本發(fā)明涉及一種食用菌多糖的提取方法，尤其是一種銀耳多糖提取的新方法，屬于食用菌深加工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

銀耳又名白木耳、雪耳等，是一種營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價值高的藥食兩用菌，具有滋陰、潤肺、養(yǎng)胃、生津等功效，在古代屬于名貴補(bǔ)品。銀耳多糖是銀耳的主要活性成分，不但具有優(yōu)異的提高人體免疫機(jī)能、抗病毒、抗腫瘤、抗?jié)?、降血脂、降血糖、降膽固醇等生理作用，而且具有超?qiáng)的保水性和很好的成膜性，作為天然保濕劑應(yīng)用在化妝品領(lǐng)域受到廣泛的重視。目前，市場上銷售的銀耳大多數(shù)是未經(jīng)加工的銀耳干品，其營養(yǎng)成分利用率低，產(chǎn)品附加值小，銀耳的經(jīng)濟(jì)價值和市場潛力無法體現(xiàn)。因此，如何合理利用銀耳資源，研究銀耳多糖的高效提取方法，采用更加經(jīng)濟(jì)實惠的技術(shù)手段，為保健食品、功能食品、化妝品、生物醫(yī)藥等行業(yè)提供高品質(zhì)的銀耳多糖，是銀耳精深加工的發(fā)展方向，具有廣闊的市場前景。

銀耳多糖作為一種高分子化合物，其主鏈由甘露糖以α-(1-3)糖苷鍵連接組成，主鏈的2，4，6位上連接有葡萄糖、木糖、巖藻糖及普通糖醛酸等殘基組成的側(cè)鏈，是一種分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。目前，食用菌多糖的研究和利用的報道不斷增多，多糖的生物活性和保濕效果與其分子量大小有很大的相關(guān)性，如：(1)分子量在3～5kDa左右多糖，具有降低血糖的作用；(2)分子量在10～100kDa之間多糖，具有消炎的作用；(3)分子量在30kDa以上多糖，具有抗腫瘤的作用；(4)分子量在1,000～5,000kDa之間多糖，具有超強(qiáng)保水性能，但其發(fā)揮作用的首要條件是溶于水。因此，選擇適宜分子量的銀耳多糖和提高銀耳多糖的水溶性能夠增加銀耳多糖的生物活性和保濕效果，尤其是用于美容化妝品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

銀耳多糖的制備一般采用提取和精制的方法，即先從銀耳子實體提取粗多糖，再對獲得的粗多糖進(jìn)行提純精制。傳統(tǒng)提取方法是熱水浸提法，主要是針對胞外多糖進(jìn)行提取，而胞壁多糖的提取量是非常有限的，存在著提取率低、耗時、造成了資源浪費等問題。近年來，研究人員采用酶解提取法、超聲波提取法、微波提取法、超微粉碎法和亞臨界水萃取法等新興技術(shù)，都在一定程度上提高了銀耳多糖的提取率。如：中國專利(申請?zhí)?01410546381.3)一種采用亞臨界水萃取-熱水浸提兩步法提取銀耳多糖的生產(chǎn)方法，該方法第一步采用較低固液比的亞臨界水萃取銀耳多糖，利用亞臨界水具有良好的滲透與溶解能力，使胞壁多糖與亞臨界水充分接觸和溶出，第二步采用較高固液比的去離子水充分溶解和浸出銀耳多糖，同時利用亞臨界水具有很高的熱能，加熱去離子水的浸提溫度，提高銀耳多糖的提取得率。中國專利(申請?zhí)?01410796766.5)一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，該方法采用酶解、超聲波提取、乙醇沉淀得到銀耳多糖粗提物，銀耳多糖粗提物再經(jīng)過超聲波溶解、D101樹脂柱層析、DEAE纖維素樹脂分離、得到純化的銀耳多糖；中國專利(申請?zhí)?01510336334.0)銀耳多糖的制備方法，該方法采用超微粉碎、超聲波輔助熱水提取、乙醇沉淀、Sevage試劑脫蛋白、雙氧水脫色、冷凍干燥，得到所需的銀耳多糖。然而，銀耳多糖的分子量大小及其水溶性與其理化性質(zhì)和生物活性有著較大的關(guān)系，在銀耳多糖的提取和精制過程中還沒有受到應(yīng)有的重視。由于銀耳多糖的分子量分布很廣，即使采用相同的銀耳原料，提取或精制方法的不同，其理化性質(zhì)和生物活性也會產(chǎn)生較大的差異，直接影響到銀耳多糖的產(chǎn)量、品質(zhì)和應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種銀耳多糖提取的新方法，即以超微粉碎的銀耳為原料，采用低溫水浸提技術(shù)，提取冷水可溶的銀耳多糖，進(jìn)一步分離純化，獲得水溶性高分子量銀耳多糖，用于美容化妝品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，超微粉碎和低溫水浸提后的銀耳殘渣，仍含有大量熱水可溶多糖和不溶性膠質(zhì)多糖，用作保健食品、功能食品或普通食品的添加劑，最大限度地發(fā)揮它們的使用功效，實現(xiàn)銀耳的高效提取和綜合利用，提高銀耳深加工的經(jīng)濟(jì)效益和利用價值。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種銀耳多糖提取的新方法，該方法包括步驟如下：

(1)超微粉碎：選用干凈無病害的銀耳干品，先制成粗粉后，再用超微粉碎機(jī)繼續(xù)粉碎，得到銀耳超微粉；

(2)脫色除雜：將步驟(1)所得銀耳超微粉，加入70％wt～100％wt乙醇進(jìn)行浸提，過濾，除去多酚、脂肪、色素小分子雜質(zhì)，得到脫色除雜的銀耳超微粉；

(3)低溫浸提：將步驟(2)所得銀耳超微粉，加入去離子水進(jìn)行低溫浸提，浸提溫度≤40℃，離心，得到冷水可溶的多糖浸提液和冷水不溶的銀耳殘渣；

(4)脫蛋白質(zhì)：將步驟(3)所得多糖浸提液進(jìn)行濃縮，濃縮液加入sevage試劑，充分?jǐn)嚢?，靜置分層，收集上層多糖溶液；

(5)提純精制：將步驟(4)所得多糖溶液加入季銨鹽溶液至絡(luò)合沉淀，沉淀物溶解于氯化鈉溶液中，除去不溶物，上清液濃縮至多糖接近飽和，經(jīng)醇沉、離心、洗滌、干燥后，得到水溶性高分子量銀耳多糖；

(6)殘渣利用：將步驟(3)所得銀耳殘渣，干燥和粉碎，得到粉末狀的銀耳殘渣。

步驟(1)中所述的銀耳超微粉的平均粒徑≥600目。

步驟(2)中所述的銀耳超微粉與乙醇的質(zhì)量體積比為1:3～10，浸提時間2～24h，浸提次數(shù)1～3次。

步驟(3)中所述的銀耳超微粉與去離子水的質(zhì)量體積比為1:40～100，浸提時間4～48h，浸提次數(shù)1～3次。

步驟(4)中所述的的sevage試劑為氯仿:正丁醇體積比為4～5:1混合液，加入量為多糖濃縮液體積的1/4～3/4倍，棄去中間蛋白層，回收下層sevage試劑，收集上層多糖溶液，重復(fù)操作2-4次。

步驟(5)中所述的季銨鹽為氯化十六烷基吡啶、溴化十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨中的一種。

所述的季銨鹽溶液的濃度為1％wt～10％wt。

步驟(5)中所述的氯化鈉溶液濃度為0.4～2mol/L，沉淀物溶解于≥40℃氯化鈉溶液中進(jìn)行解離。

步驟(5)中所述的醇沉、離心、洗滌、干燥為多糖溶液加入2～4倍體積的95％wt～100％wt乙醇，靜置分層，離心，沉淀物用乙醇洗滌1～2次后，真空干燥或冷凍干燥。

有益效果：

1、本發(fā)明采用超微粉碎與低溫水浸提相結(jié)合技術(shù)，優(yōu)化冷水可溶和冷水不溶多糖的應(yīng)用領(lǐng)域，冷水可溶多糖分子量主要分布在2,000～4,000kDa之間，作為天然保濕材料或替代透明質(zhì)酸，用于美容化妝品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，冷水不溶多糖分子量主要分布在200～500kDa之間，作為保健食品、功能食品或普通食品的添加劑，物盡其用，最大限度地發(fā)揮它們的使用功效。

2、本發(fā)明銀耳子實體經(jīng)過超微粉碎、乙醇脫色除雜、低溫水浸提、浸提液濃縮、Sevage試劑脫蛋白、季銨鹽沉淀提純、乙醇沉淀、溶劑洗滌和真空干燥后，得到的水溶性高分子量銀耳多糖，提取工藝條件溫和，不易破壞多糖的結(jié)構(gòu)，作為天然保濕材料或替代透明質(zhì)酸，滿足醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的質(zhì)量要求，是一種高附加值的銀耳精深加工產(chǎn)品。

3、本發(fā)明銀耳子實體經(jīng)過超微粉碎、乙醇脫色除雜、低溫水浸提后，得到的銀耳殘渣，仍含有大量熱水可溶多糖和不溶性膠質(zhì)多糖，而且經(jīng)過超微粉碎，細(xì)胞壁破碎，更容易被人體所消化、吸收和利用，具有一定的保健功效和營養(yǎng)價值，不使用有毒有害的化學(xué)溶劑，符合食品生產(chǎn)要求，用作保健食品、功能食品或普通食品的添加劑，實現(xiàn)銀耳的高效提取和綜合利用，提高銀耳深加工的經(jīng)濟(jì)效益和利用價值。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但它們并不是對本發(fā)明的限制。

本發(fā)明的多糖含量測定采用苯酚-硫酸比色法測定，多糖分子量測定采用凝膠滲透色譜法(GPC)測定。

實施例1

選用干凈無病害的銀耳干品，置于普通粉碎機(jī)中粉碎至40目，再用氣流超微粉碎機(jī)繼續(xù)粉碎至800目，得到銀耳超微粉。稱取銀耳超微粉20g，加入200mL90％乙醇溶液，常溫浸提12h，過濾，棄去含有多酚、脂肪、色素等雜質(zhì)的浸提液，銀耳殘渣再加入2000mL去離子水，常溫浸提24h，粗濾，10,000r/min離心10min，得到銀耳殘渣和浸提液。浸提液減壓濃縮至多糖濃度為5％的濃縮液，加入3/4體積sevage試劑(氯仿:正丁醇＝4:1)，充分?jǐn)嚢瑁o置分層，棄去中間蛋白層，回收下層sevage試劑，重復(fù)操作3次，收集上層多糖溶液。多糖溶液加入2％氯化十六烷基吡啶溶液至沉淀完全，靜置分層，10,000r/min離心10min，收集沉淀物，加入2mol/L氯化鈉溶液，在50℃條件下攪拌解離后，10,000r/min離心10min，除去不溶物，上清液減壓濃縮至多糖接近飽和，緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達(dá)到70％，靜置分層，10,000r/min離心10min，除去上清液，收集多糖沉淀物，用無水乙醇洗滌2次，真空冷凍干燥，研磨粉碎，制得1.96g白色粉末狀的高分子量銀耳多糖，多糖含量為92.2％，多糖得率為9.0％。銀耳殘渣瀝干，50℃真空干燥，粉碎機(jī)粉碎，即得13.8g粉末狀銀耳殘渣，多糖含量為24.2％，作為面制品的添加劑，可以提高面筋彈性、增強(qiáng)面筋持水能力。

實施例2

稱取實施例1銀耳超微粉100kg，加入400L 80％乙醇溶液，常溫攪拌浸提4h，過濾，殘渣重復(fù)浸提1次，棄去含有多酚、脂肪、色素等雜質(zhì)的浸提液，殘渣再加入5000L去離子水，常溫攪拌浸提12h，濾布過濾，置5000r/min離心機(jī)分離，殘渣重復(fù)浸提1次，得到銀耳殘渣和浸提液。浸提液納濾至多糖濃度為5％的濃縮液，加入1/4體積的sevage試劑(氯仿:正丁醇＝4:1)，充分?jǐn)嚢?，靜置分層，棄去中間蛋白層，回收下層sevage試劑，重復(fù)操作4次，收集上層多糖溶液。多糖溶液加入1％十六烷基三甲基溴化銨溶液至沉淀完全，靜置分層，置5000r/min離心機(jī)分離，收集沉淀物，加入1mol/L氯化鈉溶液，在40℃條件下攪拌溶解后，置5000r/min離心機(jī)分離，除去不溶物，上清液納濾濃縮至多糖接近飽和，緩慢加入95％乙醇，邊加邊攪拌，至沉淀完全為止，靜置分層，置5000r/min離心機(jī)分離，除去上清液，收集多糖沉淀物，分別用95％乙醇和無水乙醇洗滌1次，真空冷凍干燥，研磨粉碎，制得10.12kg白色粉末狀的高分子量銀耳多糖，多糖含量為92.8％，多糖得率為9.4％。銀耳殘渣瀝干、真空干燥、粉碎過篩，即得68.5kg粉末狀銀耳殘渣，多糖含量為25.2％，按照飲料生產(chǎn)配方與工藝要求，添加適量的輔料，如奶粉、白砂糖、酸味劑和穩(wěn)定劑等輔料，經(jīng)混合、均質(zhì)、灌裝、殺菌、冷卻后，可制成具有營養(yǎng)和保健作用的銀耳蛋白飲料。

比較例3

中國專利(申請?zhí)?01510336334.0)銀耳多糖的制備方法：選用實施例1干凈無病害的銀耳干品，置于普通粉碎機(jī)中粉碎至80目，再用超微粉碎機(jī)繼續(xù)粉碎至200目，得到銀耳超微粉。稱取銀耳超微粉50g，加入去離子水3000mL，攪拌均勻，在超聲工作頻率40KHz條件下間歇超聲2次(每隔0.5小時超聲0.5h)，再在100℃條件下連續(xù)振搖提取4h，置10,000r/min離心機(jī)分離，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮后，加入4倍體積的95％乙醇，用玻璃棒攪拌混勻，置4℃冰箱中沉淀過夜，10,000r/min離心機(jī)分離，棄上清液，用95％乙醇洗滌沉淀一次，加入去離子水溶解，再加入等體積Sevage試劑(氯仿:正丁醇＝4:1)，充分?jǐn)嚢?，靜置分層，棄去中間蛋白層，回收下層sevage試劑，重復(fù)操作4次，收集上層多糖溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮，濃縮液用雙氧水法脫色，流水透析12h，真空冷凍干燥，得到15.5g淡黃色粉末狀的銀耳多糖，多糖含量為78.4％，多糖得率為24.3％。

采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量和凝膠滲透色譜法(GPC)測定多糖分子量，實施例1和實施例2精制的水溶性高分子量銀耳多糖，多糖含量≥92％，其分子量主要分布在2,000～4,000kDa之間，而銀耳殘渣的多糖含量在25％左右，其分子量主要分布在200～500kDa之間。比較例3精制的銀耳多糖，多糖含量約為78％，其分子量主要由2,000～4,000kDa和200～500kDa兩個區(qū)段組成。