本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種從灰灰菜(chenopodiumalbumlinn)中分離得到新生物堿化合物，以及其在制備抗癌藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：：灰灰菜(chenopodiumalbumlinn)為黎科黎屬一年生草本植物，全草可入藥，亦可作為野菜而食用，種子可榨油。灰灰菜廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū),資源非常豐富，是我國(guó)重要的藥食兩用植物。灰灰菜，味甘、平，具有清熱、降壓、殺蟲(chóng)、解毒等功效，臨床上常用于治療痢疾、腹瀉等疾病。為充分開(kāi)發(fā)灰灰菜在醫(yī)藥方面的潛在價(jià)值，深入挖掘其有效成分是非常必要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是涉及一種從灰灰菜(chenopodiumalbumlinn)中分離得到新生物堿化合物，以及其在制備抗癌藥物中的用途。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：一種新生物堿化合物，分子式為：c16h15no4，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：上述生物堿化合物的制備方法，包括如下步驟：（1）用乙醇提取灰灰菜，得到灰灰菜乙醇提取物；（2）采用酸溶堿沉法從灰灰菜乙醇提取物中分離出總生物堿；（3）將步驟（2）的總生物堿用石油醚溶解，上硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯體積為8:1時(shí)的洗脫液，干燥得到亞餾分i；（4）將步驟（3）所得亞餾分i用石油醚溶解，上硅膠柱，用石油醚-丙酮洗脫，收集石油醚-丙酮體積為9:1時(shí)的洗脫液，干燥得到亞餾分ii；（5）將步驟（4）的亞餾分ii用純甲醇溶解，上sephadexlh-20柱和toyopearlhw-40柱進(jìn)行純化，流動(dòng)相為純甲醇，然后再用半制備液相（c18柱）進(jìn)行分離，流動(dòng)相：90-95vt%的甲醇，吸收波長(zhǎng)：210nm。優(yōu)選地，步驟（1）采用濃度為85～95vt%的乙醇進(jìn)行提取。料液比可控制在2:1～1:1w/w。優(yōu)選地，步驟（2）所述酸溶堿沉法的具體操作為：將灰灰菜乙醇提取物用濃度為1.2～1.6wt%的鹽酸溶液溶解，過(guò)濾除去酸不溶物后，再調(diào)節(jié)ph至8～10，用氯仿萃取，得到總生物堿。優(yōu)選地，步驟（3）所述硅膠柱的硅膠目數(shù)為100～200目，步驟（4）所述硅膠柱的硅膠目數(shù)為200～300目。上述生物堿化合物作為活性成分在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，如抗肝癌藥物、抗乳腺癌藥物、抗肺癌藥物和抗結(jié)腸癌藥物。本發(fā)明采用酸溶堿沉法富集灰灰菜中的總生物堿，綜合利用各種柱層析色譜和半制備色譜從總生物堿中分離得到一種新生物堿化合物，該化合物結(jié)構(gòu)新穎，并且提取與分離方法簡(jiǎn)便、快捷，效率較高。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該化合物具有顯著的抗癌活性，在研制新的抗癌藥物中具有潛在價(jià)值，提高灰灰菜在醫(yī)藥方面的經(jīng)濟(jì)效益。附圖說(shuō)明附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：圖1是生物堿單體化合物1的制備流程圖；圖2是生物堿單體化合物1的偶聯(lián)相關(guān)圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1一、生物堿單體的制備流程如圖1所示，具體操作如下：（1）取干燥的灰灰菜地上部分18.0千克為原料，用90vt%的乙醇(11l×3)回流提取3次，每次2.5小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到1.6千克稠膏。將此稠膏分散在4000毫升1.4wt%hcl溶液中，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，除去酸不溶性成分，再用氨水將溶液調(diào)至ph=9.5，再用chcl3進(jìn)行萃取，干燥，得到總生物堿21.6克。（2）將步驟（1）所得的總生物堿用石油醚溶解，上硅膠柱（硅膠100-200目），進(jìn)行柱層析分離，依次采用15:1、8:1、4:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯洗脫，分別收集洗脫液，干燥得到3個(gè)亞餾分：a（4.58克）、b（8.95克）、c（3.95克）。（3）將亞餾分b用石油醚溶解，上硅膠柱（硅膠200-300目），進(jìn)行柱層析分離，依次用12:1、9:1、6:1、4:1(v/v)的石油醚-丙酮洗脫，分別收集洗脫液，干燥得到亞餾分b1（1.84克）、b2（3.46克）、b3（2.05克）、b4（1.26克）。（4）將步驟（4）的亞餾分b2用純甲醇溶解，上sephadexlh-20柱和toyopearlhw-40柱進(jìn)行純化，流動(dòng)相為純甲醇，然后再用半制備液相（c18柱）進(jìn)行分離，流動(dòng)相：90-95vt%的甲醇，吸收波長(zhǎng)：210nm，流速：7ml/min，如分離的單體不夠純凈，可重復(fù)進(jìn)行半制備色譜分離，直至分離得到生物堿單體化合物1（8.25毫克），過(guò)sephadexlh-20柱和toyopearlhw-40柱的順序并無(wú)特別的要求?；衔锏?hnmr(dmso-d6，400mhz)和13cnmr(dmso-d6，100mhz)數(shù)據(jù)見(jiàn)table1。表1化合物1的1hnmr、13cnmr和hmbc相關(guān)數(shù)據(jù)利用化合物1的波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)，鑒定該化合物為一生物堿化合物，分子式：c16h15no4，結(jié)構(gòu)式為：，命名為：n-benzylalternamideb。化合物1的hmbc、1h-1hcosy等偶聯(lián)相關(guān)見(jiàn)圖2。二、化合物1的抗癌活性（1）儀器、試劑和細(xì)胞株滅菌鍋，酶標(biāo)儀，co2恒溫培養(yǎng)箱，顯微鏡，co2恒溫培養(yǎng)箱，96孔微量稀釋板，高速離心機(jī)。胰酶，pbs，mtt液，dmso，優(yōu)級(jí)新生牛血清。陽(yáng)性對(duì)照品：順鉑。肝癌細(xì)胞（smmc-7721），乳腺癌細(xì)胞（mcf-7），肺癌細(xì)胞（a-549）、hct116（人結(jié)腸癌細(xì)胞）。（2）mtt法原理3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯四氮唑溴鹽（mtt）是一種能夠接受h+的黃色染料。在活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀脫氫酶和細(xì)胞色素c的作用下，mtt代謝生成藍(lán)紫色formazan結(jié)晶，此結(jié)晶的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比關(guān)系且該結(jié)晶在dmso溶液中存在最大吸收峰約570nm。因此，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。（3）測(cè)定方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后充分吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后稀釋成1×104cell/ml接種到96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)12h后加入化合物1。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和空白組，并且每個(gè)細(xì)胞株，每個(gè)濃度梯度需做三組平行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞在37℃、5%co2條件下培養(yǎng)48h后，離心除去培養(yǎng)液，用pbs沖洗2-3次，加5mg/mlmtt液并用生理鹽水分別配置20μl/孔，培養(yǎng)4h后除去培養(yǎng)液，再加入dmso100μl/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至固體物充分溶解，然后用酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm處的光密度值。根據(jù)下面公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生成抑制率，再以藥物濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生成抑制率作圖得到計(jì)量曲線(xiàn)，從曲線(xiàn)上讀取藥物的半數(shù)抑制濃度（ic50）值。計(jì)算公式：細(xì)胞的抑制率%=[(對(duì)照組的od值-加藥組的od值)/對(duì)照組od的值]×100%。（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用mtt法對(duì)分離得到的化合物1進(jìn)行了抗腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試，按照測(cè)定方法計(jì)算細(xì)胞的抑制率，并以藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，擬合回歸方程，計(jì)算ic50值。篩選結(jié)果見(jiàn)表2。表2化合物1的抗癌活性篩選結(jié)果（5）結(jié)論上述mtt法藥理篩選結(jié)果表明，化合物1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有顯著地抑制作用，可以作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑用于抗腫瘤的研究。因此，本發(fā)明所述的新生物堿化合物對(duì)于研制具有抗腫瘤的藥物具有重要意義。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12