本發(fā)明屬于稀土配合物及其制備和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種稀土-縮合類單寧配合物及其制備方法和作為抗真菌劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物多酚是廣泛存在于植物皮、根、葉、殼和果肉中的化合物，通常將分子量為500～3000的植物多酚稱為單寧(石碧.植物多酚[m].科學(xué)出版社,2000.)。根據(jù)單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征又可將其分為水解類單寧和縮合類單寧，水解類單寧分子內(nèi)具有酯鍵，通常是以一個多元醇為核心，通過酯鍵與多個酚羧酸相連接而成，易水解；縮合類單寧是黃烷醇的聚合物，分子結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)是以c-c鍵相連接，不易水解。研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚具有抗氧化、抗病毒、消炎、抗菌等生物活性(石碧.植物多酚[m].科學(xué)出版社,2000；olivers,vittorioo,cirillog,etal.enhancingthetherapeuticeffectsofpolyphenolswithmacromolecules[j].polymerchemistry,2016,7(8):1529-1544.)。其中植物多酚的抗菌機(jī)理主要表現(xiàn)在如下幾方面：與酶本身、酶的輔助因子或酶促反應(yīng)的底物結(jié)合，從而達(dá)到對酶促反應(yīng)的抑制(dasj,ramanir,surajumo.polyphenolcompoundsandpkcsignaling[j].biochimicaetbiophysicaacta,2016；opokutemengc,sintimho.inhibitionofcyclicdiadenylatecyclase,disa,bypolyphenols[j].scientificreports,2016,6.)；與構(gòu)成核苷酸的嘌呤和嘧啶結(jié)合，抑制菌體遺傳物質(zhì)的合成(張力平,孫長霞,李俊清,等.植物多酚的研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[j].林業(yè)科學(xué),2005,41(6):157-162.)；與細(xì)胞外膜穩(wěn)定性相關(guān)的二價陽離子發(fā)生螯合，破壞細(xì)胞膜的完整性(nohyneklj,alakomih,kahahkonenmp,etal.berryphenolics:antimicrobialpropertiesandmechanismsofactionagainstseverehumanpathogens[j].nutrition&cancer,2006,54(1):18-32.)。但遺憾的是，植物多酚的穩(wěn)定性差、生物利用率較低且膜穿透性不強(qiáng)(olivers,vittorioo,cirillog,etal.enhancingthetherapeuticeffectsofpolyphenolswithmacromolecule[j].polymerchemistry,2016,7(8):1529-1544.)。另外，稀土(re)雖具有很好的抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗菌等生物活性而且對人體毒性小，但是，稀土的水溶性太強(qiáng)且易水解，難以與細(xì)胞結(jié)合，從而使其抗菌活性大大降低。

有研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚中大量的酚羥基可以與稀土離子發(fā)生配位反應(yīng)，因此，植物多酚與稀土離子配位形成的配合物不僅能解決植物多酚細(xì)胞膜穿透性差的問題，同時也可以解決稀土離子水溶性強(qiáng)的問題，于是有人公開了一些稀土-小分子的植物多酚(分子量通常低于500)配合物，如：稀土-蘆丁(吳錦繡.稀土蘆丁配合物的合成、抑菌活性及與血清白蛋白的相互作用的研究[d].西北師范大學(xué),2007.)、稀土-槲皮素(zhouj,wanglf,wangjy,etal.synthesis,characterization,antioxidativeandantitumoractivitiesofsolidquercetinrareearth(iii)complexes[j].journalofinorganicbiochemistry,2001,83:41-48.)、稀土-姜黃素(songym,xujp,dingl,etal.syntheses,characterizationandbiologicalactivitiesofrareearthmetalcomplexeswithcurcuminand1,10-phenanthroline-5,6-dione[j].journalofinorganicbiochemistry,2009,103(3):396-400.)、稀土-柚皮苷(夏侯國論,劉霞,丁冶春,等.柚皮苷-稀土配合物的合成及抗腫瘤活性的研究[j].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015(1):30-32.)。這些配合物確有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤、抗癌等生物活性，但美中不足的是所采用的小分子的植物多酚價格較貴，且所得的配合物抑菌活性又較弱，特別是對真菌幾乎沒有抑制作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，首先提供一種稀土-縮合類單寧配合物的制備方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述方法制備的稀土-縮合類單寧配合物。

本發(fā)明的再一目的是提供由上述方法制備的稀土-縮合類單寧配合物的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的稀土-縮合類單寧配合物的制備方法，該方法的工藝步驟和條件如下：

先將摩爾比1:9-5:9的縮合類單寧和硝酸稀土分別溶于水，然后在20～50℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將硝酸稀土溶液加入到縮合類單寧溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)6～10h，離心分離，冷凍干燥即得到稀土-縮合類單寧配合物。

以上方法中所述的縮合類單寧為落葉松單寧(lt)、楊梅單寧(bt)或黑荊樹單寧(bwt)中的任一種，優(yōu)選lt。

以上所述的縮合類單寧是參照《落葉松原花色素的分級及精細(xì)化利用研究》(杜曉.落葉松原花色素的分級及精細(xì)化利用研究[d].四川大學(xué),2006.)公開的方法提取的，具體的操作方法為：在200質(zhì)量份的植物樹皮粉碎物中，加入250體積份的70％乙醇水溶液，然后在60℃的水浴中回流提取90min，收集提取液，反復(fù)三次；提取液趁熱粗過濾，除去雜質(zhì)，自然冷卻至室溫，過濾除去沉淀物；隨后，在50±5℃下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去濾液中的乙醇，自然冷卻至室溫，過濾除去沉淀物；最后在50±5℃下，將濃縮液減壓干燥，即得到縮合類單寧。其中所用的植物樹皮粉碎物對應(yīng)為落葉松樹皮粉碎物、楊梅樹皮粉碎物或黑荊樹樹皮粉碎物中的任一種。

以上方法中所述的硝酸稀土為硝酸鑭la(no3)3、硝酸鈰ce(no3)3、硝酸鐠pr(no3)3、硝酸釹nd(no3)3、硝酸釤sm(no3)3、硝酸釓gd(no3)3或硝酸鐿yb(no3)3中的任一種，優(yōu)選ce(no3)3。

以上方法中所述的縮合類單寧和硝酸稀土的摩爾比優(yōu)選2:9-3:9；反應(yīng)溫度優(yōu)選20～30℃；反應(yīng)時間優(yōu)選6～8h。

本發(fā)明提供的稀土-縮合類單寧的配合物，其特征在于該配合物中的配體為縮合類單寧，配位金屬離子為稀土離子，配位數(shù)為4-8，且對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌和毛霉真菌的最小抑菌濃度(mic)為0.8～6.4mg/ml。

以上配合物中所述的縮合類單寧為落葉松單寧、楊梅單寧或黑荊樹單寧中的任一種，優(yōu)選落葉松單寧(lt)。

以上配合物中所述的稀土離子為鑭離子、鈰離子、鐠離子、釹離子、釤離子、釓離子或鐿離子中的任一種，優(yōu)選鈰離子。

當(dāng)用以上方法中的優(yōu)選條件制備稀土-縮合類單寧的配合物，該稀土-縮合類單寧的配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌和毛霉真菌的最小抑菌濃度(mic)為0.8～3.2mg/ml。

本發(fā)明提供上述方法制備的稀土-縮合類單寧配合物的應(yīng)用是在抗真菌方面的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其具有以下有益效果：

(1)由于本發(fā)明提供的制備方法選擇的硝酸稀土與縮合類單寧進(jìn)行配位反應(yīng)后，其中的re(iii)(re表示稀土)的正電荷部分轉(zhuǎn)移到單寧分子上，使螯合物環(huán)上的電子產(chǎn)生了離域效應(yīng)，降低了re(iii)的極性，增強(qiáng)了配合物的脂溶性，因而使所得配合物能更好的穿透細(xì)胞膜，從而能獲得殺滅真菌的效果。

(2)由于本發(fā)明提供的制備方法選擇了價格低廉的縮合類單寧來作為配體，因而既解決了現(xiàn)有技術(shù)采用小分子配體價格貴的問題，又提高抗真菌活性，同時也為抗真菌領(lǐng)域提供了一種價廉且活性強(qiáng)的抗真菌劑。

(3)本發(fā)明提供的稀土-縮合類單寧配合物抑菌活性較強(qiáng)，尤其是對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌和毛霉這四種真菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌活性。

(4)本發(fā)明提供的制備方法簡單、條件溫和、可控性強(qiáng)，便于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1所使用的配體的分子結(jié)構(gòu)以及制備配合物ce(iii)-lt的合成反應(yīng)示意圖。其中l(wèi)t分子結(jié)構(gòu)中b環(huán)上的鄰位酚羥基可與ce(iii)發(fā)生配位反應(yīng)形成ce(iii)-lt配合物。反應(yīng)過程中溶液的ph降低，也說明ce(iii)確實與lt中b環(huán)上的鄰位酚羥基發(fā)生配位反應(yīng)并釋放出了氫質(zhì)子。

圖2為本發(fā)明實施例1所制備的配合物ce(iii)-lt及其配體的紅外光譜圖。從圖中可見，與配體的譜圖相比，配合物紅外譜圖發(fā)生了較大變化。lt在3354cm^-1處有一個明顯的大峰，這是lt分子中o-h鍵的伸縮振動產(chǎn)生的，而此峰的寬度取決于lt分子與水分子之間形成氫鍵的強(qiáng)弱，ce(iii)-lt中此峰明顯變窄，說明lt分子中的酚羥基中氧原子的孤對電子與ce(iii)的空軌道結(jié)合后，與水分子形成的氫鍵就被削弱了；lt在1613、1517、1446cm^-1處的三個吸收峰則是lt分子中苯環(huán)骨架的伸縮振動吸收峰，在ce(iii)-lt中，這三個吸收峰向高波數(shù)移動或消失；lt在1362、1280cm^-1的吸收峰是酚羥基的c-o鍵伸縮振動與o-h鍵面內(nèi)變形振動耦合所致，在ce(iii)-lt中，這兩個峰向高波數(shù)移至1353cm^-1、1324cm^-1，說明酚羥基參與了配位成鍵；ce(iii)-lt在588cm^-1處觀察到ce-o鍵伸縮振動吸收峰，說明配合物中含有ce-o鍵。

圖3為本發(fā)明實施例1所制備的配合物ce(iii)-lt及其配體的o1sxps譜圖。從lt的o1s圖譜可見只有一個位于532.57ev處的峰，此峰對應(yīng)于lt中的酚羥基的氧原子(c-oh)，而ce(iii)-lt中有兩個峰，其533.38ev處的峰為酚羥基中的氧原子，532.16ev處的峰為酚羥基的氧原子與稀土離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)(c-o-ce)形成的，由此引起氧原子上的電子密度降低，其電子結(jié)合能向高場位移。

圖4為本發(fā)明實施例1所制備的配合物ce(iii)-lt及其配體的紫外光譜圖。從lt的紫外圖譜中可見273nm處出現(xiàn)一個明顯的特征峰，該峰是lt分子結(jié)構(gòu)中酚羥基的特征吸收峰，但與ce(iii)反應(yīng)后，該特征吸收峰紅移至278nm且吸光度值減小。紅移是因為形成配合物后，整個分子中電子的離域程度增大，電子躍遷所需能量降低所致。

圖5為不同摩爾比的兒茶素與ce(iii)反應(yīng)后ph的減小的曲線圖。從圖中可見隨著摩爾比的增加，體系ph有下降趨勢并于摩爾比大于等于4時趨于穩(wěn)定。根據(jù)常見ce(iii)的配位數(shù)為4、6、7、8、9、10以及12，但由于lt分子量大、空間位阻較大，且水分子也可以參與ce(iii)的配位反應(yīng)，故實施例1制備的配合物ce(iii)-lt的配位數(shù)為4-8。

圖6為本發(fā)明實施例1所制備的配合物ce(iii)-lt和水(空白對照)對黑曲霉的抑菌圈照片(左為實驗組，右為對照組)。很顯然，與對照組相比，ce(iii)-lt對黑曲霉具有明顯的抑制作用，且其抑菌圈直徑高達(dá)26.66mm。

圖7為用本發(fā)明實施例1所制備的配合物ce(iii)-lt和水(空白對照)處理的紅曲霉的生長曲線。與空白對照相比，ce(iii)-lt幾乎完全抑制了紅曲霉的生長。

圖8為本發(fā)明實施例2所制備的配合物ce(iii)-lt和水(空白對照)處理的紅曲霉的透射電鏡照片(左為實驗組，右為對照組)。從照片對比可見，正常生長的紅曲霉細(xì)胞壁完整，細(xì)胞基質(zhì)均勻(右圖)，而在ce(iii)-lt的作用下，紅曲霉細(xì)胞壁脫落、破裂，細(xì)胞基質(zhì)已被溶解、消失，說明ce(iii)-lt具有較強(qiáng)的抗真菌活性。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

值得說明的是：1)為了敘述更為簡單，首先按照以下方法分別提取lt、bt、bwt：即分別在200質(zhì)量份的落葉松樹皮粉碎物、楊梅樹皮粉碎物或黑荊樹樹皮粉碎物中，加入250體積份的70％乙醇水溶液，然后在60℃的水浴中回流提取90min，收集提取液，反復(fù)三次；提取液趁熱粗過濾，除去雜質(zhì)，自然冷卻至室溫，過濾除去沉淀物；隨后，在50±5℃下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去濾液中的乙醇，自然冷卻至室溫，過濾除去沉淀物；最后在50±5℃下，將濃縮液減壓干燥，即得到固體縮合類單寧lt、bt、bwt。2)配位數(shù)是按這樣一種方法測定的：由于re(iii)與縮合類單寧發(fā)生配位反應(yīng)時，會有氫質(zhì)子的釋放，使體系的ph降低.所以是根據(jù)配位反應(yīng)后ph的減小量來確定re(iii)的配位數(shù)。由于以下實施例所用的lt、bt、bwt分別以兒茶素(c)、表棓兒茶素沒食子酸酯(egcg)、焦性沒食子酸(pa)為結(jié)構(gòu)單元，故以其模型分子模擬其配位反應(yīng)過程。其操作步驟為：按摩爾比2:1-6:1分別稱模型分子和re(iii)，并分別溶于適量的水中，并分別測其ph。在30℃下，以滴加方式將re(iii)溶液加入模型分子溶液中，混合攪拌反應(yīng)至穩(wěn)定，并測其ph。3)以下實施例抗菌活性的測試所采用的是瓊脂擴(kuò)散法和微量稀釋法。其中瓊脂擴(kuò)散法是利用抗菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，以顯示其抗菌作用的定性實驗。微量稀釋法是按照臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(clsi)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》(m38-a)進(jìn)行的定量測試。

實施例1

先將摩爾比2:9的lt和ce(no3)3分別溶于水，然后在25℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將ce(no3)3溶液加入到lt溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)8h，離心分離，冷凍干燥即得到ce(iii)-lt配合物。

該配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抑菌圈可高達(dá)20.66～36.18mm，其最小抑菌濃度分別為1.6、1.6、0.8和1.6mg/ml。

實施例2

先將摩爾比1:9的bt和pr(no3)3分別溶于水，然后在20℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將pr(no3)3溶液加入到bt溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)7.5h，離心分離，冷凍干燥即得到pr(iii)-bt配合物。

該配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抑菌圈可高達(dá)14.82～17.73mm，其最小抑菌濃度分別為3.2、1.6、1.6和6.4mg/ml。

實施例3

先將摩爾比3:9的lt和gd(no3)3分別溶于水，然后在50℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將gd(no3)3溶液加入到lt溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)6h，離心分離，冷凍干燥即得到gd(iii)-lt配合物。

該配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抑菌圈可高達(dá)13.80～19.10mm，最小抑菌濃度分別為1.6、1.6、1.6和3.2mg/ml。

實施例4

先將摩爾比2:9的bt和nd(no3)3分別溶于水，然后在30℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將nd(no3)3溶液加入到bt溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)10h，離心分離，冷凍干燥即得到nd(iii)-bt配合物。

該配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抑菌圈可高達(dá)14.55～20.01mm，最小抑菌濃度分別為3.2、1.6、1.6和3.2mg/ml。

實施例5

先將摩爾比2.5:9的lt和la(no3)3分別溶于水，然后在20℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將la(no3)3溶液加入到lt溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)7h，離心分離，冷凍干燥即得到la(iii)-lt配合物。

該配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抑菌圈可高達(dá)16.56～30.69mm，最小抑菌濃度分別為1.6、1.6、1.6和3.2mg/ml。

實施例6

先將摩爾比4:9的bt和sm(no3)3分別溶于水，然后在30℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將sm(no3)3溶液加入到bt溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)9h，離心分離，冷凍干燥即得到sm(iii)-bt配合物。

該配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抑菌圈可高達(dá)13.77～20.21mm，最小抑菌濃度分別為1.6、1.6、1.6和3.2mg/ml。

實施例7

先將摩爾比5:9的bwt和yb(no3)3分別溶于水，然后在40℃下，以邊攪拌邊滴加的方式將yb(no3)3溶液加入到bwt溶液中，滴加完后再攪拌反應(yīng)6h，離心分離，冷凍干燥即得到y(tǒng)b(iii)-bwt配合物。

該配合物對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抑菌圈可高達(dá)15.10～18.30mm，最小抑菌濃度分別為3.2、1.6、3.2和3.2mg/ml。

對比例1-3

測定lt、bt、bwt三種單寧對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抗菌活性，結(jié)果表明lt只對白腐菌有抑制作用且抑菌圈為13.66mm；bt只對白腐菌、紅曲霉有抑制作用且抑菌圈為11.61～13.78mm；bwt只對紅曲霉、白腐菌有抑制作用且抑菌圈為12.60～14.80mm。

對比例4-11

測定la(iii)、ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、sm(iii)、gd(iii)和yb(iii)八種稀土離子對黑曲霉、紅曲霉、白腐菌、毛霉四種真菌的抗菌活性，結(jié)果表明:ce(iii)、gd(iii)和yb(iii)對四種真菌沒有抑制作用；pr(iii)、nd(iii)與sm(iii)只對紅曲霉、白腐菌有抑制作用且抑菌圈為10.60～12.80mm；la(iii)對紅曲霉、白腐菌以及毛霉均有抑制作用但抑菌圈為11.27～14.80mm。