本發(fā)明涉及一種蔗糖合成酶在調(diào)控植物果實發(fā)育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃瓜是世界各國普遍栽培的重要蔬菜之一，也是我國五大蔬菜作物之一。與大多數(shù)高等植物相同，黃瓜的光合作用主要發(fā)生在成熟的葉片、果實和莖等綠色組織中，我們稱之為“源”。而對于根、花和種子等不具有光合能力的非綠色組織，我們稱之為“庫”。蔗糖是綠色植物進行光合作用的主要產(chǎn)物，也是光合產(chǎn)物主要運輸形式，蔗糖經(jīng)過韌皮部向庫器官運輸，為細胞的生長發(fā)育供應(yīng)碳源和能源；蔗糖代謝在植物發(fā)育、逆境響應(yīng)和產(chǎn)量形成過程中發(fā)揮著重要的作用，它主要通過生成一系列糖作為燃料的代謝物和合成化合物(包括蛋白質(zhì)、纖維素和淀粉)和作為信號分子調(diào)節(jié)microRNA的表達、轉(zhuǎn)錄因子和其他基因以及激素、氧化應(yīng)激和防御信號的交互作用。從源器官合成的碳水化合物以多糖的形式通過韌皮部運輸?shù)礁鱾€庫器官中貯存或吸收利用。到達庫器官，少部分的二糖或多糖可以被庫器官直接吸收利用，大部分多糖水解為單糖被植物所吸收。在植物體內(nèi)與蔗糖代謝相關(guān)的主要有三種酶：1、蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase；SPS，EC 2.3.1.14)，催化反應(yīng)：果糖-6-P+UDPG→蔗糖-6-P+UDP，是催化蔗糖合成的關(guān)鍵酶。2、蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Invertase；Inv，EC2.1.1.26)，催化反應(yīng)：蔗糖+H₂O→葡萄糖+果糖，是蔗糖分解過程的中的關(guān)鍵酶。3、蔗糖合成酶(Sucrose Synthase；SUS，E.C.2.4.1.13)，催化的是一個可逆反應(yīng)：蔗糖+UDP←→UDPG+果糖。蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶在植物糖代謝都是分解蔗糖，在調(diào)節(jié)源庫關(guān)系過程中發(fā)揮著重要的作用。蔗糖合成酶分解蔗糖的產(chǎn)物為UDPG，為纖維素合成提供底物。蔗糖合成酶是蔗糖代謝過程中的一個關(guān)鍵酶，該酶已經(jīng)在很多植物中被研究，并且被認為在植物體內(nèi)的能量代謝過程中起到重要作用，在植物細胞內(nèi)直接參與蔗糖的調(diào)動，細胞結(jié)構(gòu)的形成以及碳水化合物的積累。但蔗糖合成酶在黃瓜果實發(fā)育的過程的功能還不清楚。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種蔗糖合成酶在調(diào)控植物果實發(fā)育中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法(方法甲)，是將蔗糖合成酶的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物滿足如下(a1)-(a5)中至少一種性狀：

(a1)果實產(chǎn)量大于所述目的植物；

(a2)果實長度大于所述目的植物；

(a3)果實粗度(直徑)大于所述目的植物；

(a4)果實重量大于所述目的植物；

(a5)雄花大于所述目的植物。

所述方法甲中，所述蔗糖合成酶的編碼基因可以通過重組表達載體導(dǎo)入目的植物。所述重組表達載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到目的植物中。

可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。使用所述基因構(gòu)建重組表達載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用所述基因構(gòu)建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入在植物中表達可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學(xué)試劑標記基因等。

所述重組表達載體具體可為在載體pBI 121的多克隆位點中插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

所述重組表達載體具體可為將載體pBI 121的XbaI和SmaI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列2所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護所述方法甲在植物育種中的應(yīng)用。

所述植物育種是為了選育果實產(chǎn)量高和/或果實長度大和/或果實粗度(直徑)大和/或雄花大的植物。

本發(fā)明還保護一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法(方法乙)，是抑制目的植物中蔗糖合成酶的編碼基因的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物滿足如下(b1)-(b5)中至少一種性狀：

(b1)果實產(chǎn)量小于所述目的植物；

(b2)果實長度小于所述目的植物；

(b3)果實粗度(直徑)小于所述目的植物；

(b4)果實重量小于所述目的植物；

(b5)雄花小于所述目的植物。

所述方法乙中，所述“抑制目的植物中蔗糖合成酶的編碼基因的表達”是通過干擾載體實現(xiàn)的。

所述干擾載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到目的植物中。

所述干擾載體具體可為含有干擾片段的重組表達載體。

所述干擾片段包括區(qū)段甲和區(qū)段乙。所述區(qū)段甲和所述區(qū)段乙為反向互補序列。所述區(qū)段甲的序列如序列表的序列3所示。所述干擾片段具體可為序列表的序列4所示。

所述干擾載體具體可為在載體pFGC1008的多克隆位點中插入了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子得到的重組表達載體。

所述干擾載體具體可為將載體pFGC1008的AscI和SpeI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列4所示的DNA分子得到的重組表達載體。

本發(fā)明還保護所述方法乙在植物育種中的應(yīng)用。

所述植物育種是為了選育果實產(chǎn)量低和/或果實長度小和/或果實粗度(直徑)小和/或雄花小的植物。

以上任一所述方法中，所述目的植物具體可為雙子葉植物。所述雙子葉植物可為葫蘆科植物。所述葫蘆科植物可為黃瓜屬植物。所述黃瓜屬植物具體可為黃瓜，例如新泰密刺黃瓜。

本發(fā)明還保護蔗糖合成酶的應(yīng)用，為如下(e1)-(e16)中的至少一種：

(e1)調(diào)控植物果實發(fā)育；

(e2)調(diào)控植物庫強；

(e3)調(diào)控植物器官中蔗糖合成酶活性；

(e4)調(diào)控植物果實中蔗糖合成酶活性；

(e5)調(diào)控植物雄花中蔗糖合成酶活性；

(e6)調(diào)控植物器官中蔗糖合成酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖的活性；

(e7)調(diào)控植物果實中蔗糖合成酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖的活性；

(e8)調(diào)控植物雄花中蔗糖合成酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖的活性；

(e9)促進植物果實發(fā)育；

(e10)提高植物庫強；

(e11)促進植物器官中蔗糖合成酶活性；

(e12)促進植物果實中蔗糖合成酶活性；

(e13)促進植物雄花中蔗糖合成酶活性；

(e14)促進植物器官中蔗糖合成酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖的活性；

(e15)促進植物果實中蔗糖合成酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖的活性；

(e16)促進植物雄花中蔗糖合成酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖的活性。

所述植物具體可為雙子葉植物。所述雙子葉植物可為葫蘆科植物。所述葫蘆科植物可為黃瓜屬植物。所述黃瓜屬植物具體可為黃瓜，例如新泰密刺黃瓜。

本發(fā)明還保護一種特異DNA分子，包括區(qū)段甲和區(qū)段乙。所述區(qū)段甲和所述區(qū)段乙為反向互補序列。所述區(qū)段甲的序列如序列表的序列3所示。所述特異DNA分子如序列表的序列4所示。

本發(fā)明還保護一種干擾載體，是將所述特異DNA分子導(dǎo)入表達載體得到的。

所述干擾載體具體可為在載體pFGC1008的多克隆位點中插入了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子得到的重組表達載體。

所述干擾載體具體可為將載體pFGC1008的AscI和SpeI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列4所示的DNA分子得到的重組表達載體。

本發(fā)明還保護所述特異DNA分子或所述干擾載體在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；所述轉(zhuǎn)基因植物滿足如下(f1)-(f5)中至少一種性狀：

(f1)果實產(chǎn)量小于出發(fā)植物；

(f2)果實長度小于出發(fā)植物；

(f3)果實粗度(直徑)小于出發(fā)植物；

(f4)果實重量小于出發(fā)植物；

(f5)雄花小于出發(fā)植物。

所述出發(fā)植物具體可為雙子葉植物。所述雙子葉植物可為葫蘆科植物。所述葫蘆科植物可為黃瓜屬植物。所述黃瓜屬植物具體可為黃瓜，例如新泰密刺黃瓜。

以上任一所述蔗糖合成酶具體可為蔗糖合成酶CsSUS4。

所述蔗糖合成酶CsSUS4，獲自黃瓜，是如下(c1)或(c2)：

(c1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(c2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

為了使(c1)中的蔗糖合成酶CsSUS4便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1標簽的序列

上述(c2)中的蔗糖合成酶CsSUS4可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(c2)中的蔗糖合成酶CsSUS4的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。

以上任一所述蔗糖合成酶的編碼基因具體可為CsSUS4基因。

所述CsSUS4基因為如下(d1)-(d3)中任一所述的DNA分子：

(d1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；

(d2)在嚴格條件下與(d1)限定的DNA序列雜交且編碼蔗糖合成酶的DNA分子；

(d3)與(d1)或(d2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼蔗糖合成酶的DNA分子。

上述嚴格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了蔗糖合成酶基因CsSUS4在黃瓜果實發(fā)育過程中發(fā)揮著的關(guān)鍵性作用，可以調(diào)節(jié)庫強從而促進果實的發(fā)育。這一優(yōu)良的功能對于改良黃瓜的高效增產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

附圖說明

圖1為過表達轉(zhuǎn)基因株系PCR鑒定結(jié)果。

圖2為干擾轉(zhuǎn)基因株系PCR鑒定結(jié)果。

圖3為黃瓜不同組織部位及不同時期CsSUS4基因表達量及酶活性分析結(jié)果。

圖4為轉(zhuǎn)基因植株果實表型及果實中酶活性分析結(jié)果。

圖5為轉(zhuǎn)基因植株雄花表型及雄花中酶活性分析結(jié)果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

新泰密刺黃瓜：參考文獻：Cheng J，Wang Z，Yao F，et al.Down-Regulating CsHT1，a Cucumber Pollen-Specific Hexose Transporter，Inhibits Pollen Germination，Tube Growth，and Seed Development.[J].Plant Physiology，2015，168(2)：635-47.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

載體pBI 121：Cheng J，Wang Z，Yao F，et al.Down-Regulating CsHT1，a Cucumber Pollen-Specific Hexose Transporter，Inhibits Pollen Germination，Tube Growth，and Seed Development.[J].Plant Physiology，2015，168(2)：635-47.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

載體pFGC1008：Cheng J，Wang Z，Yao F，et al.Down-Regulating CsHT1，a Cucumber Pollen-Specific Hexose Transporter，Inhibits Pollen Germination，Tube Growth，and Seed Development.[J].Plant Physiology，2015，168(2)：635-47.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

農(nóng)桿菌LBA4404：Cheng J，Wang Z，Yao F，et al.Down-Regulating CsHT1，a Cucumber Pollen-Specific Hexose Transporter，Inhibits Pollen Germination，Tube Growth，and Seed Development.[J].Plant Physiology，2015，168(2)：635-47.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

MS固體培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基4.43g，蔗糖30g，植物凝膠2.5g，補水至1L，調(diào)pH 5.7-5.8。

MS分化培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基4.43g，蔗糖30g，植物凝膠2.5g，6-BA 0.5mg，ABA 1mg，補水至1L，pH 5.7-5.8。

MS培養(yǎng)基：北京西美杰科技有限公司，貨號：M519。

3，5-二硝基水楊酸溶液：向262mL 2M NaOH水溶液中加入6.3g 3，5-二硝基水楊酸粉末，然后與500mL含185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液混和，再加入5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉后攪拌溶解，冷卻后加雙蒸水定容至1000mL，棕色瓶保存一星期后使用。

以下實施例中粗酶液的制備方法為：取1g待測樣品于冰浴的研缽中，加入4mL酶提取液(溶劑為pH7.5、50mM HEPES-NaOH緩沖液；含10mM MgCl₂、1mM EDTA、2.5mM DTT、0.1g/100mlBSA和體積百分含量為0.05％的TritonX-100)研磨成勻漿，13000rpm離心20min，取上清。將上清裝入透析袋中，在透析液(不含有TritonX-100，其余各個溶質(zhì)的濃度為酶提取液中濃度的十分之一)中透析16h，取透析液中的液體，即為粗酶液，用于酶活性測定。

以下實施例中蔗糖合成酶活性的檢測方法為：配制700μL反應(yīng)體系，30℃反應(yīng)30min；向反應(yīng)體系中加入1500μL 3，5-二硝基水楊酸溶液終止反應(yīng)；將反應(yīng)體系沸水浴10min，冷卻后測定OD_540nm值。酶活力以單位果實鮮重中的粗酶液在單位時間內(nèi)催化蔗糖分解產(chǎn)生果糖的μmol數(shù)表示。單位為：μmol·h^-1·g^-1FW(FW指樣品鮮重)。

反應(yīng)體系(700μL)：溶劑為80mM Mes緩沖液(pH 5.5)；含5mM氟化鈉，100mM蔗糖，5mM UDP，500μL粗酶液。

對照反應(yīng)體系(700μL)：溶劑為80mM Mes緩沖液(pH 5.5)；含5mM氟化鈉，100mM蔗糖，500μL粗酶液。

以下實施例中酸性轉(zhuǎn)化酶活性或堿性轉(zhuǎn)化酶活性的檢測方法為：配制反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系37℃，水浴60min；向反應(yīng)體系中加入1mL 3，5-二硝基水楊酸溶液終止反應(yīng)；將反應(yīng)體系100℃煮沸5min后流水迅速冷卻(若有沉淀則4000rpm離心10min取上清)，測定OD_520nm值。

酸性轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)體系：0.6ml0.1mol/L乙酸乙-酸鈉(pH4.8)，0.2ml0.1mol/L蔗糖，0.2ml粗酶液。

酸性轉(zhuǎn)化酶對照反應(yīng)體系：0.6ml0.1mol/L乙酸乙-酸鈉(pH4.8)，0.2ml蒸餾水，0.2ml粗酶液。

堿性轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)體系：0.6ml0.1mol/L KH₂PO₄-0.1mol/L檸檬酸鈉(pH 7.2)，0.2ml0.1mol/L蔗糖，0.2ml粗酶液。

堿性轉(zhuǎn)化酶對照反應(yīng)體系：0.6ml0.1mol/L KH₂PO₄-0.1mol/L檸檬酸鈉(pH 7.2)，0.2ml蒸餾水，0.2ml粗酶液。

根據(jù)還原糖(葡萄糖)標準曲線計算其生成還原糖的量和酶活性。酶活力單位為：μmol·h^-1·g^-1FW(FW指樣品鮮重)。

實施例1、蔗糖合成酶蛋白及其編碼基因的獲得

對各品種黃瓜基因組進行序列分析、區(qū)段截取和功能驗證，從新泰密刺黃瓜中發(fā)現(xiàn)一種蔗糖合成酶蛋白，將其命名為CsSUS4蛋白，如序列表的序列1所示。將編碼CsSUS4蛋白的基因命名CsSUS4基因，如序列表的序列2所示。

實施例2、黃瓜不同組織部位不同時期CsSUS4基因表達量及酶活性分析

1、分別取新泰密刺黃瓜如下時期的如下材料：

空間表達取樣：同一黃瓜植株上的根(R)、莖(S)、成熟葉(ML)、幼葉(YL)、雄花(FF)和雌花(MF)。

時間表達取樣：花前兩天果實(-2DAF)、開花當(dāng)天果實(0DAF)、花后三天果實(3DAF)、花后六天果實(6DAF)和花后九天果實(商品成熟果，9DAF)。

以上每份樣品均取3個生物學(xué)重復(fù)。

提取上述材料的總RNA，并合成第一鏈cDNA，采用qRT-PCR的方法檢測CsSUS4基因的表達情況(以TUA基因為內(nèi)參基因)，采用引物FP1和引物RP1組成的引物對檢測CsSUS4基因的表達，采用引物FP2和引物RP2組成的引物對檢測TUA基因的表達。

FP1：5’-CATTTTTCTTGTCAATTTACTGCTG-3’；

RP1：5’-GCCCGACACGAAACGAC-3’；

FP2：5’-ACGCTGTTGGTGGTGGTAC-3’；

RP2：5’-GAGAGGGGTAAACAGTGAATC-3’。

2、分別取新泰密刺黃瓜如下時期的如下材料：花前兩天果實(-2DAF)、開花當(dāng)天果實(0DAF)、花后三天果實(3DAF)、花后六天果實(6DAF)和花后九天果實(商品成熟果，9DAF)。分別檢測上述材料中蔗糖合成酶活性、酸性轉(zhuǎn)化酶活性和堿性轉(zhuǎn)化酶活性。

以上每份樣品均取3個生物學(xué)重復(fù)。

結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，CsSUS4基因在黃瓜的不同組織部位均有表達，其中在庫器官中表達較高，包括雄花、雌花、根和果實。而且CsSUS4基因的表達量隨著果實的發(fā)育逐漸升高，蔗糖合成酶活性和堿性轉(zhuǎn)化酶活性也隨果實發(fā)育不斷升高，酸性轉(zhuǎn)化酶的活性保持不變。

實施例3、轉(zhuǎn)基因植株的獲得

一、過表達載體的構(gòu)建

1、提取新泰密刺黃瓜的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用SS4F和SA4R組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產(chǎn)物。

SS4F：5’-GCTCTAGAATGGCTTCTTTGGTGGTAAATCATCATAACGGT-3’；

SA4R：5’-TCCCCCGGGTTACTTTTGAATCCGAGATTGGGTGCGCTT-3’。

SS4F和SA4R中，下劃線分別標注XbaI和SmaI酶切位點。

2、用限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI雙酶切步驟1的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

3、用限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI雙酶切載體pBI 121，回收約14750bp的載體骨架。

4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到過表達載體pBI 121-CsSUS4。根據(jù)測序結(jié)果，對過表達載體pBI 121-CsSUS4進行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pBI 121的XbaI和SmaI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列2所示的DNA分子。過表達載體pBI 121-CsSUS4部分原件示意圖如圖4A所示。

二、干擾載體的構(gòu)建

1、提取新泰密刺黃瓜的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用+S4iF和+S4iR組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產(chǎn)物。

+S4iF：5’-AGGCGCGCCTCTTTGGTGGTAAATCATCATAACG-3’；

+S4iR：5’-GCATTTAAATATATTCCCAACATCCTGGTTCTG-3’。

+S4iF和+S4iF中，下劃線分別標注AscI和SwaI酶切位點。

2、用限制性內(nèi)切酶AscI和SwaI雙酶切步驟1的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

3、用限制性內(nèi)切酶AscI和SwaI雙酶切載體pFGC1008，回收約10907bp的載體骨架。

4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組載體pFGC1008-RNAi-1。根據(jù)測序結(jié)果，對重組載體pFGC1008-RNAi-1進行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pFGC1008的AscI和SwaI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列3所示的DNA分子。

5、提取新泰密刺黃瓜的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用-S4iF和-S4iR組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產(chǎn)物。

-S4iF：5’-GACTAGTTCTTTGGTGGTAAATCATCATAACG-3’；

-S4iR：5’-CGGGATCCATATTCCCAACATCCTGGTTCTG-3’。

-S4iF和-S4iF中，下劃線分別標注SpeI和BamHI酶切位點。

6、用限制性內(nèi)切酶SpeI和BamHI雙酶切步驟5的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

7、用限制性內(nèi)切酶SpeI和BamHI步驟4得到的重組載體pFGC1008-RNAi-1，回收約11190bp的載體骨架。

8、將步驟6的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到干擾載體pFGC1008-RNAi-CsSUS4。根據(jù)測序結(jié)果，對干擾載體pFGC1008-RNAi-CsSUS4進行結(jié)構(gòu)描述如下：將重組載體pFGC1008的AscI和SpeI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列4所示的DNA分子。干擾載體pFGC1008-RNAi-CsSUS4部分原件示意圖如圖4A所示。

三、過表達轉(zhuǎn)基因植株的獲得

1、將步驟一得到的過表達載體pBI 121-CsSUS4導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌。

2、取步驟1得到的重組農(nóng)桿菌，接種至含有25μg/ml利福平和100μg/ml卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，120rpm、28℃培養(yǎng)至菌液OD_600nm達到0.6-0.8；將菌液5000rpm離心5min收集菌體沉淀，將菌體沉淀用1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌2次后，重新懸浮于1/2MS液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液OD_600nm為0.2。

3、取新泰密刺黃瓜種子，播種于MS固體培養(yǎng)基中28℃恒溫暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)2天后進行后續(xù)實驗。

4、取步驟3萌發(fā)2天后的黃瓜幼嫩子葉，去除生長點后將每片子葉均勻分成2塊，只保留靠近生長點一半的部分。

5、將步驟4處理后的黃瓜子葉浸沒在步驟2得到的農(nóng)桿菌菌液中侵染15分鐘，然后用滅菌的濾紙吸干多余菌液，將黃瓜子葉接種至MS分化培養(yǎng)基中，黑暗條件28℃培養(yǎng)2天后收獲外植體。

6、將步驟5得到的外植體接種至含有50mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的MS分化培養(yǎng)基上，25℃、2000LX光照強度(14h光照/10h黑暗)培養(yǎng)，待抗性芽長至1cm時，將其切下移入含有100mg/L卡那霉素和200mg/L羧芐青霉素的MS固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，獲得T₀代過表達轉(zhuǎn)基因植株，待植株根系發(fā)育好后，移入盛有無菌土的花盆中，溫室常規(guī)管理。T₀代植株自交，得到T₁代植株。T₁代植株自交，得到T₂代植株。

7、取步驟6得到的若干轉(zhuǎn)基因株系的T₂代植株進行鑒定。取待測植株苗期葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用引物35S2-F和35S2-R進行PCR鑒定。

35S2-F：5’-TGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTC-3’；

35S2-R：5’-CCATCTTTGGGACCACTGTCGGCA-3’。

如果對于某一T₀代植株，其抽樣檢測的T₂代植株的PCR鑒定結(jié)果均為陽性，該T₀代植株及其自交后代為一個純合的過表達轉(zhuǎn)基因株系。

設(shè)置采用新泰密刺黃瓜(野生型)cDNA為模板的陰性對照。

設(shè)置采用過表達載體pBI 121-CsSUS4 DNA為模板的陽性對照。

鑒定結(jié)果如圖1所示。

四、干擾轉(zhuǎn)基因植株的獲得

采用步驟二得到干擾載體pFGC 1008-RNAi-CsSUS4代替過表達載體pBI 121-CsSUS4，按照步驟三進行操作，得到T₀代干擾轉(zhuǎn)基因植株，待植株根系發(fā)育好后，移入盛有無菌土的花盆中，溫室常規(guī)管理。T₀代植株自交，得到T₁代植株。T₁代植株自交，得到T₂代植株。采用步驟三中的方法對干擾轉(zhuǎn)基因株系的T₂代植株進行鑒定。

設(shè)置采用新泰密刺黃瓜(野生型)cDNA為模板的陰性對照。

設(shè)置采用干擾載體pFGC1008-RNAi-CsSUS4 DNA為模板的陽性對照。

鑒定結(jié)果如圖2所示。

五、轉(zhuǎn)空載體植株的獲得

1、采用載體pBI 121代替過表達載體pBI 121-CsSUS4，按照步驟三進行操作，得到過表達轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏仓旮蛋l(fā)育好后，移入盛有無菌土的花盆中，溫室常規(guī)管理。

2、采用載體pFGC1008代替過表達載體pBI 121-CsSUS4，按照步驟三進行操作，得到干擾轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?，待植株根系發(fā)育好后，移入盛有無菌土的花盆中，溫室常規(guī)管理。

實施例4、轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察

待測植株為：新泰密刺黃瓜(WT)、實施例3構(gòu)建的過表達轉(zhuǎn)基因株系(OE6-10和OE17-2)的T₂代植株、干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)的T₂代植株、過表達轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档腡₂代植株和干擾轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档腡₂代植株。

1、取待測植株統(tǒng)一進行日常田間管理。去掉根瓜，在第二個瓜開花當(dāng)天進行掛牌，取開花后生長到9天的瓜，進行單果重、單果長度及單果粗度的統(tǒng)計，并采用實施例2中的方法檢測果實中的CsSUS4基因的表達情況，并檢測果實蔗糖合成酶活性。

結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，與野生型新泰密刺黃瓜(WT)相比，CsSUS4基因的相對表達量在過表達轉(zhuǎn)基因株系(OE6-10和OE17-2)果實中上調(diào)、在干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)果實中下調(diào)(圖4B)；與野生型新泰密刺黃瓜相比，蔗糖合成酶的活性在干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)果實中上調(diào)、在干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)果實中下調(diào)(圖4C)；干擾轉(zhuǎn)基因株系(CsSUS4-Ri)的果實明顯小于野生型；而過表達轉(zhuǎn)基因株系(CsSUS4-OE)果實明顯大于野生型(圖4D)；過表達轉(zhuǎn)基因株系(OE6-10和OE17-2)果實與野生型相比，無論果實長度、粗度和重量顯著增加，干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)果實與野生型株系相比，無論果實長度、粗度和重量顯著減小(圖4E、F、G)。過表達轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰透蓴_轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑慕y(tǒng)計結(jié)果與野生型無顯著差異。

2、取待測植株統(tǒng)一進行日常田間管理。在雄花盛花期統(tǒng)計雄花的表型，每個株系至少統(tǒng)計50朵雄花的重量，分別統(tǒng)計各株系5瓣花、6瓣花、7瓣花和8瓣花的平均單花重量，分別統(tǒng)計各株系5瓣花、6瓣花、7瓣花和8瓣花所占的數(shù)量比例，檢測雄花中蔗糖合成酶活性。

結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，過表達轉(zhuǎn)基因株系(OE6-10和OE17-2)雄花中蔗糖合成酶活性比野生型(WT)高；干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)雄花中蔗糖合成酶活性比野生型低(圖5A)；與野生型雄花相比，過表達轉(zhuǎn)基因株系(OE6-10和OE17-2)雄花明顯大而干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)雄花明顯小(圖5B)；過表達轉(zhuǎn)基因株系(OE6-10和OE17-2)、干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)和野生型中5瓣花、6瓣花、7瓣花和8瓣花的平均單花重量有顯著差異(圖5C)；過表達轉(zhuǎn)基因株系(OE6-10和OE17-2)中出現(xiàn)7瓣花和8瓣花的比例比野生型的高，干擾轉(zhuǎn)基因株系(Ri54-12和Ri37-5)中出現(xiàn)7瓣花和8瓣花的比例與野生型相當(dāng)(圖5D)。過表達轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰透蓴_轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑慕y(tǒng)計結(jié)果與野生型無顯著差異。

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 蔗糖合成酶在調(diào)控植物果實發(fā)育中的應(yīng)用

<160> 4

<210> 1

<211> 834

<212> PRT

<213> 黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 1

Met Ala Ser Leu Val Val Asn His His Asn Gly Glu Ser Ile Gly Asp

1 5 10 15

Gly Ile Val Glu Ala Leu Lys Gln Asn His Asn Tyr Met Lys Arg Cys

20 25 30

Phe Gly Lys Phe Val Glu Lys Gly Asn Arg Ser Leu Lys Lys Lys Glu

35 40 45

Leu Met Glu Glu Met Glu Leu Val Ile Asp Asp Lys Ile Glu Arg Asn

50 55 60

Arg Val Met Glu Gly Val Leu Gly His Met Leu Thr Ser Thr Gln Val

65 70 75 80

Ala Ile Val Ile Pro Pro Tyr Val Ala Phe Ala Ile Arg Pro Glu Pro

85 90 95

Gly Cys Trp Glu Tyr Val Lys Val Ser Ser Leu Asp Leu Ser Leu Gln

100 105 110

Ser Leu Thr Ser Thr Glu Phe Leu Lys Leu Lys Glu Met Ile Tyr Asp

115 120 125

Glu Glu Trp Ala Asn Asp Glu Asn Ala Leu Glu Val Asp Phe Gly Ala

130 135 140

Ile Glu Phe Thr Thr Pro Arg Leu Ser Leu Pro Ser Ser Ile Gly Asp

145 150 155 160

Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Lys Phe Leu Thr Ser Lys Leu Ser Gly Lys

165 170 175

Ser Glu Asn Leu Gln Pro Leu Val Asp Tyr Leu Leu Ser Leu Asp Tyr

180 185 190

Gln Gly Glu Lys Leu Met Ile Asn Glu Thr Leu Ser Thr Ala Ser Lys

195 200 205

Leu Gln Met Thr Leu Ile Leu Ala Asp Ile Phe Leu Ser Val Leu Pro

210 215 220

Pro Asp Thr Pro Tyr Asp Asp Phe His Leu Lys Phe Lys Gln Trp Gly

225 230 235 240

Phe Glu Arg Gly Trp Gly Asp Cys Ala Gly Arg Val Lys Glu Thr Ile

245 250 255

Arg Cys Leu Ser Glu Ile Phe Gln Ala Tyr Asp Pro Ile Gln Met Glu

260 265 270

Lys Phe Phe Ser Arg Leu Pro Thr Ile Phe Asn Val Val Ile Leu Ser

275 280 285

Pro His Gly Tyr Phe Gly Gln Ala Gly Val Leu Gly Leu Pro Asp Thr

290 295 300

Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Lys Ala Met Glu Glu

305 310 315 320

Glu Leu Leu Leu Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Phe Lys Pro Gln

325 330 335

Ile Ile Ile Ile Thr Arg Leu Ile Pro Asp Ala Lys Gly Thr Lys Cys

340 345 350

Asn Gln Glu Ile Glu Pro Val Ile Gly Thr Thr Tyr Ser Lys Ile Val

355 360 365

Arg Val Pro Phe Lys Thr Glu Asn Gly Thr Leu His Arg Trp Val Ser

370 375 380

Arg Phe Asp Ile Tyr Pro Tyr Leu Glu Lys Phe Ala Gln Asp Ala Ser

385 390 395 400

Asp Lys Ile Leu Glu Leu Met Glu Ala Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly

405 410 415

Asn Tyr Thr Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Met Ala Ser Arg Leu

420 425 430

Gly Val Thr Gln Gly Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr

435 440 445

Glu Asp Ser Asp Leu Lys Trp Lys Glu Leu Asp Ser Lys Tyr His Phe

450 455 460

Ser Cys Gln Phe Thr Ala Asp Ile Leu Ala Met Asn Ala Thr Asp Phe

465 470 475 480

Val Ile Ala Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Glu Lys Pro

485 490 495

Gly Gln Tyr Glu Ser His Glu Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Cys Arg

500 505 510

Phe Val Ser Gly Ile Asn Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Ala Ala

515 520 525

Pro Gly Ala Asp Gln Ser Val Tyr Phe Pro Tyr Thr Thr Lys Glu Leu

530 535 540

Arg Phe Ala Ser Phe Gln Pro Ala Ile Glu Glu Leu Leu Phe Ser Lys

545 550 555 560

Val Glu Asn Asp Glu His Ile Gly Tyr Leu Ala Asp Arg Lys Lys Pro

565 570 575

Ile Ile Phe Ser Met Ala Arg Leu Asp Val Val Lys Asn Ile Thr Gly

580 585 590

Leu Val Glu Trp Phe Gly Lys Asn Glu Lys Leu Arg Asn Leu Val Asn

595 600 605

Leu Val Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Pro Ser Lys Ser Lys Asp Arg

610 615 620

Glu Glu Met Ala Glu Ile Arg Lys Met His Glu Leu Ile Asp Lys Tyr

625 630 635 640

Gln Leu Lys Gly Gln Ile Arg Trp Ile Ala Ala Gln Thr Asp Arg Arg

645 650 655

Arg Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Cys Ile Ala Asp Thr Lys Gly Ala Phe

660 665 670

Val Gln Pro Ala Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala

675 680 685

Met Asn Cys Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Asn Gln Gly Gly Pro Ala

690 695 700

Glu Ile Ile Val Asp Gly Val Ser Gly Phe Gln Ile Asp Pro Asn Asn

705 710 715 720

Gly Thr Glu Ser Ser Gln Lys Ile Ala Asn Phe Phe Glu Lys Cys Lys

725 730 735

Asn Asp Pro Thr Tyr Trp Asn Glu Ile Ser Asn His Gly Leu Gln Arg

740 745 750

Ile Asn Glu Cys Tyr Thr Trp Lys Ile Tyr Ala Lys Lys Val Leu Asn

755 760 765

Met Gly Ser Thr Tyr Ser Phe Trp Lys Gln Val Asn Lys Asn Gln Lys

770 775 780

Gln Ala Lys Asp Arg Tyr Ile Gln Met Phe Tyr Asn Leu Leu Phe Lys

785 790 795 800

Asn Leu Val Lys Asn Val Pro Ile Val Val His Glu Asp Ser His Pro

805 810 815

Glu Asn Pro Arg Leu Pro Gln Val Ser Lys Arg Thr Gln Ser Arg Ile

820 825 830

Gln Lys

<210> 2

<211> 2505

<212> DNA

<213> 黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 2

atggcttctt tggtggtaaa tcatcataac ggtgagtcga ttggtgatgg aattgtagag 60

gcattgaagc aaaaccataa ttatatgaag agatgctttg gtaagtttgt agagaaaggg 120

aataggagct tgaagaagaa ggaattaatg gaggaaatgg agcttgttat agatgataag 180

atagaaagga atagggttat ggagggtgtc cttggtcata tgttgacttc aactcaggtg 240

gcgattgtga ttccaccata tgttgcattt gcaataagac cagaaccagg atgttgggaa 300

tatgttaaag ttagttctct tgatctttca ctccaatctc tcacttcaac tgaatttctc 360

aaattgaagg agatgattta cgacgaagaa tgggcaaatg atgaaaatgc tttggaagtg 420

gatttcggag caattgaatt tacaactcct cggttaagcc ttccatcttc aattggagat 480

ggacttagtt atactacaaa gtttctcacc tcaaagctga gtgggaagtc ggagaattta 540

caacctcttg tagattactt gttgtccctt gattatcaag gagagaaact tatgatcaat 600

gaaactctaa gcacagcttc caaactccaa atgacattaa ttcttgctga tattttcctc 660

tctgttcttc ctccagacac cccatatgat gacttccatc tcaaattcaa gcaatgggga 720

tttgagagag gatggggaga ttgtgctgga agagtaaagg aaacaataag atgtttatct 780

gaaatattcc aagcctatga tccaatccaa atggagaagt tcttcagcag gcttcctact 840

attttcaatg ttgtcatttt gtctcctcat ggatactttg gccaagctgg tgttcttggt 900

ttgcccgaca ccggaggtca ggttgtgtac atactcgatc aagttaaagc tatggaagaa 960

gaacttctgc tcagaattaa gcaacaaggc ctcaatttca agcctcaaat tattattatt 1020

acaagactta ttccagatgc gaaggggact aagtgcaacc aagaaataga acctgtcatt 1080

gggactactt actccaagat tgttagggtg cccttcaaga ctgaaaatgg cacccttcat 1140

cgttgggttt ctcgtttcga catttatcct tatctcgaga aatttgcaca agatgcgagc 1200

gacaaaatat tagagctcat ggaagcaaag ccagatctaa tcattggaaa ctacacagat 1260

ggaaatcttg tggcatctct catggccagc agattaggag taacccaagg aactattgca 1320

catgccttgg agaagacaaa gtatgaagat tcagatctta aatggaagga attggactcc 1380

aagtaccatt tttcttgtca atttactgct gatattcttg ctatgaatgc gactgatttt 1440

gtcatcgcaa gcactttcca agagattgca ggaagcaaag aaaagccagg ccaatatgaa 1500

agccacgagg catttacgct tccaggactg tgtcgtttcg tgtcgggcat caatgtgttt 1560

gatcctaagt tcaacattgc agcaccaggg gctgatcagt ctgtctattt tccttacacg 1620

accaaagaac ttcgatttgc atcgtttcaa cctgccattg aagaacttct ttttagcaaa 1680

gttgagaacg atgagcatat aggatatctg gccgatagga aaaagccgat catcttttca 1740

atggcacggc ttgatgttgt caagaacatt accgggttgg tcgaatggtt tgggaagaat 1800

gagaagctga gaaatttggt gaatcttgtt gtggttggag gattttttga tccttccaaa 1860

tcaaaggaca gagaagaaat ggcagagata agaaagatgc atgaattaat tgacaaatac 1920

caactcaaag gtcagatcag gtggatagca gcacagactg atcgccgtcg taatggagaa 1980

ctctaccgct gcattgctga cacaaaagga gcctttgtgc agcctgctct ctatgaagct 2040

tttggtctca cagtcattga ggcaatgaat tgtggtctac caacctttgc tacgaaccaa 2100

gggggtccag ctgagatcat tgttgatggg gtctctggct tccaaattga tcccaacaat 2160

ggcactgaat caagccaaaa gattgctaac ttttttgaga aatgcaagaa tgatccaacc 2220

tactggaacg aaatttcgaa tcacggtctt caacgtatca atgaatgtta cacatggaaa 2280

atctatgcaa aaaaggtgct aaatatggga agcacttaca gtttttggaa gcaagtgaac 2340

aaaaaccaaa agcaggcaaa ggacagatac atccaaatgt tctacaatct actttttaag 2400

aacttggtga aaaacgtgcc aatcgtggtc cacgaagatt cacatccaga aaatccacgg 2460

ttaccacaag tctcgaagcg cacccaatct cggattcaaa agtaa 2505

<210> 3

<211> 297

<212> DNA

<213> 黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 3

tctttggtgg taaatcatca taacggtgag tcgattggtg atggaattgt agaggcattg 60

aagcaaaacc ataattatat gaagagatgc tttggtaagt ttgtagagaa agggaatagg 120

agcttgaaga agaaggaatt aatggaggaa atggagcttg ttatagatga taagatagaa 180

aggaataggg ttatggaggg tgtccttggt catatgttga cttcaactca ggtggcgatt 240

gtgattccac catatgttgc atttgcaata agaccagaac caggatgttg ggaatat 297

<210> 4

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tctttggtgg taaatcatca taacggtgag tcgattggtg atggaattgt agaggcattg 60

aagcaaaacc ataattatat gaagagatgc tttggtaagt ttgtagagaa agggaatagg 120

agcttgaaga agaaggaatt aatggaggaa atggagcttg ttatagatga taagatagaa 180

aggaataggg ttatggaggg tgtccttggt catatgttga cttcaactca ggtggcgatt 240

gtgattccac catatgttgc atttgcaata agaccagaac caggatgttg ggaatatatt 300

taaatcccca gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa 360

cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga 420

ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg 480

tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc 540

gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac 600

gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga 660

tctctttgat ggggatccat attcccaaca tcctggttct ggtcttattg caaatgcaac 720

atatggtgga atcacaatcg ccacctgagt tgaagtcaac atatgaccaa ggacaccctc 780

cataacccta ttcctttcta tcttatcatc tataacaagc tccatttcct ccattaattc 840

cttcttcttc aagctcctat tccctttctc tacaaactta ccaaagcatc tcttcatata 900

attatggttt tgcttcaatg cctctacaat tccatcacca atcgactcac cgttatgatg 960

atttaccacc aaaga 975