ph為6.0-8.0，通氣強(qiáng)度為0.5-1.0vvm，co2濃度為1.0-2.0％，培養(yǎng)溫度為22-30℃；
(4)對步驟(3)生產(chǎn)的布朗葡萄藻進(jìn)行采收；以及
(5)破碎步驟(4)所得到的布朗葡萄藻細(xì)胞，進(jìn)行油脂提取。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述步驟(2)中，優(yōu)選采用離心或氣浮的采集技術(shù)進(jìn)行種子收集。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述步驟(3)中，光自養(yǎng)培養(yǎng)的接種密度優(yōu)選為1.0×107-2.0×107個(gè)/l。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述步驟(4)中，優(yōu)選以離心、化學(xué)絮凝或氣浮采收藻液，得到藻泥。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述化學(xué)絮凝優(yōu)選使用硫酸鐵、氯化鐵、硫酸鋁、氯化鋁或殼聚糖作為化學(xué)絮凝劑。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述步驟 (5)中，優(yōu)選采用酶法、超聲法或液氮法破碎布朗葡萄藻細(xì)胞。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述酶法使用的酶優(yōu)選包括纖維素酶、中心蛋白酶、堿性蛋白酶、果膠酶、破壁酶、蝸牛酶和脂肪酶中的一種或者幾種。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述步驟(5)中，優(yōu)選采用有機(jī)萃取法進(jìn)行常溫油脂提取，有機(jī)溶劑優(yōu)選為等體積比例的氯仿、甲醇和水，或者等體積比例的乙醚、正己烷和水。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，優(yōu)選的是，還包括：
步驟(6)對萃取出來的油脂的含量進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析；
步驟(7)對萃取出來的油脂的燃燒性能進(jìn)行評價(jià)。
本發(fā)明所述的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，其中，所述步驟(7)中，燃燒性能評價(jià)優(yōu)選以十六烷值來評價(jià)。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明提供了一種以布朗葡萄藻生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油原料的方法，其中以普通布朗葡萄藻為藻種，采用較溫和的光照和光質(zhì)、充足的營養(yǎng)及適宜的氮磷比、和適宜的溫度等條件，促進(jìn)微藻細(xì)胞的快速生長、油脂的積累和油脂品質(zhì)的穩(wěn)定和改善；
本發(fā)明不僅能夠提高布朗葡萄藻油脂的產(chǎn)量，還能有效的改善油脂的品質(zhì)，最終得到藻細(xì)胞的油脂含量在30％以上，cn值穩(wěn)定在50以上，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例在1.5-2.5，本發(fā)明從源頭原料上有效的調(diào)節(jié)了生物柴油的產(chǎn)量和品質(zhì)，滿足了微藻生物柴油工業(yè)化的應(yīng)用化要求，是一種較好的生產(chǎn)高品質(zhì)微藻生物柴油的方法。
具體實(shí)施方式
以下對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
本發(fā)明提供的以布朗葡萄藻生產(chǎn)生物柴油原料的方法，還可以具體表述如下：
(1)種子培養(yǎng)
將裝有普通布朗葡萄藻的三角搖瓶接種至無菌光生物反應(yīng)器，在已滅好菌培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)；光生物反應(yīng)器系鼓泡式密閉反應(yīng)器，包括co2儲(chǔ)氣瓶、混氣裝置和氣體流量計(jì)；種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下：海鹽24-34g/l，ch3coona0.3-0.5g/l，nano3200-300mg/l，nah2po450-100mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，vitaminb10.006-0.06mg/l，vitaminb20.00005-0.0005mg/l，光源采用熒光燈或led，光照強(qiáng)度為8-10klux，光質(zhì)為白光或藍(lán)光，初始ph為6.0-8.0，通氣強(qiáng)度為0.2-0.7vvm，co2濃度為0-0.5％，培養(yǎng)溫度為23-26℃，培養(yǎng)6-8天，直到對數(shù)期，收集種子準(zhǔn)備下一階段發(fā)酵。
(2)種子收集
細(xì)胞收集采用離心或氣浮等采集技術(shù)，以離心為例，在轉(zhuǎn)速為4000-12000rmp情況下，常溫下離心1-10min，得到藻泥后，并用清水清洗2-3次，再在相同條件下，離心得到的藻泥，然后，用少量的清水均勻重懸，即為后續(xù)培養(yǎng)的種子。
(3)光自養(yǎng)培養(yǎng)
將準(zhǔn)備好的種子接到裝有培養(yǎng)基的光生物反應(yīng)器中，該反應(yīng)器為室內(nèi)開放式系統(tǒng)，包括co2儲(chǔ)氣瓶、混氣裝置和氣體流量計(jì)；該培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下：海鹽28-34g/l，nano3350-550mg/l，nah2po430-80mg/l，na2edta10-30mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，cuso4·5h2o0.01mg/l，znso4·7h2o0.03-0.06mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.05mg/l，mncl2·4h2o0.2-0.6mg/l，na2moo4·2h2o0.1-0.3mg/l，vitaminb10.006-0.06mg/l，vitaminb20.00005-0.0005mg/l，生物素0.00005-0.0005mg/l，其中氮磷元素之比為15-25，光源采用熒光燈或led燈，其光照強(qiáng)度為8-10klux，光質(zhì)為白光或藍(lán)光，初始ph為6.0-8.0，通氣強(qiáng)度為0.5-1.0vvm，co2濃度為1.0-2.0％，培養(yǎng)溫度為22-30℃。
(4)微藻采收
采收可采用離心、化學(xué)絮凝和氣浮等，以化學(xué)絮凝為例，絮凝劑采用硫酸鐵、氯化鐵、硫酸鋁、氯化鋁、殼聚糖等，將培養(yǎng)好的藻液收集在容器中，并向容器中按藻液比例加一定劑量的絮凝劑，如向藻液中加于fecl320-80mg/l，待絮凝完全，傾去上層水層，得到藻泥。
(5)油脂提取
采用先破碎后提取的辦法，破碎可采用酶法破碎、超聲破碎和液氮破碎，其中酶法破碎的的酶涉及纖維素酶、中心蛋白酶、堿性蛋白酶、果膠酶、破壁酶、蝸牛酶和脂肪酶，酶法中以纖維素酶和蛋白酶共同破碎效果最好，在以上所有的破碎中，以液氮法和酶法效果最好；油脂提取采用有機(jī)萃取法，采用氯仿/甲醇/水(體積比1：1：1)或乙醚/正己烷/水(體積比1：1：1)體系常溫萃取。
(6)油脂分析
油脂采用gc-ms進(jìn)行分析，取一定量的油脂加于2ml離心管中，再依次加于1.5ml的正己烷和0.2ml的0.4mol/l氫氧化鉀甲醇溶液；搖勻，靜置10分鐘左右；取上清液0.5ml到1.5ml的離心管中，同時(shí)加入0.3ml的去離子水，搖勻后，再在4500rmp條件下，離心3min；最后，取適量上層正己烷層，用色譜純的正己烷進(jìn)行稀釋，并加入無水硫酸鈉，預(yù)處理結(jié)束，準(zhǔn)備進(jìn)樣。色譜條件：thermofinnigantracedsq型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，采用db-5ms毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。起始柱溫50℃,以20℃/min升溫到250℃,保持2min。進(jìn)樣溫度200℃,載氣為氦氣，載氣流速1ml/min，不分流進(jìn)樣?？傔\(yùn)行時(shí)間為12min。萃取頭在進(jìn)樣口于200℃下脫附5min。質(zhì)譜檢測條件：ei源70ev，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃，掃描范圍50～400aum。
(7)燃燒性能評價(jià)
燃燒性能以十六烷值(cn)來評價(jià)生物柴油的燃燒性能，cn值采用lapuertaetal.(2009)andtongetal.(2010)所提到的模型進(jìn)行評估，評估模型如下:
對于飽和脂肪酸：
cn＝-107.71+31.126n-2.042n2+0.0499n3
對于單不飽和脂肪酸：
cn＝109-9.292n+0.354n2
對于多不飽和脂肪酸：
cn＝-21.157+(7.965-1.785db+0.235db2)n-0.099n2
對于混合脂肪酸體系：
cn＝1.068∑(cnimi)-6.747
其中，n代表脂肪酸的碳原子數(shù)量數(shù)，db代表雙鍵的數(shù)量。
此外，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例也是一個(gè)考核指標(biāo)，代表生物柴油的氧化穩(wěn)定性。
本發(fā)明方法中所用培養(yǎng)基的溶劑未明確標(biāo)示時(shí)均采用去離子水作為溶劑。
本發(fā)明方法中ph調(diào)節(jié)方式：用1mol/l的硫酸和2mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph。
本發(fā)明不僅能夠提高油脂的產(chǎn)量，還能有效的改善油脂的品質(zhì)，最終得到藻細(xì)胞的油脂含量在30％以上，cn值穩(wěn)定在50以上，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例在1.5-2.5，該發(fā)明從源頭原料上有效的調(diào)節(jié)了生物柴油的產(chǎn)量和品質(zhì)，滿足了微藻生物柴油工業(yè)化的應(yīng)用化要求，是一種較好的生產(chǎn)高品質(zhì)微藻生物柴油的方法。
本發(fā)明提出一種布朗葡萄藻生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油的方法，通過引入十六烷值，不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例等表征生物柴油品質(zhì)的指標(biāo)，來培養(yǎng)開始調(diào)控藻體的含油量和高油脂品質(zhì)的藻體細(xì)胞，從未生產(chǎn)高質(zhì)高量的生物柴油打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為了更好的理解本發(fā)明，特舉實(shí)施例如下：
實(shí)施例1：
(1)將裝有普通布朗葡萄藻的三角搖瓶接種至無菌光生物反應(yīng)器，在已滅好菌培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)；光生物反應(yīng)器系鼓泡式密閉反應(yīng)器，包括co2儲(chǔ)氣瓶、混氣裝置和氣體流量計(jì)；種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下：海鹽24g/l，ch3coona0.3g/l，nano3200mg/l，nah2po450mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5mg/l，vitaminb10.006mg/l，vitaminb20.00005mg/l，光源采用熒光燈，光照強(qiáng)度為8klux，光質(zhì)為白光，初始ph為6.0，通氣強(qiáng)度為0.2vvm，co2濃度為0.1％，培養(yǎng)溫度為23℃，培養(yǎng)8天，直到對數(shù)期，收集種子準(zhǔn)備下一階段發(fā)酵。
(2)細(xì)胞收集采用離心采集技術(shù)，在轉(zhuǎn)速為4000rmp情況下，常溫下離心10min，得到藻泥后，并用清水清洗3次，再在相同條件下，離心得到的藻泥，然后，用少量的清水均勻重懸，即為后續(xù)培養(yǎng)的種子。
(3)將準(zhǔn)備好的種子接到裝有培養(yǎng)基的光生物反應(yīng)器中，該反應(yīng)器為室內(nèi)開放式系統(tǒng)，包括co2儲(chǔ)氣瓶、混氣裝置和氣體流量計(jì)；該培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基為：海鹽28g/l，nano3400mg/l，nah2po440mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5mg/l，cuso4·5h2o0.01mg/l，znso4·7h2o0.04mg/l，cocl2·6h2o0.02mg/l，mncl2·4h2o0.3mg/l，na2moo4·2h2o0.2mg/l，vitaminb10.01mg/l，vitaminb20.0005mg/l，生物素0.0005mg/l，其中氮磷元素之比為20；
光自養(yǎng)培養(yǎng)條件：光質(zhì)為白光，光照強(qiáng)度為9klux，初始ph為6.5，通氣強(qiáng)度為0.6vvm，co2濃度為1.5％，培養(yǎng)溫度為25℃。
培養(yǎng)7天后，以硫酸鐵為絮凝劑進(jìn)行絮凝，用超聲法超生1h進(jìn)行破碎，以等體積比例的氯仿、甲醇和水為有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。
對萃取出來的油脂的含量進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析和燃燒性能評價(jià)，油脂含量達(dá)到35％，cn值為52.0。
實(shí)施例2：
步驟同實(shí)施例1，但是光自養(yǎng)培養(yǎng)條件為：光質(zhì)為藍(lán)光，光照強(qiáng)度為9klux，初始ph為6.5，通氣強(qiáng)度為0.6vvm，co2濃度為1.5％，培養(yǎng)溫度為25℃。油脂含量達(dá)到36％，cn值為53.0。
實(shí)施例3：
步驟同實(shí)施例1，但是光自養(yǎng)培養(yǎng)條件為：光質(zhì)為白光，光照強(qiáng)度為10klux，初始ph為7.5，通氣強(qiáng)度為1.0vvm，co2濃度為2.0％，培養(yǎng)溫度為24℃。油脂含量達(dá)到42％，cn值為55.0。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明提供了一種以布朗葡萄藻生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油原料的方法，其中以普通布朗葡萄藻為藻種，采用較溫和的光照和光質(zhì)、充足的營養(yǎng)及適宜的氮磷比、和適宜的溫度等條件，促進(jìn)微藻細(xì)胞的快速生長、油脂的積累和油脂品質(zhì)的穩(wěn)定和改善；
本發(fā)明不僅能夠提高布朗葡萄藻油脂的產(chǎn)量，還能有效的改善油脂的品 質(zhì)，最終得到藻細(xì)胞的油脂含量在30％以上，cn值穩(wěn)定在50以上，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例在1.5-2.5，本發(fā)明從源頭原料上有效的調(diào)節(jié)了生物柴油的產(chǎn)量和品質(zhì)，滿足了微藻生物柴油工業(yè)化的應(yīng)用化要求，是一種較好的生產(chǎn)高品質(zhì)微藻生物柴油的方法。
當(dāng)然，本發(fā)明還可有其它多種實(shí)施例，在不背離本發(fā)明精神及其實(shí)質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。