本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結合物及其制備方法和應用。

背景技術：

透明質(zhì)酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的雙糖單位玻尿酸，又稱糖醛酸，基本結構是由兩個雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的大型多糖類。與其它粘多糖不同，它不含硫，是一種酸性粘多糖。透明質(zhì)酸以其獨特的分子結構和理化性質(zhì)在機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴散及運轉，促進創(chuàng)傷愈合等。

透明質(zhì)酸鈉，即玻璃酸鈉，是由N-乙酰葡萄糖醛酸反復交替而形成的一種高分子多糖體生物材料。玻璃酸鈉為關節(jié)滑液的主要成分，是軟骨基質(zhì)的成分之一。在關節(jié)腔內(nèi)起潤滑作用，可覆蓋和保護關節(jié)軟骨，改善關節(jié)攣縮，抑制軟骨變性變化表面，改善病理性關節(jié)液，增加潤滑功能。

骨性關節(jié)炎是骨科臨床上的常見病，膝關節(jié)是最常累及的部位之一。由于膝關節(jié)是身體主要的負重關節(jié)，故膝關節(jié)骨性關節(jié)炎可導致患者較嚴重的功能障礙。以往的治療方法大多只能短期緩解癥狀，不能阻止疾病的進展，還會加重關節(jié)軟骨的退變。在各種致病因素作用下，關節(jié)腔滑液成分改變，玻璃酸鈉含量減少或關節(jié)功能減退，造成關節(jié)軟骨皸裂、剝脫，炎性壞死等，產(chǎn)生疼痛、活動障礙。通過實驗及臨床應用均證明玻璃酸鈉是治療骨性關節(jié)炎的一種安全、理想、有效的藥物，其具有參與細胞外液中電解質(zhì)及水分調(diào)節(jié)、潤滑關節(jié)、抗御感染、參與創(chuàng)傷愈合等多種生理功能，對關節(jié)的保護、營養(yǎng)及功能的發(fā)揮均起重要的作用，補充外源性的玻璃酸鈉可以提高滑液中玻璃酸鈉的含量，重新形成自然屏障，防止軟骨基質(zhì)進一步破壞消失；改善病理狀態(tài)下滑液的生物學功能，減輕或消除關節(jié)磨擦及疼痛；并通過其抑制白細胞移動及趨化作用，減少滑膜通透性、增加高分子玻璃酸鈉生成，減少關節(jié)內(nèi)滲液；覆蓋和保護痛覺感覺器，與疼痛介質(zhì)結合，緩解疼痛；與糖蛋白結合，阻止該物質(zhì)參與炎癥過程，同時玻璃酸鈉進入軟骨基質(zhì)，與糖蛋白形成聚合體，修復損傷的軟骨。

淫羊藿苷為箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鮮淫羊藿等干燥莖葉提取物，呈淡黃色針狀結晶粉末，能增加心腦血管血流量、促進造血功能、免疫功能及骨代謝，還具有補腎壯陽、抗衰老等功效。

在臨床實踐及科研中，申請人發(fā)現(xiàn)，淫羊藿還具有與骨科關系密切的“補骨、補軟骨”作用，其對骨質(zhì)疏松及軟骨退變有良好的防治作用。淫羊藿的提取物以及含有淫羊藿組成的復方制劑，對長期應用腎上腺皮質(zhì)激素所引起的骨質(zhì)疏松有拮抗作用。為觀察淫羊藿對兔膝關節(jié)軟骨細胞增殖及分泌等活性功能的促進作用，申請人進行了大量科學實驗：申請人通過不同濃度的含有淫羊藿組成的復方制劑及不同濃度淫羊藿的提取物對兔軟骨細胞的增殖及功能活性表達，確定了淫羊藿組成的復方制劑及淫羊藿的提取物對兔軟骨細胞作用的有效濃度范圍及最優(yōu)濃度比。

可以說，透明質(zhì)酸和淫羊藿苷在骨科治療中均有一定療效，作用機理有所差別，若是能夠?qū)烧呓Y合在一起，是否可以相得益彰，發(fā)揮更好地功效，這正是本專利所要研究的內(nèi)容。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種中西醫(yī)結合的淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結合物，及其制備方法和應用，其用于制備骨軟骨疾病治療的藥品，具有顯著的效果。

本發(fā)明的技術方案如下：

淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結合物，其分子式為：

通過下述反應式獲得：

透明質(zhì)酸分子式

淫羊藿苷分子式

淫羊藿苷與透明質(zhì)酸結合分子式

步驟1：甘氨酸的氨基保護：

把2mmol甘氨酸(Gly)溶解在20mL NaHCO3溶液(質(zhì)量分數(shù)為1.68％)中，室溫下攪拌1-2h，同時，將0.45g二碳酸二叔丁基酯溶解在2mL二氧六環(huán)中，而后，在冰浴中不斷攪拌的條件下，把二碳酸二叔丁基酯溶液緩慢滴加至Gly的溶液中，控制滴速在10分鐘內(nèi)滴加完畢后，室溫反應20h；

用0.01M HCl調(diào)節(jié)上述反應后的溶液的pH至中性，用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑，而后將余下固體用二氯甲烷(DCM)溶解，并除去不溶物(NaCl)；將DCM中溶解的反應產(chǎn)物滴加至10倍體積的冷乙醚中沉淀，通過抽濾收集固體產(chǎn)物，并用冷乙醚多次洗滌此固體產(chǎn)物，最后放置于真空干燥箱中干燥，即可得到叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯。

步驟2淫羊藿苷與叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯的脫水縮合反應

將淫羊藿苷加入到四氫呋喃(THF)和吡啶(pyridine)的混合溶液中，不斷攪拌至完全溶解，加入一定量的叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯，劇烈攪拌1h，而后緩慢加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)的四氫呋喃溶液，室溫下攪拌反應24h，而后，加入20mL去離子水，抽濾，洗滌，盡量除盡不溶物，通過旋蒸使溶液濃縮，再將濃縮后溶液沉淀在水中，然后將沉淀溶解于THF和吡啶的混合溶液中，加水，冷凍過夜，將不溶物除去，濃縮，加水析出沉淀,如此反復三次，得產(chǎn)物。

步驟3脫除叔丁氧羰基的保護

取第二步產(chǎn)物5g，加入至9mL三氟乙酸(TFA)和10mL二氯甲烷(DCM)的混合溶液中，室溫下攪拌1-2h，產(chǎn)物旋蒸除去DCM，所得固體用乙酸乙酯溶解，用5％碳酸鈉(NaCO3)洗滌至pH＝8-9，而后除去溶劑可以得到第三步反應產(chǎn)物氨基淫羊藿苷。

步驟4氨基淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的偶聯(lián)

透明質(zhì)酸加入至蒸餾水中，而后向其中緩慢滴加氨基淫羊藿苷(淫羊藿苷的氨基與透明質(zhì)酸的羧基摩爾比為1：1—1：n)，其中n為正整數(shù)，并向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,濃度約為10mg/mL)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，10mg/mL)，并將溶液pH調(diào)節(jié)至4.5，而后室溫下攪拌反應20min，再將pH調(diào)節(jié)至5.5，室溫下攪拌24h，而后利用柱層析分離即可得到最終產(chǎn)物，即淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結合物。

其反應式具體如下：

本發(fā)明還提供該結合物的應用，尤其是用于制備藥品的應用，進一步地，本發(fā)明提供該結合物用于制備骨軟骨疾病藥品中的應用，所述藥品為但不限于注射劑、口服劑、外用劑等。

本發(fā)明的結合物主要用于制備中藥注射劑，尤其是中藥關節(jié)腔注射劑，也就是常說的“關節(jié)營養(yǎng)劑”，中藥注射劑是傳統(tǒng)醫(yī)藥理論與現(xiàn)代生產(chǎn)工藝相結合的產(chǎn)物，突破了中藥傳統(tǒng)的給藥方式，是中藥現(xiàn)代化的重要產(chǎn)物。與其他中藥劑型相比，注射劑具有生物利用度高、療效確切、作用迅速的特點。但臨床上使用甚少，常見的比如：柴胡注射液、脈絡寧注射液，且不良反應屢有發(fā)生，而且目前關節(jié)用含中藥成分的注射劑在臨床上未有報道。

關節(jié)/滑囊注射是將藥物直接注射入機體組織關節(jié)腔/滑囊組織內(nèi)，使藥物直達病灶，迅速起作用，減少全身用藥的副作用，結合了局部用藥和體內(nèi)用藥的優(yōu)點。

上述反應過程中的試劑和藥品均為市售。

本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：

1、通過化學手段，獲得淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結合物，以關節(jié)腔注射的方式，注入到膝關節(jié)腔內(nèi)，克服了單一透明質(zhì)酸治療的局限性，降低其不良反應；借助淫羊藿苷對軟骨細胞的藥理作用，覆蓋和保護軟骨表面，作用于滑膜細胞，促進高分子透明質(zhì)酸的合成，從而達到潤滑關節(jié)腔、緩解疼痛、改善患者日?；顒蛹瓣P節(jié)活動范圍的目的，真正做到中西醫(yī)結合治療疾病。

2、本發(fā)明擴大了透明質(zhì)酸的使用范圍，突破了傳統(tǒng)中藥的給藥方式，使中藥和西藥真正結合在一起。

3、扭轉對中藥注射劑的認識，可大大減小其不良反應，擴大了中藥注射劑的應用范圍。

附圖說明

圖1是不同干預措施下家兔的Pineda組織學半定量評分

圖2是不同干預措施下對家兔軟骨Ⅱ型膠原表達陽性率的影響

其中HA代表透明質(zhì)酸，ICA代表淫羊藿苷

具體實施方式

通過下述步驟制備淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結合物：

步驟1：甘氨酸的氨基保護：

把2mmol甘氨酸(Gly)溶解在20mL NaHCO3溶液(質(zhì)量分數(shù)為1.68％)中，室溫下攪拌1-2h，同時，將0.45g二碳酸二叔丁基酯溶解在2mL二氧六環(huán)中，而后，在冰浴中不斷攪拌的條件下，把二碳酸二叔丁基酯溶液緩慢滴加至Gly的溶液中，控制滴速在10分鐘內(nèi)滴加完畢后，室溫反應20h；

用0.01M HCl調(diào)節(jié)上述反應后的溶液的pH至中性，用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑，而后將余下固體用二氯甲烷(DCM)溶解，并除去不溶物(NaCl)；將DCM中溶解的反應產(chǎn)物滴加至10倍體積的冷乙醚中沉淀，通過抽濾收集固體產(chǎn)物，并用冷乙醚多次洗滌此固體產(chǎn)物，最后放置于真空干燥箱中干燥，即可得到叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯。

步驟2淫羊藿苷與叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯的脫水縮合反應

將淫羊藿苷加入到四氫呋喃(THF)和吡啶(pyridine)的混合溶液中，不斷攪拌至完全溶解，加入一定量的叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯，劇烈攪拌1h，而后緩慢加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)的四氫呋喃溶液，室溫下攪拌反應24h，而后，加入20mL去離子水，抽濾，洗滌，盡量除盡不溶物，通過旋蒸使溶液濃縮，再將濃縮后溶液沉淀在水中，然后將沉淀溶解于THF和吡啶的混合溶液中，加水，冷凍過夜，將不溶物除去，濃縮，加水析出沉淀,如此反復三次，得產(chǎn)物。

步驟3脫除叔丁氧羰基的保護

取第二步產(chǎn)物5g，加入至9mL三氟乙酸(TFA)和10mL二氯甲烷(DCM)的混合溶液中，室溫下攪拌1-2h，產(chǎn)物旋蒸除去DCM，所得固體用乙酸乙酯溶解，用5％碳酸鈉(NaCO3)洗滌至pH＝8-9，而后除去溶劑可以得到第三步反應產(chǎn)物氨基淫羊藿苷。

步驟4氨基淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的偶聯(lián)

透明質(zhì)酸加入至蒸餾水中，而后向其中緩慢滴加氨基淫羊藿苷(淫羊藿苷的氨基與透明質(zhì)酸的摩爾比為1:10)，并向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,濃度約為10mg/mL)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，10mg/mL)，并將溶液pH調(diào)節(jié)至4.5，而后室溫下攪拌反應20min，再將pH調(diào)節(jié)至5.5，室溫下攪拌24h，而后利用柱層析分離即可得到最終產(chǎn)物，即淫羊藿苷與透明質(zhì)酸的結合物。

效果驗證：

為了驗證該結合物對軟骨細胞增殖的作用，申請人分別使用淫羊藿苷、透明質(zhì)酸、兩者結合物，觀察了兔軟骨細胞Pineda組織學及Ⅱ型膠原表達的情況。

實驗數(shù)據(jù)如下表：

表1不同干預措施下家兔的Pineda組織學半定量評分(Mean±SD)

*P<0.05,**P<0.01vs空白組；#P<0.05vs ICA組；&P<0.05vs HA組。

結果：12周后，與空白組比較，三組均有非常顯著性差異；ICA+HA組與ICA組及HA組比較有顯著性差異。

表2不同干預措施下對家兔軟骨Ⅱ型膠原表達陽性率的影響(Mean±SD)

**P<0.01vs空白組；#P<0.05,##P<0.01vs ICA組；&P<0.05vs HA組。

結果：與空白組比較，三組均有非常顯著性差異；ICA+HA組與ICA組比較有非常顯著性差異，與HA組比較有顯著性差異，HA組與ICA組比較有顯著性差異。

結果說明該結合物比單純淫羊藿苷及透明質(zhì)酸均有效。本品可以通過影響軟骨細胞增殖、分化和功能活化促進軟骨形成，延緩軟骨退化達到軟骨修復和再生的目的。同時也證明本品安全有效。

臨床使用方法：

將該結合物通過常見公知的表面修飾、改性及加一些輔料以增加使用方便性，減少機體刺激。

以透明質(zhì)酸與淫羊藿苷的結合物制作的關節(jié)腔/滑囊注射劑為例：

適應癥：膝骨關節(jié)炎、肩周炎、滑膜炎、滑囊炎等癥。

本品為膝骨關節(jié)炎、肩周炎、滑膜炎、滑囊炎等癥的改善藥物。用于膝骨關節(jié)炎時，膝關節(jié)腔內(nèi)注射；用于肩周炎時，肩關節(jié)腔或肩峰下滑囊內(nèi)注射，用于滑膜炎、滑囊炎時，滑囊直接注射。一次2.5ml，一周1次，5周為一療程。

注意事項：

1.使用時，要嚴格按照無菌操作。

2.本品勿與含潔爾滅的藥物接觸以免產(chǎn)生混濁。

3.有關節(jié)積液時，應先將積液抽出，再注入藥物。

體內(nèi)代謝途徑：本品注入關節(jié)腔內(nèi)24小時，即進入滑膜、軟骨表面和相鄰的部分肌肉組織以及肌間空隙，且在滑液、半月板及軟骨表面的濃度達到峰值。給藥72小時，在關節(jié)腔內(nèi)的殘留量約為投藥量的10％，此時在血漿的濃度達到峰值，并且在肝、脾以及腎臟中均有分布，在以上臟器中的濃度可高于血漿濃度的2-6倍。理論上無論是單次給藥還是多次給藥，本品在體內(nèi)的清除速率是相同的。給藥9天后，可發(fā)現(xiàn)極少量的代謝產(chǎn)物從尿中及腸道排出。

以上對本發(fā)明的一個實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。