本發(fā)明屬于病源微生物分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的人畜共患致病菌，廣泛分布自然界，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒是個(gè)世界性衛(wèi)生問(wèn)題，易導(dǎo)致肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等臨床癥狀。

金黃色葡萄球菌作為一種重要的食源性致病菌亦是進(jìn)出口動(dòng)物性食品必檢微生物。傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括，包括分離培養(yǎng)和理化鑒定、血漿凝固酶試驗(yàn)和毒素檢測(cè)試驗(yàn)等，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要3-5天，且靈敏性差。PCR技術(shù)也已用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，但需要較高的實(shí)驗(yàn)條件，昂貴的儀器設(shè)備和操作專業(yè)人員，且檢測(cè)過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)成本較高，基層單位難以開(kāi)展。并且需要對(duì)菌進(jìn)行裂解才能檢測(cè)，無(wú)法用于活菌的直接檢測(cè)大大限制了這些技術(shù)的應(yīng)用。

因此，迫切需要建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的金黃色葡萄球菌活菌檢測(cè)方法，這對(duì)于預(yù)防和控制金黃色葡萄球菌的感染，增強(qiáng)食品安全性和保障人體健康具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)試劑盒，包括雜交緩沖液、核酸內(nèi)切酶、猝滅熒光的納米顆粒和下列核酸序列：

核酸序列H1：依次具有A、B、C區(qū)域，其中A區(qū)域?yàn)榻瘘S色葡萄球菌的核酸適體，C與A部分互補(bǔ)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，A與C不互補(bǔ)的序列凸起于莖環(huán)結(jié)構(gòu)外側(cè)，B構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部分，B中包含一段與H2的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列；

核酸序列H2：具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，H2的一端修飾基團(tuán)，固定在能猝滅熒光的納米顆粒上，另一端修飾相應(yīng)的熒光基團(tuán)；H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上包含有一段核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)序列，與H1的B區(qū)域的相應(yīng)序列互補(bǔ)。

優(yōu)選的，H1的A區(qū)域的核酸序列為：

5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-3'。

優(yōu)選的，B區(qū)域的堿基數(shù)為7-15個(gè)，更優(yōu)選為11個(gè)。

優(yōu)選的，C區(qū)域的堿基數(shù)6-10個(gè)，更優(yōu)選為8個(gè)。

優(yōu)選的，H2的環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)為7-18個(gè)，更優(yōu)選為15個(gè)。

優(yōu)選的，H2的莖部分的堿基數(shù)為5-9個(gè)，更優(yōu)選為6個(gè)。

優(yōu)選的，核酸內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)特定的識(shí)別序列，通過(guò)結(jié)合識(shí)別序列，對(duì)識(shí)別序列進(jìn)行切割；具體包括Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Nt.BbvCI時(shí)，H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上包含有一段5'-CCTCAGC-3'的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTGAGG-3'序列。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Bmtl時(shí)，H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上包含有一段5'-GCTAGC-3'核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTAGC-3'序列。

優(yōu)選的，能猝滅熒光的納米顆粒包括金納米顆粒、石墨烯納米顆粒、碳納米管、銀納米顆粒，所述作為固定材料的納米顆粒直接與H2的修飾基團(tuán)結(jié)合，或是通過(guò)納米顆粒上修飾對(duì)應(yīng)的基團(tuán)與H2的修飾基團(tuán)結(jié)合。

優(yōu)選的，H2的一端修飾巰基，固定在金納米顆粒上；或H2的一端修飾羥基，固定在修飾了羧基的納米顆粒上；或H2的一端修飾了生物素，固定在修飾了SA的納米顆粒上。

優(yōu)選的，熒光基團(tuán)為FAM、Cy3、Cy5。

優(yōu)選的，雜交緩沖液為10 mM Tris-HCl，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100 ug/ml BSA。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述檢測(cè)試劑盒包括核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列：

核酸序列H1:

5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-GTGCTGAGGAT-ATAACGCA-3'（SEQ ID NO：1）；

核酸序列H2: 5'-GCTACGTGATCCTCAGCACACCGTAGC-3'（SEQ ID NO：2）。

一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，包括下列步驟：

（1）先用雜交緩沖液分別溶解核酸H1和H2，1μM的H2固定在納米顆粒表面；（H2用雜交緩沖液溶解后，加入納米顆粒如膠體金，便可以完成固定；而且多個(gè)H2可以固定在同一個(gè)膠體金上）；

（2）在500 nM的H1中加入待測(cè)溶液，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；然后加入到步驟（1）中的H2溶液中，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；

（3）加入25 U的核酸內(nèi)切酶如Nt.BbvCI，充分混勻，室溫反應(yīng)90分鐘；12000 rpm離心后保留上清，用于熒光檢測(cè)，激發(fā)峰為495 nm，發(fā)射峰為525 nm；根據(jù)熒光發(fā)射光強(qiáng)度與金黃色葡萄球菌濃度呈正相關(guān)來(lái)判斷結(jié)果；

其中，雜交緩沖液、核酸內(nèi)切酶和核酸序列H1和H2如上述任一項(xiàng)所述。

本發(fā)明方法的反應(yīng)原理如下（見(jiàn)圖1）：

（1）莖環(huán)結(jié)構(gòu) H1上的A序列是金黃色葡萄球菌的核酸適體，能與金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合，隨后打開(kāi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)H1，使B暴露出來(lái)。B中包含一段與H2的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列。C與部分A互補(bǔ)。

（2）莖環(huán)結(jié)構(gòu)H2的一端修飾巰基，固定在納米顆粒（如膠體金）上，另一端修飾熒光基團(tuán)。由于熒光基團(tuán)靠近膠體金，會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，淬滅熒光，此時(shí)體系只有很低的背景熒光。膠體金可以用其他納米材料替換，只要能淬滅熒光即可，包括石墨烯、碳納米管、銀納米顆粒等。

H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上含有核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割位點(diǎn)，環(huán)的堿基數(shù)為7-18個(gè)，優(yōu)選的為15個(gè)。莖部分的堿基數(shù)為5-9個(gè)，優(yōu)選的為6個(gè)。

（3）步驟（1）暴露后的H1加入到步驟（2）中，H1的B能與H2的環(huán)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，形成雙鏈DNA。加入核酸內(nèi)切酶（Nt.BbvCI）后， 可識(shí)別雙鏈DNA中的酶切位點(diǎn)，把H2切割成兩部分。也可以用其他的核酸內(nèi)切酶（例如：Bmtl），只要替換對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列，也能完成檢測(cè)。

（4）H2含熒光基團(tuán)的一端掉落，遠(yuǎn)離膠體金，熒光能量轉(zhuǎn)移消失恢復(fù)熒光。同時(shí)H1會(huì)釋放掉落，進(jìn)入下一輪循環(huán)，不斷與H2相互作用，并進(jìn)一步在酶的作用下發(fā)生切割反應(yīng)，不斷使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離膠體金，最后大量恢復(fù)熒光。熒光強(qiáng)度與金黃色葡萄球菌的濃度呈正相關(guān)，從而達(dá)到檢測(cè)目的。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）可檢測(cè)金黃色葡萄球菌活菌，無(wú)需對(duì)菌就行裂解提取，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速；

（2）只需使用一種工具酶完成信號(hào)擴(kuò)增，無(wú)需使用多種酶；

（3）可在室溫下完成反應(yīng)，靈敏度高、選擇性好。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所述的檢測(cè)方法的原理圖；

圖2為對(duì)不同濃度的金黃色葡萄球菌的結(jié)果圖；

圖3為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)試劑盒，包括雜交緩沖液、核酸內(nèi)切酶、猝滅熒光的納米顆粒和下列核酸序列：

核酸序列H1：依次具有A、B、C區(qū)域，其中A區(qū)域?yàn)榻瘘S色葡萄球菌的核酸適體，C與A部分互補(bǔ)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，A與C不互補(bǔ)的序列凸起于莖環(huán)結(jié)構(gòu)外側(cè)，B構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部分，B中包含一段與H2的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列；

核酸序列H2：具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，H2的一端修飾基團(tuán)，固定在能猝滅熒光的納米顆粒上，另一端修飾相應(yīng)的熒光基團(tuán)；H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上包含有一段核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)序列，與H1的B區(qū)域的相應(yīng)序列互補(bǔ)。

優(yōu)選的，H1的A區(qū)域的核酸序列為：

5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-3'。

優(yōu)選的，B區(qū)域的堿基數(shù)為7-15個(gè)，更優(yōu)選為11個(gè)。

優(yōu)選的，C區(qū)域的堿基數(shù)6-10個(gè)，更優(yōu)選為8個(gè)。

優(yōu)選的，H2的環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)為7-18個(gè)，更優(yōu)選為15個(gè)。

優(yōu)選的，H2的莖部分的堿基數(shù)為5-9個(gè)，更優(yōu)選為6個(gè)。

優(yōu)選的，核酸內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)特定的識(shí)別序列，通過(guò)結(jié)合識(shí)別序列，對(duì)識(shí)別序列進(jìn)行切割；具體包括Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Nt.BbvCI時(shí)，H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上包含有一段5'-CCTCAGC-3'的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTGAGG-3'序列。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Bmtl時(shí)，H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上包含有一段5'-GCTAGC-3'核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTAGC-3'序列。

優(yōu)選的，能猝滅熒光的納米顆粒包括金納米顆粒、石墨烯納米顆粒、碳納米管、銀納米顆粒，所述作為固定材料的納米顆粒直接與H2的修飾基團(tuán)結(jié)合，或是通過(guò)納米顆粒上修飾對(duì)應(yīng)的基團(tuán)與H2的修飾基團(tuán)結(jié)合。

優(yōu)選的，H2的一端修飾巰基，固定在金納米顆粒上；或H2的一端修飾羥基，固定在修飾了羧基的納米顆粒上；或H2的一端修飾了生物素，固定在修飾了SA的納米顆粒上。

優(yōu)選的，熒光基團(tuán)為FAM、Cy3、Cy5。

優(yōu)選的，雜交緩沖液為10 mM Tris-HCl，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100 ug/ml BSA。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述檢測(cè)試劑盒包括核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列：

核酸序列H1:

5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-GTGCTGAGGAT-ATAACGCA-3'（SEQ ID NO：1）；

核酸序列H2: 5'-GCTACGTGATCCTCAGCACACCGTAGC-3'（SEQ ID NO：2）。

一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，包括下列步驟：

（1）先用雜交緩沖液分別溶解核酸H1和H2，1μM的H2固定在納米顆粒表面；（H2用雜交緩沖液溶解后，加入納米顆粒如膠體金，便可以完成固定；而且多個(gè)H2可以固定在同一個(gè)膠體金上）；

（2）在500 nM的H1中加入待測(cè)溶液，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；然后加入到步驟（1）中的H2溶液中，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；

（3）加入25 U的核酸內(nèi)切酶如Nt.BbvCI，充分混勻，室溫反應(yīng)90分鐘；12000 rpm離心后保留上清，用于熒光檢測(cè)，激發(fā)峰為495 nm，發(fā)射峰為525 nm；根據(jù)熒光發(fā)射光強(qiáng)度與金黃色葡萄球菌濃度呈正相關(guān)來(lái)判斷結(jié)果；

其中，雜交緩沖液、核酸內(nèi)切酶和核酸序列H1和H2如上述任一項(xiàng)所述。

本發(fā)明方法的反應(yīng)原理如下（見(jiàn)圖1）：

（1）莖環(huán)結(jié)構(gòu) H1上的A序列是金黃色葡萄球菌的核酸適體，能與金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合，隨后打開(kāi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)H1，使B暴露出來(lái)。B中包含一段與H2的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列。C與部分A互補(bǔ)。

（2）莖環(huán)結(jié)構(gòu)H2的一端修飾巰基，固定在納米顆粒（如膠體金）上，另一端修飾熒光基團(tuán)。由于熒光基團(tuán)靠近膠體金，會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，淬滅熒光，此時(shí)體系只有很低的背景熒光。膠體金可以用其他納米材料替換，只要能淬滅熒光即可，包括石墨烯、碳納米管、銀納米顆粒等。

H2的環(huán)結(jié)構(gòu)上含有核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割位點(diǎn)，環(huán)的堿基數(shù)為7-18個(gè)，優(yōu)選的為15個(gè)。莖部分的堿基數(shù)為5-9個(gè)，優(yōu)選的為6個(gè)。

（3）步驟（1）暴露后的H1加入到步驟（2）中，H1的B能與H2的環(huán)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，形成雙鏈DNA。加入核酸內(nèi)切酶（Nt.BbvCI）后， 可識(shí)別雙鏈DNA中的酶切位點(diǎn)，把H2切割成兩部分。也可以用其他的核酸內(nèi)切酶（例如：Bmtl），只要替換對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列，也能完成檢測(cè)。

（4）H2含熒光基團(tuán)的一端掉落，遠(yuǎn)離膠體金，熒光能量轉(zhuǎn)移消失恢復(fù)熒光。同時(shí)H1會(huì)釋放掉落，進(jìn)入下一輪循環(huán)，不斷與H2相互作用，并進(jìn)一步在酶的作用下發(fā)生切割反應(yīng)，不斷使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離膠體金，最后大量恢復(fù)熒光。熒光強(qiáng)度與金黃色葡萄球菌的濃度呈正相關(guān)，從而達(dá)到檢測(cè)目的。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

實(shí)施例1

一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，按照如下步驟進(jìn)行：

（1）先用Tris-HCl緩沖液（10 mM，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100 μg/ml BSA）分別溶解核酸H1和H2。1μM的H2固定在膠體金納米顆粒表面（H2用雜交緩沖液溶解后，加入膠體金，便可以完成固定；而且多個(gè)H2可以固定在同一個(gè)膠體金上）。

（2）在500 nM的H1中加入不同濃度的金黃色葡萄球菌，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘。然后加入到步驟（1）中的膠體金溶液中，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘。

（3）加入25 U的核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI，充分混勻，室溫反應(yīng)90分鐘。12000 rpm離心后保留上清，用于熒光檢測(cè)，激發(fā)峰為495 nm，發(fā)射峰為525 nm。熒光發(fā)射光強(qiáng)度與金黃色葡萄球菌濃度呈正相關(guān)。

實(shí)施例2

一種金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒包括以下成分：

（1）核酸序列H1和H2以及相應(yīng)的修飾基團(tuán)如下：

H1:5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT（A）-GTGCTGAGGAT（B）-ATAACGCA（C）-3' （SEQ ID NO：1）；

H2: 5'-SH-GCTACGTGATCC↓TCAGCACACCGTAGC-FAM3' （箭頭表示切割位點(diǎn)）（SEQ ID NO：2）；

（2）膠體金納米顆粒；

（3）核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI；

（4）緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100μg/ml BSA）。

實(shí)施例3

對(duì)不同濃度金黃色葡萄球菌的檢測(cè)：

配制金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為1x10¹ cfu/mL、 1x10² cfu/mL、 1x10³cfu/mL、1x10⁴ cfu/mL、1x10⁵cfu/mL、1x10⁶ cfu/mL 4℃保存。將不同濃度的金黃色葡萄球菌溶液分別加到實(shí)施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，如圖2所示，隨著金黃色葡萄球菌濃度的增加，對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)金黃色葡萄球菌濃度超過(guò)1x10⁵cfu/mL時(shí)，逐漸達(dá)到飽和。以金黃色葡萄球菌濃度的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，二者具有很好的線性關(guān)系，線性范圍是從 1x10¹ cfu/mL 到 1x10⁵cfu/mL，線性方程是：F = 14 lgC -15 (R² =0.995)（F為熒光強(qiáng)度，C為金黃色葡萄球菌濃度），按照3倍信噪比標(biāo)準(zhǔn)（3S/N），檢測(cè)限為 5 cfu/mL。

實(shí)施例4

特異性實(shí)驗(yàn)：

配制濃度為1x10³ cfu/mL的不同菌溶液，分別是沙門氏菌、大腸桿菌、地桿菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、布魯氏桿菌。將1x10³ cfu/mL的不同菌溶液和1x10² cfu/mL金黃色葡萄球菌溶液分別加到實(shí)施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，如圖3所示，1x10³ cfu/mL的沙門氏菌、大腸桿菌、地桿菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、布魯氏桿菌的熒光強(qiáng)度與空白樣品相比，變化不大，對(duì)檢測(cè)不產(chǎn)生影響。只有當(dāng)加入金黃色葡萄球菌溶液才會(huì)使熒光強(qiáng)度明顯增加，這證明該方法對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)具有很好的特異性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所

<120> 一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgccctctc acgtggcact cagagtgccg gaagttctgc gttatgtgct gaggatataa 60

cgca 64

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctacgtgat cctcagcaca ccgtagc 27