本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的抗VEGFR-2單克隆抗體。

背景技術(shù)：

腫瘤生長依賴新生血管的形成已經(jīng)在腫瘤生物學(xué)上研究的比較透徹。血管生成可提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、荷爾蒙及蛋白水解酶,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，加速腫瘤的生長和惡化。血管生成是一個高度復(fù)雜的動態(tài)過程,由許多促/抗血管生成分子調(diào)節(jié)。血管生成的開關(guān)被認(rèn)為是促血管生成超過抗血管生成的一個惡性標(biāo)志。VEGF/VEGFR軸觸發(fā)多重信號網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)致上皮細(xì)胞存活、有絲分裂、轉(zhuǎn)移和分化、血管滲透，VEGF及其受體在正常和病理血管生成中發(fā)揮著中樞作用。在人類許多種癌癥中,增加的腫瘤血管化作用和腫瘤促血管生成因子的表達(dá)被證實(shí)與腫瘤的分級和惡性與否有關(guān)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)又稱血管通透因子,它是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂源,也是一種有效的血管形成和通透性誘導(dǎo)因子，已被鑒定的相應(yīng)受體為VEGFR-1(Flt-1，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶1)，VEGFR-2(又稱為KDR/Flk-1,激酶插入嵌合受體、胎肝激酶-1)，VEGFR-3(Flt4)，神經(jīng)纖維蛋白-1(neuropilin-1)，神經(jīng)纖維蛋白-2。VEGFR-2是血管內(nèi)皮細(xì)胞上的主要VEGF受體，是一種糖蛋白，其胞外區(qū)含有七個免疫球蛋白樣區(qū)(含配體結(jié)合域和受體二聚化結(jié)構(gòu)域)，胞內(nèi)插入了酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域，主要在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，其他如巨核細(xì)胞、視網(wǎng)膜遠(yuǎn)祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞如黑色素瘤細(xì)胞、腦瘤和某些白血病細(xì)胞等。VEGF和VEGFR-2受體作為關(guān)鍵的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異因子信號傳導(dǎo)途徑的分子參與腫瘤新生血管的生成，VEGF的主要生物學(xué)功能都是通過VEGFR-2實(shí)現(xiàn)，VEGFR-2和VEGF結(jié)合后發(fā)生二聚體化，并且VEGFR-2胞內(nèi)的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而激活并將細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)激酶級聯(lián)反應(yīng)信號傳遞到細(xì)胞核，可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的一系列變化，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移以及基因表達(dá)等，并最終引起血管增生。

由于VEGF/VEGFR2信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，因此有不少針對VEGF/VEGFR2的信號通路的藥物，如抗VEGF抗體貝伐單抗和抗VEGFR-2的抗體雷莫蘆單抗。

抗體是生物醫(yī)藥中技術(shù)含量最高、難度最大的一類藥物，從2012年起，全球銷售排名前十名的單藥中有六個是抗體類藥物，因此，抗體類藥物市場的發(fā)展?jié)摿薮蟆？贵w藥物篩選最普遍應(yīng)用的技術(shù)是噬菌體抗體庫技術(shù)，噬菌體抗體庫技術(shù)是繼噬菌體展示技術(shù)發(fā)展而來的一項(xiàng)基因抗體工程的新技術(shù)，它可將含不同物種的全部抗體可變區(qū)基因的基因庫轉(zhuǎn)化成展示在噬菌體表面的蛋白庫，不僅使單克隆抗體的生產(chǎn)更方便、快速、高效地在體外進(jìn)行,還開辟了單克隆抗體人源化的新途徑,促進(jìn)了人類單克隆抗體生產(chǎn)的發(fā)展。我公司專利號為CN103333247 B的專利就是通過計算機(jī)輔助設(shè)計和噬菌體抗體庫技術(shù)篩選得到的一系列抗VEGFR-2的抗體，為獲得抗VEGFR-2的抗體藥物奠定了基礎(chǔ)，我公司在進(jìn)一步地研究中發(fā)現(xiàn)，上述專利中涉及的抗體在親和力和生物學(xué)活性等方面還存在進(jìn)一步的提升可能，基于此，我們在原有的研究基礎(chǔ)上，對上述抗體進(jìn)行了改進(jìn)性優(yōu)化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的抗VEGFR-2單克隆抗體；本發(fā)明以CN103333247B專利中親和力最高的兩個為模板，進(jìn)行計算機(jī)輔助模擬設(shè)計，設(shè)計了新的噬菌體抗體庫，并進(jìn)行了多輪篩選，得到了一株親和力和生物學(xué)活性均高于原專利抗體的新的抗VEGFR-2單克隆抗體。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的抗VEGFR-2單克隆抗體，包括：

輕鏈和重鏈；所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ NO.1、SEQ NO.2或SEQ NO.3中的任一種；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ NO.4。

其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的抗體、多肽或蛋白。

其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)氨基酸序列的多核苷酸序列或組合。

其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述多核苷酸序列或組合的重組DNA表達(dá)載體；所述重組DNA表達(dá)載體的DNA序列中包含編碼抗VEGFR-2抗體的上述重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。

其中，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)染上述重組DNA表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌或酵母；優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞；進(jìn)一步優(yōu)選HEK293E細(xì)胞、CHO細(xì)胞或NS0細(xì)胞。

其中，本發(fā)明的重鏈恒定區(qū)選自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b。

其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的全長抗體和抗T1h單克隆抗體的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或ScFv。

其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的單鏈抗體、單域抗體、雙特異抗體、抗體藥物偶聯(lián)物和嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。

其中，本發(fā)明還提供了一種含有上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的單克隆抗體、人工載體、藥物或藥物組合物。

其中，本發(fā)明還提供了一種含有上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的檢測試劑或試劑盒。

其中，所述抗體可用于治療新生血管引起的疾病，所述疾病包括但不限于腫瘤和黃斑變性。

其中，所述ScFv為單鏈抗體(single-chain fragment variable)；所述HEK293E細(xì)胞為人胚腎293E細(xì)胞(human embryonic kidney 293E cell)；CHO細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞(chinese hamster ovary cell)；NS0細(xì)胞為小鼠NS0胸腺瘤細(xì)胞。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的抗VEGFR-2單克隆抗體具有較高的親和力，在體外能夠很好的抑制VEGFR-2和其配體VEGF的結(jié)合，在體外具有良好的生物學(xué)活性；開發(fā)前景廣闊。

本發(fā)明提供的抗VEGFR-2單克隆抗體用于治療由腫瘤新生血管生成引起的疾病，包括但不限于下列疾病：非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌、HER2陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性胃腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌等癌癥以及黃斑變性等疾病。

說明書附圖

圖1、pScFvDisb-S質(zhì)粒圖譜；

圖2、梯度ELISA比較抗VEGFR-2單鏈抗體的相對親和力；

圖3、蛋白質(zhì)表達(dá)pTSE質(zhì)粒圖譜；

圖4、抗VEGFR-2單克隆抗體與KDR結(jié)合能力比較；

圖5、本發(fā)明抗體與細(xì)胞表面的VEGFR-2結(jié)合情況；

圖6、本發(fā)明抗體對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC增殖抑制作用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明詳細(xì)的實(shí)施方法參見實(shí)施例，實(shí)施例中所述的實(shí)驗(yàn)方法和試劑，若無特殊說明均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法和試劑。以下實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的抗VEGFR-2單克隆抗體，包括：

輕鏈和重鏈；所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ NO.1、SEQ NO.2或SEQ NO.3中的任一種；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ NO.4；

SEQNO.1(VEGFR-2輕鏈可變區(qū)序列1)：DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQAIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；

SEQ NO.2(VEGFR-2輕鏈可變區(qū)序列2)：DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASDAIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEASNLDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；

SEQ NO.3(VEGFR-2輕鏈可變區(qū)序列3)：DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；

SEQNO.4(VEGFR-2重鏈可變區(qū)序列1)：QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASAFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDLWGQGTMVTVSS。

優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的抗體、多肽或蛋白。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)氨基酸序列的多核苷酸序列或組合。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種包含上述多核苷酸序列或組合的重組DNA表達(dá)載體；所述重組DNA表達(dá)載體的DNA序列中包含編碼抗VEGFR-2抗體的上述重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)染上述重組DNA表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌或酵母；優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞；進(jìn)一步優(yōu)選HEK293E細(xì)胞、CHO細(xì)胞或NS0細(xì)胞。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明的重鏈恒定區(qū)選自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的全長抗體和抗T1h單克隆抗體的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或ScFv。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的單鏈抗體、單域抗體、雙特異抗體、抗體藥物偶聯(lián)物和嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種含有上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的單克隆抗體、人工載體、藥物或藥物組合物。

更加優(yōu)選地，所述單克隆抗體是全人源的。

更加優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種含有上述輕鏈可變區(qū)或上述重鏈可變區(qū)的檢測試劑或試劑盒。

更加優(yōu)選地，所述抗體可用于治療新生血管引起的疾病，包括但不限于非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌、HER2陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性胃腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌等癌癥以及黃斑變性等疾病。

具體實(shí)施例

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例詳述本發(fā)明。

實(shí)施例1、抗VEGFR-2的單鏈抗體的生物淘選

采用一系列基因克隆的方法對載體pCom3載體(購自中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心)進(jìn)行改造，使之用于噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建和表達(dá)。改造后的載體命名為pScFvDisb-S，其質(zhì)粒圖譜如圖1所示，并以此載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建基于專利CN10333247B中抗體序列的新的全合成噬菌體抗體庫。

以VEGFR-2胞外區(qū)為抗原包被免疫管，抗原包被量為2ug/500ul/管，4℃包被過夜。再用4％脫脂奶粉/PBST分別封閉免疫管和全合成噬菌體抗體庫，室溫封閉1小時。封閉后的噬菌體抗體庫加入免疫管中進(jìn)行抗原抗體結(jié)合，噬菌體投入量約為10⁹-10¹²個，室溫反應(yīng)1小時。PBST-PBS清洗多次以除去未結(jié)合的噬菌體，0.1M PH2.2的甘氨酸洗脫，用1.5M PH8.8的Tris-HCl中和洗脫下來的噬菌體抗體溶液至PH 7.0左右。

將上述中和后的噬菌體感染10ml生長至對數(shù)期的TG1菌液，37℃培養(yǎng)箱中靜置30min，取出部分菌液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于2YTAG平板上，用于計算噬菌體產(chǎn)出量。剩余的菌液離心棄上清，將菌體沉淀重懸于少量培養(yǎng)基，吸出后涂布于2YTAG大平板，為下一輪篩選做準(zhǔn)備。

將上述感染后涂板的菌體從大平板上刮下，接菌至2YTAG液體培養(yǎng)基，搖至對數(shù)期后加入M13輔助噬菌體超感染，28℃培養(yǎng)過夜擴(kuò)增噬菌體，PEG6000-NaCl沉降純化噬菌體用于下一輪篩選。共進(jìn)行三輪噬菌體庫富集篩選。

實(shí)施例2、抗VEGFR2噬菌體單鏈抗體陽性克隆的鑒定

經(jīng)過三輪篩選后，挑取分隔良好的單克隆菌落，接種于加有2YTAG液體培養(yǎng)基的96孔深孔板，37℃，220rpm培養(yǎng)至其對數(shù)生長期，每孔加入約10¹⁰的輔助噬菌體M13KO7，37℃靜止感染30分鐘。4000rpm，4℃離心15分鐘，棄去上清，菌體用2YTAK重懸沉淀，28℃，220rpm培養(yǎng)過夜。吸取含噬菌體上清進(jìn)行ELISA鑒定,用相同載體同樣構(gòu)建方法的CN10333247B的生物學(xué)抗體序列(重鏈為CN10333247B序列的No.3,輕鏈為CN10333247B序列No.9)的噬菌體作為陽性對照(命名為O-1)。篩選得到親和力較高的單克隆抗體N-1、N-2和N-3，基因測序確定為不同于原專利CN10333247B中序列。

實(shí)施例3、梯度稀釋噬菌體ELISA比較抗VEGFR2單鏈抗體的親和力

將實(shí)施例2中獲得的克隆進(jìn)行單克隆噬菌體的展示和純化，進(jìn)行噬菌體梯度稀釋ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定親和力。

用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液包被VEGFR-2胞外區(qū)，20ng/孔/100ul，4℃包被過夜。PBST洗滌三次，4％milk-PBST 37℃封閉1小時h。將純化后的噬菌體用4％milk-PBST五倍梯度稀釋，每孔加入100ul稀釋后的樣品，室溫靜置1小時。用PBST洗滌ELISA板，將4％milk-PBST稀釋后的HRP-anti-M13單克隆抗體加入ELISA板中，室溫放置1h。TMB顯色試劑盒顯色，室溫顯色10分鐘。用2M H₂SO₄終止后，450nm/630nm讀數(shù)。結(jié)果如圖2所示，篩選出的3株不同的單鏈抗體均能與VEGFR-2進(jìn)行特異性結(jié)合，且結(jié)合能力均高于的O-1。

實(shí)施例4、抗KDR全抗體的制備

將上述3個抗體N-1、N-2和N-3的重鏈VH和輕鏈k基因分別克隆至裝有重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因的載體pTSE(見圖3)，編碼人IgG1的恒定區(qū)(見SEQ.5)和k鏈的恒定區(qū)(見SEQ.6)的pTSE載體中(pTSE載體如圖3所示，制備過程參見CN103525868A說明書第3頁第[0019]段)。

SEQNO.5(人IgG1的恒定區(qū)序列)：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；

SEQ NO.6(k鏈的恒定區(qū)序列)：RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；

瞬時轉(zhuǎn)染HEK293E細(xì)胞，進(jìn)行全抗體表達(dá)。使用AKTA儀器protein A親和柱純化獲得全抗體蛋白。使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。

實(shí)施例5、全抗體與VEGFR2胞外區(qū)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)

用pH9.6的碳酸鹽緩沖液包被VEGFR胞外區(qū)，20ng/孔/100ul，4℃過夜包被。用300ul/孔PBST洗三次，再加入4％milk-PBST在37℃封閉1h。加入不同稀釋度的生物素標(biāo)記的全抗體。用人的IgG(hIgG)作為同型對照，各種全抗體最高濃度是100ng/ml，5倍稀釋做8個梯度，37℃孵育2-3h。用300ul/孔PBST洗五次，再加入用4％milk-PBST 1:10000稀釋的鏈霉親和素37℃孵育1h。用300ul/孔PBST洗八次，TMB顯色試劑盒顯色，100ul/孔，室溫顯色10min，然后用2M H₂SO₄終止。450nm/630nm讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，所有抗體均能很好的與細(xì)胞表面的KDR分子結(jié)合，其中N3的親和力相對較高，且N-1、N-2、N-3均高于原有的O-1。

實(shí)施例6、全抗體與細(xì)胞表面VEGFR-2的結(jié)合特異性分析

本發(fā)明采用過表達(dá)VEGFR-2的CHO細(xì)胞來檢測不同的雙特異抗體與細(xì)胞表面EGFR的結(jié)合情況，用人的IgG(hIgG)作為同型對照。用0.25％胰酶消化、離心收集細(xì)胞。同時稀釋各種抗體，最高濃度為100nM，4倍梯度稀釋。將收集的細(xì)胞用PBS+1％BSA洗三遍，再加PBS+1％BSA重懸細(xì)胞,然后鋪細(xì)胞于96孔板中，每孔1×10⁵個細(xì)胞，加入100ul稀釋好的雙特異性抗體，室溫孵育1小時；離心去上清，用PBS洗細(xì)胞三遍，再用稀釋好的Alexa488標(biāo)記的抗人IgG FC抗體重懸細(xì)胞，室溫避光孵育1小時，PBS洗三遍，再用100ul PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。結(jié)果用Graphpad Prism分析。結(jié)果顯示，N3能夠更好的結(jié)合細(xì)胞表達(dá)的VEGFR-2，N1、N2、N3的結(jié)合能力均強(qiáng)于O-1(見圖5)。

實(shí)施例7、全抗體抑制HUVEC細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，已被廣泛用于血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號途徑和多種腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究，本發(fā)明研究了不同抗VEGFR-2抗體對HUVEC細(xì)胞增殖抑制作用。等HUVEC細(xì)胞長到80％豐度，換新鮮含5％FBS的EGM培養(yǎng)基，6小時后用胰酶消化，再用無血清培養(yǎng)基洗消化下來的細(xì)胞4-5遍，每次離心后盡量倒凈培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞計數(shù)，5000個細(xì)胞每孔接入96孔板，放棄96孔板邊緣孔，100ul無血清培養(yǎng)基每孔，饑餓過夜。14-16小時后吸去上清，加入50ul VEGF/ECM(200ng/ml),至終濃度為100ng/ml，和不同濃度的不同抗體混勻后培養(yǎng)24小時。然后加入CCK-8，檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，N1、N2和N3的IC₅₀(ng/L)分別為12.76、17.32、和10.53，O-1的IC₅₀(ng/L)為18.59；N1、N2、N3抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力均強(qiáng)于O-1，其中N3最好(見圖6)。綜合實(shí)施例5-7，可以看出N1、N2、N3均無論在分子還是在細(xì)胞學(xué)水平的結(jié)果均優(yōu)于原專利CN103525868A的最佳抗體O-1，這也意味著本專利中的候選分子更具有開發(fā)和應(yīng)用前景。

本發(fā)明上述抗體可用于治療新生血管引起的疾病，包括但不限于非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌、HER2陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性胃腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌等癌癥以及黃斑變性等疾病。

對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，具體實(shí)施例只是對本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>北京東方百泰生物科技有限公司.

<120>一種改進(jìn)的抗VEGFR-2單克隆抗體.

<210>

1：VEGFR-2輕鏈可變區(qū)序列L1

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQAIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK

2：VEGFR-2輕鏈可變區(qū)序列L2

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASDAIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEASNLDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK

3：VEGFR-2輕鏈可變區(qū)序列L3

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK

4：VEGFR-2重鏈可變區(qū)序列H1

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASAFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDLWGQGTMVTVSS

5：人IgG1的恒定區(qū)序列

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

6：Kappa鏈的恒定區(qū)序列

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC