本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組及其使用方法，屬于植物病害檢測(cè)、鑒定及防治的早期預(yù)警技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

山核桃干腐病從2002年開始在臨安、淳安、桐廬等山核桃產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，受害面積逐步擴(kuò)大，目前發(fā)生面積達(dá)27萬畝，發(fā)生嚴(yán)重的整株枯死，輕的影響生長(zhǎng)造成落果，據(jù)測(cè)算發(fā)生區(qū)平均產(chǎn)量減少24％左右，成為山核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。有不同的研究報(bào)道或推測(cè)不同的因素和山核桃干腐病的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，即，山核桃干腐病菌(B dothidea)是引起山核桃干腐病的主要病原，且山核桃的發(fā)生嚴(yán)重程度主要與其生物學(xué)和流行特性有關(guān)。連續(xù)5年的觀察發(fā)現(xiàn)，該病原菌以菌絲體在病組織內(nèi)越冬，第二年春季氣溫上升病菌開始活躍，在樹皮表面形成子實(shí)體并釋放孢子，進(jìn)行再侵染。孢子借風(fēng)雨傳播，侵入樹皮細(xì)胞或樹體傷口后表現(xiàn)明顯的“潛伏侵染”特性，從3月下旬開始到11月都有不同程度的病害發(fā)生。4月中旬至6月中旬氣溫在25℃—30℃是孢子釋放侵染的高峰期的高峰，7～8月氣溫30℃以上的高溫天氣不利于病菌的發(fā)展，秋季氣溫下降至30℃以下又會(huì)產(chǎn)生病菌的發(fā)展(未報(bào)道資料)。因?yàn)樵摬【L(zhǎng)期處于“潛伏侵染”狀態(tài)，一旦等其潛伏的共生狀態(tài)轉(zhuǎn)變到腐生致病狀態(tài)，形成肉眼可見的病斑，再采取防治措施，已經(jīng)為時(shí)已晚。防治效果會(huì)很不理想。所以，要高效地防治山核桃干腐病，在其潛伏的共生狀態(tài)期的早期快速檢測(cè)就非常重要。

隨著核酸相關(guān)的鑒定方法不斷發(fā)展，基于普通PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測(cè)山核桃干腐病菌，但PCR法特異性等檢測(cè)耗時(shí)偏長(zhǎng)，需要6～8h，同時(shí)PCR方法需要昂貴儀器PCR儀，且檢測(cè)靈敏度偏低，檢測(cè)過程較繁雜。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本榮研株式會(huì)社發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，因?yàn)槠鋽U(kuò)操作簡(jiǎn)便、快速、特異性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為可以替代PCR的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60-65℃范圍60min內(nèi)，能大量合成目標(biāo)DNA。由于LAMP擴(kuò)增過程依賴識(shí)別靶序列6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性很強(qiáng)，并且核酸擴(kuò)增過程是在恒溫條件下進(jìn)行，普通水浴鍋或者等溫保溫瓶就能滿足反應(yīng)要求，檢測(cè)成本降低，所需時(shí)間短。但是，引物的設(shè)計(jì)不容易獲得。

此外，普通PCR反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳很容易造成產(chǎn)物擴(kuò)增，這是實(shí)驗(yàn)室污染的一個(gè)主要來源；而且溴化乙錠(EB)有巨毒，可累積致癌，對(duì)人體產(chǎn)生巨大危害；長(zhǎng)期觀察紫外燈也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員健康造成一定程度的傷害。而LAMP反應(yīng)只需在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，在擴(kuò)增前加入染料HNB(羥基萘酚藍(lán))作為反應(yīng)指示劑，以HNB的顏色變化做為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)即可，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

靶標(biāo)基因的選擇是LAMP檢測(cè)的重要因素之一。普通PCR常用的靶標(biāo)基因有β微管蛋白基因，后逐步發(fā)展起來成為分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)在于：具有高拷貝數(shù)；同時(shí)包含保持與變異序列；能根據(jù)保守序列中的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特殊引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增比較。雖然真菌的β-tublin總的說來是相對(duì)保守的，但其間有足夠的變異位點(diǎn)可以用于鑒別性比較，而且其多拷貝數(shù)使鑒別性的擴(kuò)增更加靈敏。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物組合物；本發(fā)明還提供該引物組合的應(yīng)用；本發(fā)明還提供一種檢測(cè)山核桃干腐病病菌的LAMP試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物：LAMP引物組合物由上下游外引物，上下游內(nèi)引物四條引物組成，引物序列如下：

上游外引物F3：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；

下游外引物B3：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；

上游內(nèi)引物FIP：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游內(nèi)引物FIB：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

本發(fā)明還同時(shí)提供了一種用于檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，包含上述LAMP引物組合物。

作為本發(fā)明的試劑盒的改進(jìn)：LAMP引物組合物為：1.6μM的正內(nèi)向引物FIP，1.6μM的反向內(nèi)引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

作為本發(fā)明的試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：試劑盒還包含如下：10×ThermoPol Buffer、dNTPs(1mM)、MgCl₂(4mM)、甜菜堿(0.6M)、羥基萘酚藍(lán)(150μM，HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

備注：上述成分組成了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液。

本發(fā)明還同時(shí)提供了一種用于檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，25μL反應(yīng)體系由以下成分組成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、DNA模板1μL，ddH₂O(雙蒸水)補(bǔ)足至25μL。

作為本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的改進(jìn)：利用所述25μL檢測(cè)反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，選擇以下任一方法：

方法一、先在擴(kuò)增前加入染料羥基萘酚藍(lán)(HNB)作為反應(yīng)指示劑，以羥基萘酚藍(lán)(HNB)的顏色變化做為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，顏色發(fā)生變化，即顯色結(jié)果觀察到天藍(lán)色判斷為陽性，判定顯示檢測(cè)到山核桃干腐病病菌；顏色沒有發(fā)生變化，顯色結(jié)果仍為藍(lán)紫色判斷為陰性，判定顯示樣品無山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌含量未達(dá)檢測(cè)的最低檢測(cè)濃度；

方法二、取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，即顯示檢測(cè)到山核桃干腐病病菌；無擴(kuò)增條帶則判斷為陰性，即顯示無山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌未達(dá)最低檢測(cè)濃度。

作為本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的進(jìn)一步改進(jìn)：LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃擴(kuò)增60min；80℃滅活10min。

作為本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述方法一、方法二中的最低檢測(cè)濃度均為0.01ng/μL。

本發(fā)明提供了LAMP引物組合物在檢測(cè)山核桃干腐病病菌LAMP試劑盒中的應(yīng)用，以及提供了一種用于檢測(cè)山核桃干腐病病菌的LAMP試劑盒，包含本發(fā)明所述的引物組合物。

本發(fā)明中，檢測(cè)溶液共24μL，加入待測(cè)DNA模板1μL，構(gòu)成25μL檢測(cè)反應(yīng)體系。

本發(fā)明的方案具體如下：

1、引物的設(shè)計(jì)：

所述的用于檢測(cè)山核桃干腐病菌的特異性引物組是通過擴(kuò)增獲得山核桃干腐病菌大量菌株的β-Tublin基因核酸序列，并和其它茶藨子葡萄座腔菌的β-Tublin基因核酸序列進(jìn)行比對(duì)，針對(duì)保守區(qū)片段序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。其中由一對(duì)上下游外引物和一對(duì)上下游內(nèi)引物，共四條引物組成，內(nèi)引物和外引物的終濃度以8:1的比例進(jìn)行配制。

為檢測(cè)引物特異性為目的，通過分別以山核桃干腐病菌(B dothidea)作為陽性對(duì)照，以蘋果鏈格孢菌(Alternaria mali)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia therbromae)、擬盤多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯絲核菌(Rhizoctonia Solani)、藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi)和齊整小核菌(Sderotium rolfsii)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)七種病原菌作為陰性對(duì)照，并以雙蒸水作為空白對(duì)照進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)該引物具有對(duì)山核桃干腐病檢測(cè)的特異性(圖1)。

2、反應(yīng)程序的優(yōu)化：

以建立能檢測(cè)山核桃干腐病病菌的LAMP最佳反應(yīng)溫度為目的。利用上述引物組合，同反應(yīng)預(yù)混液構(gòu)成檢測(cè)液，加入山核桃干腐病病菌DNA模板1μL，將反應(yīng)溫度分別設(shè)置為59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)管顏色變化，近一步用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)作為驗(yàn)證。

反應(yīng)結(jié)果顯示(圖2)，在反應(yīng)溫度為65℃時(shí)，反應(yīng)管顏色變化最明顯，電泳LAMP條帶最清晰。

以建立能檢測(cè)山核桃干腐病病菌的LAMP最佳反應(yīng)時(shí)間為目的。利用用上述引物組合，同反應(yīng)預(yù)混液構(gòu)成檢測(cè)液，加入山核桃干腐病病菌DNA模板1μL，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為30min、45min、60min、75min，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)管顏色變化，近一步用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)作為驗(yàn)證。

反應(yīng)結(jié)果顯示(圖3)，在反應(yīng)時(shí)間達(dá)到60min及更長(zhǎng)時(shí)，反應(yīng)管顏色變化明顯，電泳LAMP條帶清晰，為節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，即60min為擴(kuò)增時(shí)間。

根據(jù)上述反應(yīng)程序優(yōu)化結(jié)果所述，本發(fā)明中反應(yīng)程序?yàn)?5℃，60min。

在本發(fā)明中，通過山核桃干腐病病菌β-tubulin基因的保守區(qū)片段序列進(jìn)行LAMP引物特異性設(shè)計(jì)，篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高、適用于LAMP快速分子檢測(cè)的引物，進(jìn)而建立可供該菌快速分子檢測(cè)的技術(shù)。本發(fā)明以β-tubulin基因保守區(qū)片段序列設(shè)計(jì)LAMP引物并進(jìn)行快速分子檢測(cè)技術(shù)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化，對(duì)山核桃干腐病病菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)，反應(yīng)過程簡(jiǎn)便(65℃恒溫)、檢測(cè)周期短(僅需60min)、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1)、實(shí)用性好。傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)的方法主要是通過分離培養(yǎng)病原菌，然后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，該方法檢測(cè)需要較高的技術(shù)專業(yè)要求，且存在一定的不確定性。普通PCR反應(yīng)對(duì)病原菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增、回收和測(cè)序，需要溴化乙錠(EB)染色并在紫光燈下觀察才可判別結(jié)果，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)成本高昂，不能滿足經(jīng)濟(jì)高效檢測(cè)的需求。而LAMP反應(yīng)只需在恒溫(65℃)下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后可通過肉眼在常光下直接判斷結(jié)果，能快速檢測(cè)出病原菌，從而增加了其在田間檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。

2)、恒溫?cái)U(kuò)增。不像PCR法必須要熱循環(huán)，這樣就擺脫了對(duì)熱循環(huán)儀器的依賴，只要有穩(wěn)定的熱源如恒溫水浴鍋LAMP反應(yīng)就可以完成，不需要昂貴的儀器設(shè)備，因而便于基層農(nóng)業(yè)生產(chǎn)單位推廣應(yīng)用。LAMP之所以能在恒定的熱源下發(fā)生反應(yīng)是因?yàn)樵贚AMP反應(yīng)液中添加了甜菜堿，使雙鏈DNA處于解鏈的動(dòng)態(tài)平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。

3)、準(zhǔn)確性高。傳統(tǒng)的病原菌鑒定，鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾。LAMP反應(yīng)通過4條引物特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，相對(duì)于普通PCR引物識(shí)別靶序列的2個(gè)獨(dú)立區(qū)域而言，特異性和靈敏度都顯著提高。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為引物特異性測(cè)定對(duì)比圖；

上圖：為L(zhǎng)AMP顯色變化圖；

下圖：為L(zhǎng)AMP瓊脂糖凝膠電泳圖；

M表示DL 2000DNA Marker，檢測(cè)樣品分別為山核桃干腐病菌(B dothidea)、蘋果鏈格孢(Alternaria mali)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、擬盤多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯死核菌(Rhizoctonia Solani)、藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi)、齊整小核菌(Sderotium rolfsii)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和空白對(duì)照雙蒸水。

圖2為反應(yīng)溫度優(yōu)化圖；

上圖：為L(zhǎng)AMP顯色變化圖；

下圖：為L(zhǎng)AMP瓊脂糖凝膠電泳圖；

M表示DL 2000DNA Marker，顯示64℃、65℃的LAMP瓊脂糖凝膠電泳條帶較為明亮。

圖3為反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化圖；

上圖：為L(zhǎng)AMP顯色變化圖；

下圖：為L(zhǎng)AMP瓊脂糖凝膠電泳圖；

M表示DL 2000DNA Marker，顯示在45min后都具有明亮的LAMP瓊脂糖凝膠電泳圖條帶。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

以下實(shí)施例中使用的主要試劑及儀器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs、MgCl₂(Sigma)，dNTPs，甜菜堿、DEPC水、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DNA Maker(TaKaRa生物工程公司基因組)、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(生工生物工程股份有限公司)，eppendorf普通PCR擴(kuò)增儀、上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器廠DK-8D型電加熱恒溫水浴鍋。

以下所用的所有病菌，均已事先檢測(cè)證明了其定性的正確性。

實(shí)施例1、一種用于檢測(cè)山核桃干腐病病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，包括用于檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，

該LAMP引物組合物由以下4條引物組成：

上游外引物(F3)：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；

下游外引物(B3)：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；

上游內(nèi)引物(FIP)：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游內(nèi)引物(FIB)：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

試劑盒包含：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、4mM MgCl₂、0.6mM甜菜堿、150μM羥基萘酚藍(lán)(HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O、1.6μM的正內(nèi)向引物FIP，1.6μM的反向內(nèi)引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

試驗(yàn)使用的25μL反應(yīng)體系由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B30.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、DNA模板1μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。

即，待測(cè)DNA模板1μL，檢測(cè)溶液共24μL，從而構(gòu)成了上述25μL檢測(cè)反應(yīng)體系。

實(shí)施例2、一種用于檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法：

利用所述25μL檢測(cè)反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，選擇以下任一方法：

方法一、先在擴(kuò)增前加入染料羥基萘酚藍(lán)(HNB)作為反應(yīng)指示劑，以羥基萘酚藍(lán)(HNB)的顏色變化做為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，顏色發(fā)生變化，即顯色結(jié)果觀察到天藍(lán)色判斷為陽性，即顯示檢測(cè)到山核桃干腐病病菌；顏色沒有發(fā)生變化，顯色結(jié)果仍為藍(lán)紫色判斷為陰性，即顯示樣品無山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌含量未達(dá)檢測(cè)限；

方法二、取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，即顯示檢測(cè)到山核桃干腐病病菌，無擴(kuò)增條帶則判斷為陰性，即顯示無山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌未達(dá)檢測(cè)限。

LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃擴(kuò)增60min；80℃滅活10min。

實(shí)驗(yàn)一、

提取山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)基因組的DNA，測(cè)量得DNA溶液濃度為200ng/μL。將DNA溶液稀釋，梯度為0.0001ng/μL、0.001ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL。由下方法配置成25μL反應(yīng)體系：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、上述各濃度梯度的DNA模板1μL，以雙蒸水1μL作為空白對(duì)照，最后用雙蒸水各補(bǔ)足至25μL。使用的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃擴(kuò)增60min；80℃滅活10min。

反應(yīng)完成后，在DNA模板濃度為0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL時(shí)反應(yīng)結(jié)果均顯示為陽性，反應(yīng)前后反應(yīng)管的顏色由藍(lán)紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，且用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均具有特異性條帶。在濃度低于0.01ng/μL時(shí)，反應(yīng)管的顏色未出現(xiàn)變化變現(xiàn)為陰性，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)未有特異性條帶出現(xiàn)。

結(jié)果顯示對(duì)山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)DNA的檢測(cè)最低濃度為0.01ng/μL。

實(shí)驗(yàn)二、

提取山核桃干腐病菌(B dothidea)、矩園黑盤孢菌(Melanconium oblongum)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis juglandina)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、祁連金銹菌(Chrysomyxa qilianensis)、茶褐斑擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis guepini)、山茶炭疽菌(Colletotrichum camelliae)7種樹木病害DNA作為模板。

使用25μL反應(yīng)體系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B30.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、DNA溶液作為模板加1μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。

試驗(yàn)結(jié)果除了山核桃干腐病菌(B dothidea)以外的模板都顯示為陰性，反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色未發(fā)生變化，經(jīng)過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均未有特異性條帶出現(xiàn)。表示該引物組合構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系可以檢測(cè)出山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)，且具有特異性。

對(duì)比例1-1、

以以下引物組合進(jìn)行試驗(yàn)：

上游外引物(F3-1)：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCTAT—3’；

下游外引物(B3-1)：5’—TTGTTGCCAAAACACCGCG—3’；

上游內(nèi)引物(FIP)：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游內(nèi)引物(FIB)：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

使用25μL反應(yīng)體系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-1 0.5μL、10μM B3-1 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、以濃度分別為1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的DNA溶液作為模板加1μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。

試驗(yàn)結(jié)果都顯示為陰性，反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色未發(fā)生變化，經(jīng)過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均未有特異性條帶出現(xiàn)。表示該引物組合構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測(cè)出山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)，即使將DNA模板的濃度增加至100ng/μL，仍然無法有效區(qū)分。

對(duì)比例1-2、

以以下引物組合進(jìn)行試驗(yàn)：

上游外引物(F3-2)：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATT—3’；

下游外引物(B3-2)：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGG—3’；

上游內(nèi)引物(FIP)：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游內(nèi)引物(FIB)：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

使用25μL反應(yīng)體系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-2 0.5μL、10μM B3-2 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、以濃度分別為1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的DNA溶液作為模板加1μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。

試驗(yàn)結(jié)果都顯示為陰性，反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色未發(fā)生變化，經(jīng)過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均未有特異性條帶出現(xiàn)。表示該引物組合構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測(cè)出山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)，即使將DNA模板的濃度增加至100ng/μL，仍然無法有效區(qū)分。

對(duì)比例2-1、

以以下引物組合進(jìn)行試驗(yàn)：

上游外引物(F3-3)：5’—TGCCTGTTCGAGCGTCATTA—3’；

下游外引物(B3-3)：5’—TTCAGAAGGTTCGTCCGGC—3’；

上游內(nèi)引物(FIP-3)：5’—CCGAGGTCTTTGAGGCGC-GGTATTGGGCACCGTCCTTT—3’；

下游內(nèi)引物(FIB-3)：5’—GCGTCTTGCCTCAAGCG-GCTCCGAAGCGAGATGTATGT—3’。

使用25μL反應(yīng)體系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP-3 2.0μL、20μM BIP-3 2.0μL、10μM F3-3 0.5μL、10μM B3-3 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、分別以山核桃干腐病菌(B dothidea)、蘋果鏈格孢(Alternaria mali)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、擬盤多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯死核菌(Rhizoctonia Solani)、藤倉鐮刀菌(Fusarium fujikuroi)、齊整小核菌(Sderotium rolfsii)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和空白對(duì)照雙蒸水作為DNA模板；ddH₂O(雙蒸水)補(bǔ)足至25μL。

試驗(yàn)結(jié)果都顯示為陽性，反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色發(fā)生變化，經(jīng)過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均有特異性條帶出現(xiàn)。表示上述引物組合構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測(cè)區(qū)分出“茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。

對(duì)比例2-2、

以以下引物組合進(jìn)行試驗(yàn)：

上游外引物(F3-4)：5’—TGCCTGTTCGAGCGTCAAAA—3’；

下游外引物(B3-4)：5’—TTCAGAAGGTTCGTCCGGG—3’；

上游內(nèi)引物(FIP-4)：5’—CCGAGGTCTTTGAGGCGC-GGTATTGGGCACCGTCCAAA—3’；

下游內(nèi)引物(FIB-4)：5’—GCGTCTTGCCTCAAGCG-GCTCCGAAGCGAGATGTATTG—3’。

使用25μL反應(yīng)體系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP-4 2.0μL、20μM BIP-4 2.0μL、10μM F3-4 0.5μL、10μM B3-4 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、分別以山核桃干腐病菌(B dothidea)、蘋果鏈格孢(Alternaria mali)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、擬盤多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯死核菌(Rhizoctonia Solani)、藤倉鐮刀菌(Fusarium fujikuroi)、齊整小核菌(Sderotium rolfsii)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和空白對(duì)照雙蒸水作為DNA模板；ddH₂O(雙蒸水)補(bǔ)足至25μL。

試驗(yàn)結(jié)果都顯示為陽性，反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色發(fā)生變化，經(jīng)過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均有特異性條帶出現(xiàn)。表示該引物組合構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測(cè)區(qū)分出山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110> 浙江農(nóng)林大學(xué)

<120> 檢測(cè)山核桃干腐病病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>上游外引物F3

<400> 1

cgcgttcaga agattgccat a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>下游外引物B3

<400> 2

ttgttgccaa aacacccgc 19

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>上游內(nèi)引物FIP

<400> 3

gcgtgggaga acatcaatga cgctcgagct gaaggtccg 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>下游內(nèi)引物FIB

<400> 4

cttacacgcc agagccgtaa cgcgaatcga caccacag 38