專利名稱：銀耳多糖，其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種銀耳多糖，同時提供了其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物，屬于中藥有效成分提取物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所稱的銀耳(Tremella fuciformis Berk)又稱白木耳(簡稱TF)，從古自今我國民間作為具滋補保健作用的藥食真菌佳品，銀耳孢子(簡稱TFS)為固體培養(yǎng)獲得。
在我國市場上已有銷售銀耳孢子制成的膠囊制劑，銀耳保健品更是種類繁多，但均存在著一些不足。1、工藝不合理銀耳孢子原料藥中含有大量的培養(yǎng)基和不溶物，原料藥直接裝入膠囊，未經(jīng)過提取、分離、純化，對多糖成分來說很難在胃腸道被吸收。銀耳子實體的保健品多為水提物，產(chǎn)品不利于長期保存和運輸。2、給藥途徑不合理，在胃腸道吸收速率極低。3、無規(guī)范化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由于原料藥未經(jīng)提取、分離，有效成分含量低，影響藥品質(zhì)量的控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種具有藥用價值的銀耳多糖。
本發(fā)明還提供了從銀耳、銀耳孢子中提取上述物質(zhì)的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了以活性銀耳多糖組分為主要藥物或與其它藥物組方用于增強免疫，抗腫瘤、抗放射、升高白細(xì)胞、降血糖、抗?jié)儭⒖寡椎乃幬铩?br> 銀耳多糖是通過以下兩種提取方法獲得的方法1將銀耳孢子加水?dāng)嚢杈鶆蛑瞥伤芤?，離心后取上清液經(jīng)活性炭過柱兩次，其中，顆粒活性炭經(jīng)40目篩再用沸水處理3次，濕法裝柱，用水洗至無色，過濾后水浴加熱，冷卻至室溫后冷藏24小時，將樹脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)除去；離心后取上清液，醇沉至濃度為60％，緩慢加入，充分?jǐn)嚢韬箅x心；取上清液醇沉至濃度為80％，充分?jǐn)嚢柙匐x心，收集沉淀物配液后G4漏斗過濾，分裝滅菌，凍干制成成品。
方法2取銀耳子實體去托盤洗凈加水煎煮，過濾取濾液，反復(fù)3次，合并濾液，濃縮加乙醇沉淀得銀耳多糖粗品，加水配制成水溶液，經(jīng)活性炭過柱兩次，其中，顆?；钚蕴拷?jīng)40目篩再用沸水處理3次，濕法裝柱，用水洗至無色，過濾后水浴加熱，冷卻至室溫后冷藏24小時，將樹脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)除去；離心后取上清液，醇沉至濃度為60％，緩慢加入，充分?jǐn)嚢韬箅x心；取上清液醇沉至濃度為80％，充分?jǐn)嚢柙匐x心，收集沉淀物配液后G4漏斗過濾，分裝滅菌，凍干制成成品。
經(jīng)過藥理學(xué)實驗篩選，上述化合物具有增強免疫，抗腫瘤、抗放射、升高白細(xì)胞、降血糖、抗?jié)?、抗炎的藥理活性?br> 按藥劑學(xué)方法，可以將本發(fā)明的銀耳多糖制備成多種臨床藥物劑型作為增強免疫，抗腫瘤、抗放射、升高白細(xì)胞、降血糖、抗?jié)?、抗炎的藥物，所說的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。特別是作為注射用制劑。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體。
上文的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括稀釋劑、賦形劑，填充劑，粘合劑，濕潤劑，崩解劑，吸收促進(jìn)劑，表面活性劑，吸附載體。
本發(fā)明可以組合物的形式通過口服、直腸、靜脈、肌肉注射或胃腸外給藥方式施用于這種治療的患者。按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備各種劑型如片劑、顆粒劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑和注射劑。也可使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合，制成所需劑型。
本發(fā)明的藥物優(yōu)選含有1％-99％的銀耳多糖和99％-1％的賦形劑(包括其它配伍的藥物)，優(yōu)選含有30％-80％的銀耳多糖和70％-20％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)，最好含有60％-70％的銀耳多糖和40％-30％的賦形劑(包括其它配伍用的藥物)。
下述的藥理實驗證實了銀耳多糖藥物制劑具有增強免疫，抗腫瘤、抗放射、升高白細(xì)胞、降血糖、抗?jié)兊人幚砘钚?、注射用銀耳多糖的抑瘤作用1.1注射用銀耳多糖對小鼠肝癌H22的生長抑制結(jié)果表明，注射用銀耳多糖對小鼠肝癌H22具有一定的生長抑制作用，實驗組三個劑量的平均抑瘤率分別為16.10％、20.90％、34.83％，存在劑量效應(yīng)關(guān)系，環(huán)磷酰胺20mg/kg的平均抑瘤率為69.205，見表1。
表1注射用銀耳多糖對小鼠肝癌H22的生長抑制作用(X±S)組別 劑量 動物數(shù)(前/后)瘤重(g)抑瘤率(％)P值對照組 20ml/kg20/18 1.87±1.01-環(huán)磷酰胺20mg/kg20/15 0.67±0.4064.2 ＜0.01小劑量組25mg/kg12/11 1.53±0.9318.2 ＞0.05中劑量組50mg/kg12/10 1.58±1.2415.5 ＞0.05大劑量組100mg/kg 12/10 1.21±0.6735.2 ＞0.051.2注射用銀耳多糖對小鼠肉瘤S180的生長抑制作用結(jié)果表明，注射用銀耳多糖對小鼠肉瘤S180具有明顯的生長抑制作用，存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，實驗組三個劑量的平均抑瘤率分別為28.93％、33.03％、42.43％，環(huán)磷酰胺20mg/kg的平均抑瘤率為73.77％，見表2。
表2 注射用銀耳多糖對小鼠肉瘤S180的生長抑制作用(X±S)組別 劑量動物數(shù)(前/后)瘤重(g)抑瘤率(％)P值對照組20ml/kg20/151.94±0.87-環(huán)磷酰胺 20mg/kg20/120.58±0.4670.1＜0.001小劑量組 25mg/kg12/111.43±0.9626.3＞0.05中劑量組 50mg/kg12/121.32±0.6731.9＜0.05大劑量組 100mg/kg 12/101.14±0.7641.2＜0.052、注射用銀耳多糖對放化療小鼠的生白作用對環(huán)磷酰胺所致小鼠外周血白細(xì)胞減少的治療作用結(jié)果表明，ip環(huán)磷酰胺100mg/kg3天后可使小鼠外周血白細(xì)胞明顯降低，一直持續(xù)到第12天，與正常對照組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.001)。注射用銀耳多糖50、100mg/kg于給藥第3～15天對環(huán)磷酸胺所致小鼠外周血白細(xì)胞減少均有明顯對抗作用，與模型組比較差異顯著(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，25mg/kg對環(huán)磷酰胺所致小鼠外周血白細(xì)胞減少除給藥第6天有明顯對抗作用外(P＜0.05)，其它時間均無明顯影響，見表3。
表3注射用銀耳多糖對環(huán)磷酰胺所致小鼠外周血白細(xì)胞減少的對抗作用組別WBC(109/L，X±S，n＝10)0d 3d 6d 9d 12d15d正常對照組 8.76±2.41 8.56±3.06 8.63±2.82 8.45±1.19 8.92±2.26 8.78±1.61模型組 8.78±2.52 3.75±1.73***2.39±1.60***4.53±1.98***7.03±1.37*7.28±2.26注射用銀耳多糖25mg/kg 8.80±2.63 4.96±2.13 4.22±1.28 6.74±3.16 8.69±3.06 9.71±3.3450mg/kg 8.76±2.71 6.29±2.49#5.23±1.92###6.73±2.15#9.57±2.14##11.04±3.87##100mg/kg8.73±2.87 6.93±2.51##5.32±1.97###7.81±1.13###9.73±1.75##10.43±1.32##注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與模型組比較#P＜0.05##P＜0.01，###P＜0.0013、注射用銀耳多糖對放射損傷所致小鼠外周血白細(xì)胞減少的對抗作用結(jié)果表明，小鼠放射損傷后外周血白細(xì)胞明顯降低，一直持續(xù)到第9天，與正常對照組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。注射用銀耳多糖50、100mg/kg于給藥第6～15天對放射損傷所致小鼠外周血白細(xì)胞減少均有明顯對抗作用，與模型組比較差異顯著(P＜0.01或P＜0.001)，25mg/kg除給藥第6及15天有明顯對抗作用外(P＜0.05)，其它時間均無明顯影響，見表4。
表4注射用銀耳多糖對放射損傷所致小鼠外周血白細(xì)胞減少的對抗作用組別 WBC(109/L，X±S，n＝10)0d3d 6d 9d12d 15d正常對照組 7.56±1.617.59±2.34 7.53±1.98 7.58±2.147.82±2.03 8.04±1.87模型組 7.61±1.783.58±1.62***3.19±1.64***5.46±1.82*7.22±1.53 7.00±1.96注射用銀耳多糖25mg/kg 7.53±1.474.08±1.18 4.81±1.34#6.74±3.16 8.73±2.11 9.70±2.89#50mg/kg 7.71±2.074.22±1.58 5.31±1.43##8.84±1.70###11.91±3.93##11.82±3.03###100mg/kg7.82±2.154.48±1.41 5.69±1.50##9.55±2.02###11.76±2.35###12.73±2.92###注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與模型組比較#P＜0.05##P＜0.01，###P＜0.0014、注射用銀耳多糖對葡萄糖所致高血糖的影響240只小鼠分為6組，每組40只，第1，2組sc生鹽水10ml/kg，第3組sc胰島素2u/kg，4，5，6組sc TF 200mg，100mg及50mg/kg，每天一次共給藥7天，末次給藥后30min，除第1組外其余各組均iv葡萄糖2g/kg，第1組iv等體積生理鹽水5ml/kg，分別于iv葡萄糖后5′，30′，60′及120′每組分別處死10只小鼠，測血糖含量，結(jié)果見表5。
表5注射用銀耳多糖對葡萄糖所致高血糖的影響(X±SD)劑量 iv葡萄糖后不同時間血糖含量(mg/dl)組別(mg/kg) 5′ 30′ 60′ 120′正 常 139.9±36.25 116.2±13.30 118.7±16.75 141.9±25.07模 型 332.6±51.46△△△209.1±37.09△△△169.41±35.27△△△162.7±28.35胰島素2u/kg 352.0±54.23 154.1±32.31**133.9±11.58**157.7±19.21多 糖200 254.1±51.37**112.0±27.44***125.2±27.13**119.4±23.14**100 346.9±33.91 147.8±66.19*112.9±18.39**149.6±49.3050377.4±27.51 188.4±59.11 108.70±27.39**105.0±17.63**模型組與正常對照組比較△△△P＜0.001
給藥組與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.0015、注射用銀耳多糖對免疫的促進(jìn)作用(1)銀耳多糖對免疫器官重量的影響取體重16g左右的昆明種小鼠20只，分對照和給藥兩組，雌雄各半。給藥組腹腔注射銀耳多糖，每只2mg×7d，對照組給等量生理鹽水，給藥結(jié)束后次日解剖，用眼眶放血法將小鼠處死。取出脾臟和胸腺并稱重，結(jié)果見表。
表6注射用銀耳多糖對小鼠脾臟和胸腺重量的影響多糖鼠數(shù)給藥途徑 劑量脾指數(shù)±SD 胸腺指數(shù)±SD對照組 11 ip / 61.30±3.31 44.92±3.52銀耳多糖11 ip 100×7 89.56±8.03*40.88±3.61***P＜0.01，**P＞0.05由表6可見，銀耳多糖可明顯增加小鼠脾臟重量，與對照組比較，脾指數(shù)增加0.46倍，但對胸腺的影響不明顯。
(2)銀耳多糖對巨噬功能的影響取體重18-22g，華北種小鼠20只，由爬片法觀察銀耳多糖對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，結(jié)果見表7。
表7注射用銀耳多糖對腹腔細(xì)胞吞噬功能的影響多糖 鼠數(shù) 給藥途徑劑量吞噬百分?jǐn)?shù)±SD吞噬指數(shù)±SD對照組10 ip /57.4±2.61.38±0.09銀耳多糖 10 ip 100×790.0±1.6*4.37±0.34**P＜0.001由表7可見，銀耳多糖可明顯增強小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，與對照組比較，吞噬指數(shù)增加了3.17倍，吞噬百分?jǐn)?shù)增加1.57倍。
6、注射用銀耳多糖對機(jī)體損傷的修復(fù)的保護(hù)作用銀耳多糖的抗炎作用取體重250-300g威斯塔種大白鼠10只，按文獻(xiàn)大白鼠足腫脹法進(jìn)行實驗。用0.1ml 10％雞蛋清溶液致炎，結(jié)果見表8。
表8注射用銀耳多糖對抗炎癥的作用致炎后腫脹率±SD多糖 鼠數(shù) 給藥途徑劑量1hr 3hr 5hr 7hr對照組5 ip / 54.7±8.7 54.3±2.041.6±6.0 23.8±4.1銀耳多糖 5 ip 6030.5±3.8*26.1 ±4.4*14.2±4.6*9.8±3.4*P＜0.05由表8可見，銀耳多糖在致炎后1h即表現(xiàn)出較好地對抗炎癥的作用。
7、注射用銀耳多糖抗?jié)冏饔脤Υ笫髴?yīng)激型潰瘍的影響將大鼠隨機(jī)分組，首次灌胃(po)給藥后即禁食，次日再給藥一次，共2次。末次給藥后1h，將大鼠頭朝下，四肢綁于木架上。16h后，處死動物，剖腹，結(jié)扎幽門，取出全胃，注入10ml生理鹽水，結(jié)扎賁門。然后將全胃浸泡于1％甲醛溶液中固定。沿胃小彎剪開胃，平展于玻璃板上。按文獻(xiàn)方法評定潰瘍等級。實驗結(jié)果見表9。統(tǒng)計表明，二種多糖對大鼠應(yīng)激型潰瘍均有明顯抑制作用。
表9銀耳多糖對大鼠應(yīng)激型潰瘍的作用劑量 潰瘍等級藥物 動物數(shù)P值mg/kg×dX±SD對照6 4.33±0.5銀耳多糖70×2 6 1.66±2.3 ＜0.05銀耳孢子多糖70×2 6 1.50±1.6 ＜0.01
8、注射用銀耳多糖的抗肝炎作用銀耳多糖對甲氯化碳所致大鼠谷-丙轉(zhuǎn)氨酶升高的保護(hù)作用將大鼠隨機(jī)分組。對照組給生理鹽水四氯化碳組于實驗么3，6，9天ip5％四氯化碳麻油溶液；銀耳多糖組均給藥9d，并于給藥第3，6，9天同時ip5％四氯化碳麻油溶液。第10天斷頭取血，以常規(guī)方法測定谷-丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位，見表10。
表10銀耳多糖對四氯化碳所致谷-丙轉(zhuǎn)氨酶升高的影響劑量谷轉(zhuǎn)氨酶藥物 動物數(shù)量 給藥途徑多糖5％CCL4(unit) P值(mg/kg×d) (mg/100g×d)對照組 8 po 45.56±6.025％CCL47 ip0.5×3 106.08±4.81銀耳多糖+5％CCL46 ip 200×9 0.5×3 71.18±2.24 ＜0.01四氯化碳組與對照組比較谷-丙轉(zhuǎn)氨酶升高133％，ip給予銀耳多糖加四氯化碳與對照組比較，谷-丙轉(zhuǎn)氨酶升高56％，上述實驗均為用銀耳孢子及子實體制備的注射用銀耳多糖試驗取得的結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1取銀耳孢子100g，配成10％的水溶液，攪拌6小時，離心(5000轉(zhuǎn))20分鐘，上清液過活性炭柱二次(其中顆?；钚蕴拷?jīng)40目篩再用沸水處理3次，取150g濕法裝柱，用水洗至無色)，濾液經(jīng)100℃水浴加熱20分鐘，冷卻至室溫后冷藏24小時(0-4℃)離心(立式離心機(jī)，16000轉(zhuǎn))，上清液，緩慢加入乙醇至50％，充分?jǐn)嚢瑁x心(16000轉(zhuǎn))，上清液緩慢加入乙醇至60％，充分?jǐn)嚢?，離心(16000轉(zhuǎn))，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗過濾，濾液分裝滅菌，凍干制成成品(13g)。
實施例2取銀耳孢子100g，配制5％的水溶液，保持40-60℃充分?jǐn)嚢?小時，離心(10000轉(zhuǎn))20分鐘，上清液過活性炭柱二次(其中，顆粒活性炭經(jīng)40目篩再用沸水處理3次，取150g濕法裝柱，用水洗至無色)，濾液經(jīng)100℃水浴加熱20分鐘，冷卻至室溫后冷藏24小時(0-4℃)，離心(立式離心機(jī)16000轉(zhuǎn))，上清液，緩慢加入乙酸至60％，充分?jǐn)嚢?，離心(16000轉(zhuǎn))，上清液緩慢加入乙醇至80％，充分?jǐn)嚢瑁x心(16000轉(zhuǎn))，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗過濾，濾液分裝滅菌，凍干制成成品(15.6g)。
實施例3取銀耳子實體100g，洗凈，去托盤、雜質(zhì)，加60倍量水，煎煮5小時，沙布過濾，反復(fù)3次，合并3次煎煮液，濃縮至3000ml，加乙醇至85％，收集沉淀(粗多糖40g)，取粗多糖配成10％的水溶液，攪拌至全部溶解，過活性炭柱二次(其中，顆粒活性炭經(jīng)40目篩再用沸水處理3次，取150g濕法裝柱，用水洗至無色)，濾液經(jīng)100℃水浴加熱20分鐘，冷卻至室溫后冷藏24小時(0-4℃)離心(立式離心機(jī)，16000轉(zhuǎn))，上清液，緩慢加入乙醇至50％，充分?jǐn)嚢瑁x心(16000轉(zhuǎn))，上清液緩慢加入乙醇至60％，充分?jǐn)嚢?，離心(16000轉(zhuǎn))，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗過濾，濾液分裝滅菌，凍干制成成品(9.6g)。
實施例4取銀耳子實體100g，洗凈，去托盤、雜質(zhì)，加60倍量水，煎煮4小時，沙布過濾，反復(fù)3次，合并3次煎煮液，濃縮至3000ml，加乙醇至85％，收集沉淀(粗多糖45g)，取粗多糖配成5％的水溶液，攪拌至全部溶解，過活性炭柱二次(其中，顆粒活性炭經(jīng)40目篩再用沸水處理3次，取150g濕法裝柱，用水洗至無色)，濾液經(jīng)100℃水浴加熱20分鐘，冷卻至室溫后冷藏24小時(0-4℃)離心(立式離心機(jī)，16000轉(zhuǎn))，上清液緩慢加入乙醇至60％，充分?jǐn)嚢?，離心(16000轉(zhuǎn))，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗過濾，濾液分裝滅菌，凍干制成成品(10.2g)。
權(quán)利要求
1.一種銀耳多糖，可由下述兩種方法當(dāng)中的一種制備獲得方法1將銀耳孢子加水?dāng)嚢杈鶆蛑瞥伤芤?，離心后取上清液經(jīng)活性炭過柱兩次，其中，顆?；钚蕴拷?jīng)40目篩再用沸水處理3次，濕法裝柱，用水洗至無色，過濾后水浴加熱，冷卻至室溫后冷藏24小時，將樹脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)除去；離心后取上清液，醇沉至濃度為60％，緩慢加入，充分?jǐn)嚢韬箅x心；取上清液醇沉至濃度為80％，充分?jǐn)嚢柙匐x心，收集沉淀物配液后G4漏斗過濾，分裝滅菌，凍干制成成品；方法2取銀耳子實體去托盤洗凈加水煎煮，過濾取濾液，反復(fù)3次，合并濾液，濃縮加乙醇沉淀得銀耳多糖粗品，加水配制成水溶液，經(jīng)活性炭過柱兩次，其中，顆?；钚蕴拷?jīng)40目篩再用沸水處理3次，濕法裝柱，用水洗至無色，過濾后水浴加熱，冷卻至室溫后冷藏24小時，將樹脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)除去；離心后取上清液，醇沉至濃度為60％，緩慢加入，充分?jǐn)嚢韬箅x心；取上清液醇沉至濃度為80％，充分?jǐn)嚢柙匐x心，收集沉淀物配液后G4漏斗過濾，分裝滅菌，凍干制成成品。
2.銀耳多糖在增強免疫，抗腫瘤、抗放射、升高白細(xì)胞、降血糖、抗?jié)?、抗炎藥物中的?yīng)用。
3.用于增強免疫，抗腫瘤、抗放射、升高白細(xì)胞、降血糖、抗?jié)?、抗炎的藥物組合物，其中含有治療有效量的銀耳多糖和藥學(xué)上可接受的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2、3所述的藥物，其特征在于所說的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
全文摘要
本發(fā)明提供一種銀耳多糖，并提供了其制備方法，將銀耳孢子、銀耳子實體加水?dāng)嚢杈鶆蛑瞥伤芤?，離心后取上清液經(jīng)活性炭過柱兩次，用水洗至無色，過濾后水浴加熱，冷卻至室溫后冷藏，將樹脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)除去；離心后取上清液，醇沉至濃度為60％，緩慢加入，充分?jǐn)嚢韬箅x心；取上清液醇沉至濃度為80％，充分?jǐn)嚢柙匐x心，收集沉淀物配液后G4漏斗過濾，分裝滅菌，凍干制成成品。同時提供了以活性銀耳多糖組分為主要藥物或與其它藥物組方，可用于增強免疫，抗腫瘤、抗放射、升高白細(xì)胞、降血糖、抗?jié)儭⒖寡住?br> 文檔編號A61K31/715GK1415630SQ02144648
公開日2003年5月7日 申請日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月27日
發(fā)明者高其品, 姜瑞芝, 陳英紅 申請人:高其品, 姜瑞芝