本發(fā)明涉及功能高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種胍基化殼聚糖的制備方法及采用胍基化殼聚糖制備抗菌性納米微球的方法。

背景技術(shù)：

殼聚糖是自然界中廣泛存在的甲殼素脫乙酰產(chǎn)物，分子表面的伯胺基(-NH₂)質(zhì)子化后帶正電，賦予了其抑菌特性，故殼聚糖也是普遍用于食品、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的天然抑菌劑。研究表明，高分子量的殼聚糖吸附在細菌細胞表面，可形成一層高分子膜，阻止了營養(yǎng)物質(zhì)向細胞內(nèi)的運輸，因此對表層細胞壁結(jié)構(gòu)的革蘭氏陽性菌(G+)的抑菌效果顯著；而低分子量的殼聚糖則可透過細胞膜進入細菌細胞內(nèi)，與細胞內(nèi)帶負電的物質(zhì)結(jié)合，使細胞的正常生理功能受到影響，導(dǎo)致細菌死亡，該方式對革蘭氏陰性菌(G-)的抑制效果更佳。但是，由于殼聚糖僅可在酸性環(huán)境下溶解，故其在中性及堿性環(huán)境下的抑菌性能受到了限制。

胍基是目前被發(fā)現(xiàn)的自然界中堿性最強(堿性與NaOH相當(dāng))的有機堿，其與殼聚糖pKa10.8的伯胺基相比，pKa 12.5的胍基質(zhì)子化能力更強，同時通過共振互變，形成的亞胺陽離子更加穩(wěn)定。胍基在生理pH(7.35)環(huán)境中能夠完全質(zhì)子化，而且在酸性到堿性很大跨度條件下都能夠保持較好的抑菌性能?，F(xiàn)有技術(shù)中，胍基化殼聚糖的合成主要采用精氨酸在水溶液中以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)活化，然后與殼聚糖連接的路線，胍基與殼聚糖上伯胺基的接枝效率較低，同時還會與殼聚糖側(cè)鏈羥基發(fā)生副反應(yīng)。

目前國內(nèi)外研制的抗菌性藥物以抗生素、抗菌肽為主導(dǎo)，抗菌性材料則大多負載了抗菌性藥物或復(fù)合了金、銀、碘等抗菌性粒子。其中，抗生素的抗菌效果顯著，但由于長期不合理使用，細菌已對抗生素產(chǎn)生了嚴重的耐藥性，抗生素的應(yīng)用成為了影響人類及動物長期健康發(fā)展的雙刃劍；抗菌肽提取于天然生物體中，由10～50個氨基酸組成，富含疏水和堿性氨基酸殘基，被認為是最有前途的抗生素替代產(chǎn)品，但作為生物體來源的藥物仍不可避免的存在安全性、穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本過高等問題；金、銀、碘等抗菌粒子雖具備一定的抗菌特性，但其不可吸收亦不可降解，可用于皮膚表層的抗菌消炎，卻不能在體內(nèi)應(yīng)用。

溶菌酶是專一作用于細菌細胞壁的天然抗菌蛋白，可通過切斷細胞壁的肽聚糖網(wǎng)絡(luò)從而分解細菌，對表層細胞壁結(jié)構(gòu)的革蘭氏陽性菌(G+)的抑菌效果較好。但是，革蘭氏陰性菌(G-)的細胞壁表層覆蓋了一層脂質(zhì)外膜難以穿透，其影響了溶菌酶對G-的抑制作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種胍基化殼聚糖的制備方法，通過對殼聚糖進行胍基化改性，以提高其生物堿性及水溶性，并增強其對電負性細胞膜的作用能力，通過提供的胍基化殼聚糖制備方法，在無水甲醇中以N,N'-羰基二咪唑活化精氨酸，再對殼聚糖進行接枝，以期提高殼聚糖胍基化的接枝率。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種采用胍基化殼聚糖制備抗菌性納米微球的方法，該方法以硫酸葡聚糖為交聯(lián)劑，制得包裹有溶菌酶的胍基化殼聚糖納米微球，其利用中低分子量胍基化殼聚糖對細胞膜的穿透作用破壞G-外膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使內(nèi)壁層的肽聚糖暴露出來，進而被溶菌酶水解，通過二者協(xié)同作用，增強對G-的抑制效果。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種胍基化殼聚糖的制備方法，其包括以下步驟：

步驟一、羧基活化精氨酸的制備：取精氨酸與N,N'-羰基二咪唑的摩爾比為1：0.2～5，溶于無水甲醇中反應(yīng)1～5h，反應(yīng)溫度為-20～25℃，備用；

所述步驟一的合成路線為：

步驟二、胍基化殼聚糖的制備：取一定量殼聚糖溶于2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)水溶液中，將步驟一制得的羧基活化精氨酸溶液直接滴加至殼聚糖溶液中，其中殼聚糖與步驟一中羧基活化精氨酸的摩爾比為1：30～300，室溫下攪拌2～20h，真空狀態(tài)下除去溶劑，產(chǎn)物溶解在超純水中，透析，凍干，得到胍基化殼聚糖；

所述步驟二的合成路線為：

優(yōu)選的是，所述的胍基化殼聚糖的制備方法，其中，所述殼聚糖的分子量為5～60kDa，脫乙酰度>85％。

一種采用上述制得的胍基化殼聚糖制備抗菌性納米微球的方法，其中，以硫酸葡聚糖的水溶液為底液，將含有溶菌酶的胍基化殼聚糖水溶液以一定速率滴加到所述底液中，室溫下高速攪拌，自然沉降過夜，4℃離心(速率5000xg)，取下層沉淀，凍干，得到抗菌性納米微球；其中，所述胍基化殼聚糖、所述硫酸葡聚糖及所述溶菌酶的質(zhì)量比為：0.1～1:1:0.2～1。

優(yōu)選的是，所述的制備抗菌性納米微球的方法，其中，所述抗菌性納米微球的粒徑為40～100nm。

優(yōu)選的是，所述的制備抗菌性納米微球的方法，其中，所述溶菌酶的濃度為0.5～5mg/mL，所述胍基化殼聚糖的濃度為1～5mg/mL，所述硫酸葡聚糖的濃度為1～5mg/mL。

優(yōu)選的是，所述的制備抗菌性納米微球的方法，其中，以2mL硫酸葡聚糖的水溶液為底液，將含有溶菌酶的胍基化殼聚糖水溶液以1～30mL/h速率滴加到所述底液中，滴加量為0.2～2mL，室溫下高速攪拌，攪拌速率為100～1000rpm，攪拌時間為10～30min，自然沉降過夜，4℃離心(速率5000xg)20min，取下層沉淀，凍干，得到抗菌性納米微球。

應(yīng)用上述抗菌性納米微球制備抗菌性生物制劑或抗菌材料。

如上所述，本發(fā)明公開的胍基化殼聚糖的制備方法及采用胍基化殼聚糖制備的抗菌性納米微球具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明采用在非水溶劑中先將精氨酸的羧基活化為環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，再進一步與殼聚糖反應(yīng)的工藝路線，提高了殼聚糖上伯胺基的胍基化接枝率，避免了副反應(yīng)的發(fā)生。與殼聚糖原有的伯氨基相比，胍基結(jié)構(gòu)的共軛效應(yīng)分散了精氨酸化殼聚糖表面的正電荷密度，使得細胞毒性更低；

(2)本發(fā)明的抗菌性納米微球采用了胍基化殼聚糖包裹溶菌酶的協(xié)同抑菌思路；利用中低分子量胍基化殼聚糖的細胞膜穿透性質(zhì)，以及溶菌酶的細胞壁專一分解能力，共同增強微球?qū)-的抗菌效果，實現(xiàn)了該抗菌性微球的廣譜抑菌作用；

(3)本發(fā)明的抗菌性微球原料安全，制備工藝簡單，微球可生物降解，生物相容性好，可以作為抗菌性生物制劑應(yīng)用，或負載在其他材料表面作為抗菌性組分應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的胍基化殼聚糖的紅外光譜圖(a：殼聚糖；b：胍基化殼聚糖GCS1；c：胍基化殼聚糖GCS2)；

圖2為本發(fā)明制備的抗菌性納米微球的SEM圖。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點及功效。

實施例1

稱取精氨酸2.0g，N,N'-羰基二咪唑4.84g，溶于50mL無水甲醇，在0～5℃下攪拌3小時，得到羧基活化的精氨酸，備用。稱取殼聚糖(粘均分子量15kDa，脫乙酰度90％)2.7g溶于100mL MES水溶液，然后將上一步制得的羧基活化精氨酸直接滴加至殼聚糖溶液中，滴加完畢后，室溫下攪拌6h。真空狀態(tài)下除去溶劑，產(chǎn)物溶解在超純水中，透析(MWCO 6000)3～4天，冷凍干燥。制得的胍基化殼聚糖GCS1紅外光譜如圖1中(b)所示，元素分析得胍基接枝率為34.8％。

實施例2

稱取精氨酸1.9g，N,N'-羰基二咪唑3.72g，溶于100mL無水甲醇，在25℃下攪拌6小時，得到羧基活化的精氨酸，備用。稱取殼聚糖(粘均分子量8kDa，脫乙酰度88％)1.6g溶于100mLMES水溶液，然后將上一步制得的羧基活化精氨酸直接滴加至殼聚糖溶液中，滴加完畢后，室溫下攪拌20h。真空狀態(tài)下除去溶劑，產(chǎn)物溶解在超純水中，透析(MWCO 3400)3～4天，冷凍干燥。制得的胍基化殼聚糖GCS2紅外光譜如圖1中(c)所示，元素分析得胍基接枝率為45.2％。

實施例3

配置含溶菌酶的胍基化殼聚糖(粘均分子量15kDa，胍基接枝率34.8％)水溶液，其中溶菌酶的濃度為1mg/mL，胍基化殼聚糖的濃度為1mg/mL。配置2mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液。以2mL硫酸葡聚糖為底液，采用注射泵以10mL/h的速度向其中加入0.8mL含溶菌酶的胍基化殼聚糖溶液，底液的攪拌速度為500rpm，滴加完畢后繼續(xù)攪拌10min。自然沉降過夜，4℃離心(速率5000xg)20min，取下層沉淀，凍干，得到抗菌性納米微球。該納米微球的溶菌酶包封率為45.78％，載藥率為27.62％。

實施例4

配置含溶菌酶的胍基化殼聚糖(粘均分子量8kDa，胍基接枝率45.2％)水溶液，其中溶菌酶的濃度為1.5mg/mL，胍基化殼聚糖的濃度為4mg/mL。配置3mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液。以2mL硫酸葡聚糖為底液，采用注射泵以2mL/h的速度向其中加入1.5mL含溶菌酶的胍基化殼聚糖溶液，底液的攪拌速度為700rpm，滴加完畢后繼續(xù)攪拌20min。自然沉降過夜，4℃離心(速率5000xg)20min，取下層沉淀，凍干，得到抗菌性納米微球，如圖2所示。該納米微球的溶菌酶包封率為50.37％，載藥率為31.22％

實施例5

以革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)為細菌模型，選取對數(shù)生長期的細菌進行納米微球抑菌活性研究。具體方法為：從37℃培養(yǎng)16～20h的平板中挑取一個單菌落(直徑2～3mm)，轉(zhuǎn)到一個含有100mL SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中，于37℃劇烈振培6～7h，每隔15～20min測定OD600值來檢測。當(dāng)OD值達到0.35時，收獲細菌。

取胍基化殼聚糖(粘均分子量8kDa，胍基接枝率45.2％)包裹溶菌酶制備的系列納米微球，以20g/L的濃度加入到細菌培養(yǎng)液中，生化培養(yǎng)箱(或搖床)中37℃培養(yǎng)，24h后取出細菌樣品，測定OD600nm值，評價抗菌微球制備過程中胍基化殼聚糖和溶菌酶的濃度對大腸桿菌(E.coli)抑制率的影響。

表1胍基化殼聚糖/溶菌酶納米微球的E.coli抑制率

比較例1

以殼聚糖(粘均分子量8kDa，脫乙酰度88％)包裹溶菌酶制備系列納米微球，然后以20g/L的濃度加入到E.coli細菌培養(yǎng)液中，生化培養(yǎng)箱(或搖床)中37℃培養(yǎng)，24h后取出細菌樣品，測定OD600nm值，評價未進行胍基化的殼聚糖包裹溶菌酶制備的納米微球?qū)Υ竽c桿菌(E.coli)抑制率的影響。

表2殼聚糖/溶菌酶納米微球的E.coli抑制率

比較例2

稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)0.6g，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0.14g,溶于100mL MES水溶液中，然后加入精氨酸1.11g，攪拌2h使之活化。加入殼聚糖(粘均分子量8kDa，脫乙酰度88％)2.7g，室溫攪拌24h后加入0.25g鹽酸羥胺終止反應(yīng)，用NaOH調(diào)節(jié)溶液PH至9左右，透析(MWCO 3400)3～4天，冷凍干燥。元素分析得胍基接枝率為10.5％。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。