專利名稱：：一種修飾體外合成rna的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及了一種修飾體外合成核糖核酸(RNA)的試劑盒和方法，屬于核酸研究
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：近年來，隨著對(duì)核糖核酸(RNA)結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)的深入，RNA領(lǐng)域的研究迅速發(fā)展、日新月異。RNA干擾現(xiàn)象(RNAi)、siRNA、microRNA以及piRNA等RNA相繼發(fā)現(xiàn)。深入研究這些RNA的結(jié)構(gòu)，分析RNA功能，對(duì)RNA合成和修飾提出了更高的要求。天然的非修飾RNA由于其酶不穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)非靶向性、低細(xì)胞穿透性限制了RNA的研究?；瘜W(xué)修飾RNA可以有效的提高RNA的穩(wěn)定性、靶向性以及細(xì)胞穿透性，已經(jīng)成為研究RNA領(lǐng)域的最重要方法之一。分子連接法是一種重要的RNA修飾方法，這種方法用化學(xué)修飾手段將RNA和各種活性分子通過共價(jià)鍵穩(wěn)定連接。這些活性分子包括抗體或抗體的活性部分、脂質(zhì)體等疏水分子、糖類分子、激素類分子、蛋白類分子、多肽類分子、以及放射性探針分子、熒光探針分子、光感探針分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或藥物分子等。己有研究表明，脂質(zhì)體等疏水分子同siRNA連接不影響RNA的活性，同時(shí)可以提高siRNA的酶穩(wěn)定性，并可以提高siRNA在活體內(nèi)的細(xì)胞穿透性；多肽以及糖類分子同siRNA連接，在不影響RNA的活性的同時(shí)提高RNA的細(xì)胞穿透性、以及細(xì)胞靶向性；放射性探針分子、熒光探針分子、光感探針分子同RNA連接，可達(dá)到修飾RNA目的，從而研究RNA功能。抗生素分子、酶抑制分子、藥物分子等也正在被開發(fā)同RNA連接，提高RNA的靶向性、穩(wěn)定性。己報(bào)道分子連接方法修飾RNA可歸為兩類，一類通過固相進(jìn)行分子連接，另一類在液相中進(jìn)行分子連接。其中固相進(jìn)行分子連接可分為兩種連接方法，插入修飾亞磷酰胺核糖苷單體法和分步固相合成法。插入修飾亞磷酰胺核糖苷單體法，首先將待連接的活性分子修飾成核苷類似結(jié)構(gòu)分子或類核苷分子，經(jīng)過磷?；Ｗo(hù)后，直接通過核酸自動(dòng)合成儀插入到RNA鏈中。這種方法優(yōu)點(diǎn)在于連接反應(yīng)在固相上完成簡單、方便，很多活性分子的亞磷酰胺單體己經(jīng)商品化，可以直接使用，如圖l。這種方法的缺點(diǎn)在于連接分子在RNA的合成和脫保護(hù)處理過程中的酸、堿以及氧化條件下必須穩(wěn)定，否則會(huì)被分解。而大多數(shù)活性分子在酸、堿或氧化條件下都不穩(wěn)定。這就限制了這種方法的應(yīng)用。分步固相合成法是將RNA和待連接活性分子在同一固相上合成，一般先合成RNA然后合成活性分子，一般會(huì)引入一段鏈結(jié)構(gòu)將RNA同活性分子連接。分步固相合成法主要用于將多肽、以及糖類等復(fù)雜分子同RNA連接。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于合成產(chǎn)物易于純化分離，已被應(yīng)用于核酸活性分子連接化合物庫的合成。但是這種方法需要很特殊的合成設(shè)備，而且連接分子在整個(gè)合成過程中和脫保護(hù)基過程中要穩(wěn)定不能分解，在很多不穩(wěn)定分子(如多肽)連接時(shí)該法是十分麻煩的。至今為止，仍沒有一套用該法穩(wěn)定、高效連接RNA和活性分子體系被開發(fā)出來。液相中進(jìn)行分子連接首先分別合成RNA分子和活性分子，在合成過程中將活性反應(yīng)基團(tuán)引入RNA分子和活性分子。在合成后RNA分子同活性分子在液相中通過活性反應(yīng)基團(tuán)共價(jià)連接。應(yīng)用這種方法RNA分子和活性分子是分開合成的，避免了在合成RNA過程中活性分子的分解，也可以用常規(guī)的分析方法對(duì)活性分子和RNA分子表征分析。這種方法可應(yīng)用連接活性分子的范圍最廣、成本低、操作簡單、易于控制等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具前景的分子連接修飾RNA方法。液相分子連接法修飾RNA現(xiàn)在面臨的最大難題是連接反應(yīng)選擇。RNA分子不穩(wěn)定，去保護(hù)后的在酸性或堿性條件下進(jìn)行反應(yīng)都會(huì)分解，所以反應(yīng)條件一定要十分溫和，另外，連接產(chǎn)率要高(大于95%)保證RNA同活性分子充分結(jié)合。開發(fā)一種溫和條件下高產(chǎn)率的連接反應(yīng)，是改進(jìn)該法的關(guān)鍵！"點(diǎn)擊"化學(xué)的概念是2001年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Sharpless提出的，"點(diǎn)擊"反應(yīng)是在傳統(tǒng)的Huisgen三唑反應(yīng)基礎(chǔ)上，發(fā)展出一類在溫和條件下，高選擇性和高產(chǎn)率的化學(xué)反應(yīng)。傳統(tǒng)的Huisgen三唑反應(yīng)(如下表)是有機(jī)疊氮和炔基化合物在加熱條件下發(fā)生1，3-二偶極[3+2]環(huán)加成反應(yīng)，得到五元雜環(huán)[l,2，3]-三氮唑。Huisgen三唑反應(yīng)為鏈接兩個(gè)化合物提供了一種很好的手段，但該反應(yīng)條件通常都是通過加熱活化等條件完成。"點(diǎn)擊"反應(yīng)是亞銅離子催化下的Huisgen三唑反應(yīng)，由于亞銅離子的催化Huisgen三唑反應(yīng)活化能降低，使該反應(yīng)可以在常溫下水和多種有機(jī)溶劑中高產(chǎn)率完成。另外，"點(diǎn)擊"反應(yīng)僅得到1'4'位三氮唑產(chǎn)物，不同于加熱條件下得到1'5'位同1'4'位混和產(chǎn)物?，F(xiàn)"點(diǎn)擊"反應(yīng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組合化學(xué)合成，，并被認(rèn)為是"搭建起化學(xué)和生物學(xué)橋梁的杰出反應(yīng)"。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種以"點(diǎn)擊"反應(yīng)作為連接反應(yīng)的修飾體外合成RNA方法和試劑盒。技術(shù)方案如下一種修飾體外合成RNA的試劑盒，主要包括有(A)帶有l(wèi)，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的亞磷酰胺單體底物，或帶有l(wèi),3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)三磷酸苷底物；(B)帶有與l，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3—二偶極基團(tuán)的生物分子探針，所述亞磷酰胺單體底物或三磷酸苷底物與生物分子探針能通過l，3—二偶極基團(tuán)與對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)逬行"點(diǎn)擊"反應(yīng)。一種修飾體外合成RNA的方法，主要包括以下步驟-(1)在化學(xué)合成核糖核酸時(shí)，以帶有l(wèi)，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的亞磷酰胺單體或三磷酸核苷為底物，合成帶有l(wèi)，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核糖核酸；(2)然后在化學(xué)合成過程中或合成完畢后，步驟(l)中合成的核糖核酸與帶有與1,3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3—二偶極基團(tuán)的生物分子探針在亞銅離子化合物的催化劑催化下進(jìn)行"點(diǎn)擊"反應(yīng)，核酸被修飾。具體方法為1，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)底物在合成RNA的過程中插入RNA骨架中，在處理和純化RNA的過程中或純化后，在催化作用下插入了1，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核糖核酸和功能分子進(jìn)行"點(diǎn)擊"反應(yīng)，純化后得到修飾RNA。所述l，3—二偶極基團(tuán)優(yōu)選為氧化腈基、疊氮基、重氮甲基、硝酮基、腈胺基等等；親偶極基團(tuán)優(yōu)選為烯基、炔基。更優(yōu)選地，所述烯基為乙烯基、丁烯基等；所述炔基為乙炔基、丙炔基，環(huán)狀炔基等；所述生物分子探針可為任何已知的小分子或大分子，該已知的小分子或大分子包括抗體或抗體的活性部分、脂類和類脂分子、糖類分子、激素類分子、蛋白類分子、多肽類分子、以及放射性探針分子、熒光探針分子、光感探針分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或藥物分子。所述活性生物分子探針優(yōu)選為帶有疊氮基或炔基的吲哚類菁生物熒光探針或苯并吲哚類菁生物熒光探針。更優(yōu)選為，生物分子探針為u,r,r-四甲基-3-乙基-3'-疊氮基丙基-吲哚三甲川花菁或分子探針為l-乙基-l，-疊氮正己基-3，3，3，，3，-四甲基-6-磺酸基-口引哚五甲川花菁。所述溶劑優(yōu)選為乙醇、水、四氫呋喃、DMSO、乙腈、氨水、或四氫呋喃與水的混合物、或DMSO與水的混合物、或其中多種溶劑混合物。所述催化劑優(yōu)選為硫酸銅和抗壞血酸鈉、溴化亞銅、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu、Cu絲的一種或多種。所述催化劑穩(wěn)定劑優(yōu)選為TBTA(Tris[(l-benzyl-l/M,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine)，TCEP(Tri-(2-carboxyethyl)phosphine)中的一種或多種。由于"點(diǎn)擊"反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，本發(fā)明通過"點(diǎn)擊"反應(yīng)作為液相分子連接法修飾RNA的連接反應(yīng)，連接效率高，可應(yīng)用的活性分子廣，抗體或抗體的活性部分、脂質(zhì)體等疏水分子、糖類分子、激素類分子、蛋白類分子、多肽類分子、以及放射性探針分子、熒光探針分子、光感探針分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或藥物分子等都可以通過本發(fā)明方法同RNA連接。本發(fā)明方法修飾RNA避免了傳統(tǒng)分子連接方法在RNA合成或脫保護(hù)基過程中活性分子分解失活的缺點(diǎn)。另外，本發(fā)明方法成本低(是傳統(tǒng)亞磷酰胺連接法的七十分之一)、操作簡便(在RNA正常的合成過程中完成)，條件溫和(避免了傳統(tǒng)亞磷酰胺連接法無水操作)，修飾效果好(同傳統(tǒng)亞磷酰胺連接法修飾效果相同)，可連接的活性分子范圍廣(已知連接方法中可應(yīng)用活性分子最廣的方法)，而且不影響任何RNA的生物活性。圖1是已商品化的活性分子亞臨酰胺單體；圖2是Huisgen三唑反應(yīng)；圖3是含親偶極基團(tuán)嘧啶核苷類似物；圖4是含親偶極基團(tuán)嘌呤核苷類似物；圖5是1,3—二偶極基團(tuán)修飾嘧啶核苷；圖6是1，3—二偶極基團(tuán)修飾嘌呤核苷；圖7是修飾后RNA活性檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先開發(fā)了一類攜帶親偶極和1,3-二偶極基團(tuán)的核苷類似物，并合成這些類似物對(duì)應(yīng)的亞磷酰胺單體和三磷酸苷底物，用這些底物合成了攜帶親偶極或1,3-二偶極基團(tuán)的RNA;隨后，本發(fā)明合成了一系列親偶極或l，3-二偶極基團(tuán)的活性分子；最后，在合成RNA的過程中，以及RNA合成完畢后，把攜帶親偶極或l,3-二偶極基團(tuán)的RNA和對(duì)應(yīng)的攜帶l,3-二偶極或親偶極基團(tuán)的活性分子通過"點(diǎn)擊"反應(yīng)連接，純化后得到修飾RNA，并驗(yàn)證修飾RNA的生物活性。攜帶親偶極基團(tuán)核苷的合成本發(fā)明合成了如圖(3)(4)中結(jié)構(gòu)的親偶極基團(tuán)核苷類似物，5-乙炔基-2，-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2，-脫氧-5-(1,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2，-脫氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2，-脫氧-5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2，-脫氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2'-脫氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(l,7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮雜-2，脫氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮雜-2，脫氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1,7辛二炔)-7-氮雜-2'脫氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1,7辛二炔)-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QXA)、2，-脫氧-8-乙炔基-鳥嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鳥嘌呤核苷(YG)、2，-脫氧-8-(1，7辛二炔)-鳥嘌呤核苷(XTG)、8-(1,7辛二炔)-鳥嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮雜-2，脫氧-鳥嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮雜-鳥嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮雜-2'脫氧-鳥嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮雜-鳥嘌呤核苷(QYG)、7-(l,7辛二炔)-7-氮雜-2，脫氧-鳥嘌呤核苷(QXTG)、7-(l，7辛二炔)-7-氮雜-鳥嘌呤核苷(QXG)。合成方法是通過引入碘原子后引入各種炔基，合成路線類似，僅以2'-脫氧-5-(l,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、2'-脫氧-5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、8-(1,7辛二炔)-鳥嘌呤核苷(XG)、5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)和5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)合成為例。2'-脫氧-5-(l,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)合成5-碘-2'-脫氧尿嘧啶核苷(1.50g,4.26mmo1)PdC12(PPh3)2(0.299g，0.426mmol)碘化亞銅(0.161g,0.852mmol)溶于3mlDMF,加入(3.9ml，21.3mmo1)N,N-二異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。l陽三甲硅基-l,6二辛炔(0.908g,5.54mmol)溶于lmlDMF，緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^夜。蒸干反應(yīng)溶劑后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分別用100ml水、飽和NaCl溶液洗，硫酸鎂干燥有機(jī)層后旋干，直接用于下一步反應(yīng)。將得到的固體溶于2ml水，加入2當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌1小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離，梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0—10%),得到產(chǎn)物0.89g(63%)。i普?qǐng)D數(shù)據(jù):1HNMR(d6-DMS0，400MHz)S1.57(m，4H),2.11(m,2H),2.19(m，2H),2.38(m,2H),2.75(m,1H),3.55-3.65(m,2H),3.78(dd,1H)，4.23(m,1H),5.06(t,1H),5.22(b，1H),6.10(t，1H),8.10(s,1H),11.3(bs,1H)。2，-脫氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)合成5-碘-2'-脫氧尿嘧啶核苷(0.6g,1.7mmo1)Pd(PPh3)4(196mg，0.17mmol)碘化亞銅65.5mg,0.34mmol)溶于3mlDMF，加入lmlN,N-二異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。1-三甲硅基-1,6二辛炔(1.8g，17mmol)溶于lmlDMF，緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^夜。蒸干反應(yīng)溶劑后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分別用100ml水、飽和NaCl溶液洗，硫酸鎂干燥有機(jī)層后旋干，直接用于下一步反應(yīng)。將得到的固體溶于2ml水，加入2當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌l小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離，梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0—10%)，得到產(chǎn)物0.42g(75%)。譜圖數(shù)據(jù)譜圖數(shù)據(jù)1HNMR(d6-DMSO，400MHz):1.54—1.62(m,4H,2CH2)，2.0—2.15(m，3H,HR-C(2')，CH2),2.22-2.44(m,3H，H_-C(2')，CH2),2.76(s,1H,C三CH),3.54~3.62(m,2H墨C(5'))，3.79(m,H-C(4'))，4.20(m,H-C(3')),5.04(t,OH-C(5')),5.20(d，OH-C(3'))，6.12(t,H-C(l')),6.71(s,NH),7.67(s,麗)，8.07(s,H-C(6)).5-(l，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)將2，3，5，-氧-三乙?；蜍?14g,37.81mmol，leq)溶于230mlCH3CN中，向反應(yīng)液中加入12(4.8g,18.91mmol,0.5eq)及Ce(NH4)2(NO3)6(10.36g,18.9mmol,0.5eq),加熱至U80。C恒溫?cái)嚢鑜h。旋蒸除去溶劑，殘余物用300mlCH2C12溶解，有機(jī)層分別用200mlH2O，200ml5%NaHS03水溶液，200ml飽和食鹽水洗滌。水相用200mlCH2C12返萃，合并有機(jī)層。旋干溶劑，過柱分離，洗脫劑比例PE:EAl:l，得白色固體產(chǎn)物5-碘-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?6.9g，產(chǎn)率90%。將5-碘-2，3，5'-氧-三乙?；蜍?5g,10mmol，leq)溶于100mlCH2C12:(C2H5)3N1:1混合溶液中，N2保護(hù)下向其中加入(PPh3)2PdC12(0.53g,0.757mmol,0.075eq)，Cul(0.29g,1.5mmol,0.15eq)，1-三甲硅基-1,6二辛炔(3.12g，6.7ml,21.17mmol,2.1eq)，N2保護(hù)下常溫?cái)嚢?0h，旋蒸除去溶劑，殘余物用100mlCH2C12溶解，有機(jī)層用2x200ml10%EDTA二鈉水溶液，200ml飽和食鹽水溶液洗滌，水層用200mlCH2C12返萃，合并有機(jī)層，旋干溶劑，過柱分離，洗脫劑比例PE:EA3:11:1，得淡黃色泡沫5-(三甲基硅1,7辛二炔基)-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?g，產(chǎn)率78.2%。將5-(三甲基硅1,7辛二炔基)-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?12g,21.22mmol,leq)溶于200mlCH3OH中，向其中加入28。/。NH3'H2O(35ml,10eq)，常溫?cái)嚢?h，向反應(yīng)液中加入K2C03(2.22g,16mmol，1.5eq)，常溫?cái)嚢柽^夜。旋蒸除去溶劑，殘余物用少CH30H:H201:1混合液溶解后過柱分離，洗脫劑比例CH2C12:CH30H7:11:1,得白色粉末狀固體產(chǎn)物4.5g，產(chǎn)率62%。1HNMR(d6-DMSO,400MHz)51.57(m,4H),2.11(m,2H),2.19(m,2H),2.38(m,2H),2.75(m，1H),3.55-3.65(m，2H)，3.78(dd，1H)，4.23(m，1H),5.06(t,1H),5.22(b,1H)，5.26(b,lH)，6.10(t，1H),8.10(s,1H)，11.3(bs,1H)。5-(l,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)5-碘-胞嘧啶核苷(3.1g,8.5mmo1),Pd(PPh3)4(980mg,0.85mmo1),碘化亞銅(327.5mg,0.34mmol)溶于30mlDMF，加入8mlN，N-二異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。1-三甲硅基-1，6二辛炔(9g,85mmol)溶于lmlDMF,緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^夜。蒸干反應(yīng)溶劑后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分別用100ml水、飽和NaCl溶液洗，硫酸鎂干燥有機(jī)層后旋千，直接用于下一步反應(yīng)。將得到的固體溶于2ml水，加入2當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌1小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離，梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0—10%)，得到產(chǎn)物4.1g(70X)。譜圖數(shù)據(jù)譜圖數(shù)據(jù)1HNMR(d6-DMSO,400MHz):1.54—1.62(m，4H,2CH2),2.0—2.15(m,3H，HR-C(2')，CH2)，2.22—2.44(m,2H,CH2)，2.76(s,1H，C三CH),3.54—3.62(m,2H-C(5'))，3.79(m,H-C(4'))，4.20(m,H-C(3')),5.04(t,OH隱C(5')),5.20(d，OH-C(3'))，5.26(d,OH-C(2'))，6.12(t,H-C(l')),6.71(s,NH),7.67(s,NH),8.07(s,H-C(6)).8-(1，7辛二炔)-鳥嘌呤核苷(XG)8-碘-鳥嘌呤核苷4.08g,(lOmmol),Pd(PPh3)4(l.lg，lmmol),碘化亞銅(0,28g,1.5腿ol)溶于100mlDMF，加入10mlN,N-二異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。1-三甲硅基-1，6二辛炔17.8g，100mmol)溶于15mlDMF，緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^夜。蒸干反應(yīng)溶劑后，混合物用500ml乙酸乙酯溶解，分別用200ml水、飽和NaCl溶液洗，硫酸鎂干燥有機(jī)層后旋干，直接用于下一步反應(yīng)。將得到的固體溶于20ml水，加入2當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌1小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離，梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0—10%)，得到產(chǎn)物2.1g(56X)。譜圖數(shù)據(jù)1HNMR(d6-DMS0，400MHz):1.54~1.62(m,4H),2.0—2.15(m,4H)，2.79(s,1H)，3.2—3.8(m,2H)，4-4.5(m,2H),4.8(d,1H)，5.1(t,1H),6.5(d,1H),8.5-9(b,lH).將5-碘-3，5，-氧-二乙?；?2，-脫氧尿苷(16g,36.52mmol,leq)溶于200mlCH2C12:(C2H5)3N1:1混合溶液中，N2保護(hù)下向其中加入(PPh3)2PdC12(1.59g，2.27mmol,0.075eq)，Cul(0.86g,4.52mmol，0.15eq)，三甲基硅基乙炔(6.24g，8.8ml,63.53mmol,2.1eq)，N2保護(hù)下常溫?cái)嚢?0h，旋蒸除去溶劑，殘余物用300mlCH2C12溶解，有機(jī)層用2x200ml10MEDTA二鈉水溶液，200ml飽和食鹽水溶液洗滌，水層用200mlCH2C12返萃，合并有機(jī)層，旋干溶劑，過柱分離，洗脫劑比例PE:EA3:11:1，得淡黃色泡沫11.65g，5-[(三甲基硅基)乙炔基]-3，5，-氧-二乙?；?2，-脫氧尿苷，產(chǎn)率78%。將5-[(三甲基硅基)乙炔基]-3，5，-氧-二乙?；?2，-脫氧尿苷(11g,26.93mmol,leq)溶于100mlCH3OH中，向其中加入28。/。NH3'H2O(15ml，10eq),常溫?cái)嚢?h，向反應(yīng)液中加入K2C03(4.44g,32.13mmol,1.5eq)，常溫?cái)嚢柽^夜。旋蒸除去溶劑，殘余物用少CH30H:H201:1混合液溶解后過柱分離，洗脫劑比例CH2C12:CH30H7:11:1,得白色粉末狀固體產(chǎn)物4.1g，產(chǎn)率64%。核磁數(shù)據(jù)1HNMRS2.10-2.14(m,2H,H-2，2"),3.54-3.64(m,2H,H-5，,5"),3.78-3.80(m，1H，H-4，)，4.23-4.25(m,1H,H-3'),5.14,5.24(tandd;1Hand1H;OH，s)，6.09(t，J=6.6Hz,1H,H陽l，),8.39(s,1H,H-61，11.65(s,1H，NH);5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)將5-碘-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷(15g,30.23mmol,leq)溶于200mlCH2C12:(C2H5)3N1:1混合溶液中，N2保護(hù)下向其中加入(PPh3)2PdC12(1.59g,2.27mmol,0.075eq)，Cul(0.86g,4.52mmol，0.15eq)，三甲基硅基乙炔(6.24g，8.8ml,63.53mmol,2.1eq)，N2保護(hù)下常溫?cái)嚢?0h，旋蒸除去溶劑，殘余物用300mlCH2C12溶解，有機(jī)層用2x200ml10%EDTA二鈉水溶液，200ml飽和食鹽水溶液洗滌，水層用200mlCH2C12返萃，合并有機(jī)層，旋干溶劑，過柱分離，洗脫劑比例PE:EA3:ll:l，得淡黃色泡沫5-[(三甲基硅基)乙炔基]-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?1.4g，產(chǎn)率81%。將5-[(三甲基硅基)乙炔基]-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?10g,21.44mmol,leq)溶于100mlCH3OH中，向其中加入28。/。NH3'H2O(15ml,10eq),常溫?cái)嚢?h，向反應(yīng)液中加入K2C03(4.44g,32.13mmol,1.5eq)，常溫?cái)嚢柽^夜。旋蒸除去溶劑，殘余物用少CH30H:H201:1混合液溶解后過柱分離，洗脫劑比例CH2C12:CH30H7:11:1,得白色粉末狀固體產(chǎn)物3.65g，產(chǎn)率67,53%。i普?qǐng)D數(shù)據(jù):1HNMR53.54-3.70(m，2H,H-5，,5"),3.85-3.87(m,1H,H-4，),3.96-3.99(m，1H,H-3，，4.01-4.05(m，lH,H-2')，5.07,5.26，5.42(d，t，andd，1H,1H,and1H,OH，s),5.72(d,J=4.6Hz，1H,H-l，)，8.48(s,1H，H-6),11.65(brs,1H,NH);攜帶1,3—二偶極基團(tuán)核苷的合成本發(fā)明合成了圖(5)(6)中含1,3—二偶極基團(tuán)核苷類似物，包括5-疊氮基-2'-脫氧尿嘧啶核苷(DTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5-疊氮基-2，-脫氧胞嘧啶核苷(DTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2，脫氧-8-疊氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8-疊氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2'脫氧-8-疊氮基-鳥嘌呤核苷(DTG)、8-疊氮基-鳥嘌呤核苷(DG)。其中1,3—二偶極基團(tuán)修飾嘌呤核苷按照巳有文獻(xiàn)合成。1,3—二偶極基團(tuán)修飾嘧啶核苷合成是首先合成氨基核苷通過重氮化反應(yīng)活化氨基，用疊氮基取代氨基，得到對(duì)應(yīng)的1,3—二偶極基團(tuán)修飾嘧啶核苷，以5-疊氮基-尿嘧啶核苷合成為例。5-疊氮基-尿嘧啶核苷合成將2.59g(10mmol)5-氨基-尿嘧啶核苷在冰浴中溶于30ml的1NHC1，加入10mmolNaNO2，攪拌2分鐘后加入20gNaN3，室溫?cái)嚢?小時(shí)后用氨水中和至中性，蒸干溶劑后，直接上柱,二氯甲垸甲醇10:1得到產(chǎn)物L(fēng)31g產(chǎn)率46%譜圖數(shù)據(jù)1HNMR(d6-DMSO，400MHz):3.54(m,4H),4.1~4,53(m，3H),4.8-5.1(m,3H),6.12(d,lH),6.71(s,1H),7.97(s,lH).實(shí)施例1:構(gòu)建修飾體外合成RNA的試劑盒(一)攜帶1，3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)亞磷酰胺單體合成本發(fā)明合成了一系列攜帶1,3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)亞磷酰胺單體，包括炔基甘油亞磷酰胺、炔基三甘醇亞磷酰胺以及圖(3)_(6)中核苷對(duì)應(yīng)的亞磷酰胺單體。這些單體合成都是通過對(duì)應(yīng)底物和2-氰乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺反應(yīng)得到，故僅以炔基甘油亞磷酰胺、炔基三甘醇亞磷酰胺、5-乙炔基尿苷亞磷酰胺合成為例。炔基甘油亞磷酰胺(2)合成0.5g(2.66mrno1)炔基三甘醇和0.75ml(5.31mrno1)二異丙胺溶于2ml無水二氯甲烷，加入0.94gG.98mmo1)2-氰乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺。室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入5ml水終止反應(yīng)。5ml二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，飽和NaCl洗3次，硫酸鈉干燥后旋干，柱層析，石油醚洗脫，得到產(chǎn)物0.98g(95%)。譜圖數(shù)據(jù)'HNMR(CD3C1,400MHz)S1.149-1.259(m，12H),2.3-2.8(m，3H)，3.4-3.7(m，12H),3.7-3.9(m,3H),4.1-4.2(s,2H)。炔基三甘醇亞磷酰胺(6)合成lg炔基甘油(3)溶于5ml甲醇，加入0.5ml濃鹽酸室溫?cái)嚢?小時(shí)。旋干反應(yīng)液，反應(yīng)混合物溶于10ml二氯甲烷，千燥旋干得到0.6g產(chǎn)物，直接下一步反應(yīng)。0.6g(4.61mmo1)化合物4溶于2ml無水吡啶，加入1.875g(5.53mmo1)4,4'-二甲氧基三苯基氯甲垸，室溫反應(yīng)l小時(shí)，旋干反應(yīng)液，溶于10ml二氯甲烷。10ml水洗二氯甲烷層3次，飽和NaCl洗三次，硫酸鈉干燥后旋干。柱層析，梯度洗脫，乙酸乙酯石油醚(0-50%)得產(chǎn)物1,53g(77%)。1.2g(2.77mmo1)化合物5和0.78tnl(5.55mmo1)二異丙胺溶于2ml無水二氯甲烷，加入0.985g(4.16mmo1)2-氰乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺。室溫?cái)嚢?小吋，加入5ml水終止反應(yīng)。5ml二氯甲垸萃取3次，合并有機(jī)相，飽和NaCl洗3次，硫酸鈉干燥后旋干，柱層析，石油醚洗脫，得到產(chǎn)物1.6g(91^)。譜圖數(shù)據(jù)'HNMR(CD3C1，400MHz)Sl-1.2(m，12H)，2.4國2.5(m,2H),2.6-2.7(t,1H),3.1-3.3(m,2H)，3.5-4(m,12H),4.1-4.3(m,3H)，6.75-6.85(t,4H),7.15-7.5(m，9H)。5-乙炔基尿苷亞磷酰胺(10)合成5-乙炔基尿嘧啶核苷(2.68g，lOmmol)溶于10ml吡啶，加入5.07g(15mmol)4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷，室溫反應(yīng)12小時(shí)。蒸干吡啶20ml水洗三次，Na2S04干燥后硅膠柱分離，石油醚乙酸乙酯2:1洗脫，得4.4g淡黃色固體，5'-0-4,4'-二甲氧基三苯基-5-乙炔基尿嘧啶核苷(8)，產(chǎn)率78%。4g(8)溶于10ml四氫呋喃，加入2ml吡啶，1.7g硝酸銀'1.5g叔丁基二甲基氯硅垸，室溫反應(yīng)5小時(shí)，加5ml水。20ml水洗三次，Na2S04干燥后硅膠柱分離，石油醚乙酸乙酯1:1洗脫得到5'-0-4,4'-二甲氧基三苯基-2，-0-叔丁基二甲基-5-乙炔基尿瞎啶核苷(9)2.98g，產(chǎn)率60%1.5g(9)溶于5ml二氯甲烷，加入lml二異丙基乙胺，L5ml2-氰乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫反應(yīng)2小時(shí)。力B2ml水。10ml水洗三次，Na2S04干燥后硅膠柱分離，石油醚乙酸乙酯6:l洗脫白色固體1.5g，產(chǎn)率78%。31PNMRS148.72;S149.09(二)攜帶1，3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)的三磷酸核苷合成本發(fā)明合成了圖(3)—(6)中核苷對(duì)應(yīng)的三磷酸核苷，合成方法類似都是通過三氯氧磷合成單磷酸后在和焦磷酸鹽反應(yīng)得到最后的三磷酸核苷，以5'-疊氮基尿嘧啶核苷三磷酸和5'-乙炔基尿嘧啶苷三磷酸合成為例。5'-疊氮基尿嘧啶核苷三磷酸四鈉鹽將5'-疊氮基尿嘧啶核苷(42.7mg，0.15mmo1)溶解在干燥的磷酸三甲酯溶液(5ml)中，加入質(zhì)子海綿(48.21mg，0.225mmoD。在冰浴下滴加三氯氧磷15^1。當(dāng)檢測(cè)當(dāng)?shù)椒磻?yīng)中間體最多時(shí)(約85%-90%)快速滴加入1.5ml0.5M雙三正丁胺焦磷酸鹽的無水DMF溶液和0.15ml三正丁基胺,并在0'C激烈攪拌。反應(yīng)1分鐘后加入0.2MEt3N.H2C03水溶液PH7.515ml。旋蒸后的剩余物經(jīng)過DEAE纖維素離子交換柱純化后(4。C下用Et3N.H2C03緩沖液梯度洗脫0—400Mm)得到5，-疊氮基尿嘧啶核苷三磷酸四鈉鹽。產(chǎn)率61%，31P-NMR(162MHz,CD3OD):ppm-8.9(d，1P),-9.8(d,1P)，-21.7(m,IP)5，-乙炔基尿嘧啶苷三磷酸四鈉鹽將5，-乙炔基尿苷(40.2mg,0.15mmo1)溶解在干燥的磷酸三甲酯溶液(5ml)中，加入質(zhì)子海綿(48.21mg，0.225mmo1)。在冰浴下滴加三氯氧磷15pl。當(dāng)檢測(cè)當(dāng)?shù)椒磻?yīng)中間體最多時(shí)約2-3小時(shí)(約85°/。-90%)，快速滴加入1.5ml0.5M雙三正丁胺焦磷酸鹽的無水DMF溶液和0.15ml三正丁基胺，并在0。C激烈攪拌。反應(yīng)l分鐘后加入0.2MEt3N.H2CO3水溶液PH7.515ml。旋蒸后的剩余物經(jīng)過DEAE纖維素離子交換柱純化后(4。C下用Et3N.H2C03緩沖液梯度洗脫0—400Mm)得到產(chǎn)物56°/。。31P-NMR(D20)0~6.28(d,1p),-10.48(d,1p),-21.23(t，1P);(三)攜帶親偶極基團(tuán)和1,3-二偶極基團(tuán)的生物探針分子合成本發(fā)明按照文獻(xiàn)方法合成了6-疊氮羧酸(11)、6-疊氮己胺(12)、6-疊氮己醇(13)炔基羧酸(14)并購買了丙炔胺。利用這些攜帶親偶極基團(tuán)和1，3-二偶極基團(tuán)的中間體和各種功能分子反應(yīng)，得到攜帶親偶極基團(tuán)和1,3-二偶極基團(tuán)的功能分子，以疊氮基三甘醇生物素的合成和攜帶親偶極基團(tuán)和1,3-二偶極基團(tuán)的肽合成為例。另外，本發(fā)明根據(jù)不同功能分子的結(jié)構(gòu)不同進(jìn)行了簡單的修飾得到攜帶親偶極基團(tuán)和1,3-二偶極基團(tuán)的功能分子，以疏水類功能分子疊氮基膽固醇、疊氮基熒光探針合成為例。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>疊氮基三甘醇生物素(16)合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>Reagents:(a)NHS,EDC，DMF,i%67%(b)TEA^N3(OCH2CH2)3NH2,93%lg(4.09rnrno1)生物素溶于10mlDMF，加入0.942g(8.19rnrno1)N-羥基琥珀酰亞胺，1.57g(8.19mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢柽^夜。蒸干溶劑將反應(yīng)物溶于二氯甲垸，水洗，產(chǎn)物析出。干燥后得產(chǎn)物1.02g(73%)。將lg(2.93mmol)產(chǎn)物直接溶于5mlDMF，加入1.531g(8.79mmol)疊氮三甘醇胺，攪拌過夜。蒸干反應(yīng)液，將反應(yīng)物混合物溶于10ml二氯甲烷，10ml水洗三次，飽和NaCl洗三次，干燥旋干后柱層析純化。得到產(chǎn)物0.93g(79%)。譜圖數(shù)據(jù)iHNMR(CD3Cl，400MHz)S1.34-1.47(m,2H),l,54-l,78(m,4H),2.15-2.13(t,2H),2,68-2.76(d,1H),2.84-2.92(m,1H),3.06-3.16(m，1H),3.34-3.44(m,4H)，3.52隱3.7(m，10H),4.28-4.31(m,1H),4.44-4.5(m,IH)。(四)攜帶親偶極基團(tuán)和l，3-二偶極基團(tuán)的多肽合成本發(fā)明將中間體(11)和(14)的羧基用N-羥基琥珀酰亞胺活化，用活化單體在多肽合成儀上既可完成用于"點(diǎn)擊"反應(yīng)的多肽合成，本發(fā)明用該法合成了攜帶親偶極基團(tuán)和1,3-二偶極基團(tuán)的R6Pen肽，TaT肽等多肽。疊氮基膽固醇(17)合成2g(2.97mmoD對(duì)甲苯磺?；罨哪懝檀既苡?0mlDMF，加入0.386g(5.94mmo1)疊氮鈉室溫?cái)嚢柽^夜。加入100ml二氯甲烷，100ml水洗二氯甲烷三次，100ml飽和氯化鈉溶液洗，硫酸鈉干燥后旋干，柱層析分離，乙酸乙酯石油醚(0—10%)洗脫，得產(chǎn)物1.2g(74.3%)。譜圖數(shù)據(jù)iHNMR(CD3Cl，400MHz)S0.67(s，3H),0.84-0.925(m,9H),0.993(s,3H)，1.1國1.6(m,24H),1.76-2.04(m,5H),2.15-2.25(t,1H),2.33隱2.41(d,1H),3.12-3.23(m,1H)，3.36-3.42(t,2H),3.6國3.7(m，10H),5.35(m,1H)。疊氮基熒光探針合成本發(fā)明合成了疊氮基和炔基吲哚類菁熒光探針，購買了BODIPY類熒光探針琥珀酰亞胺酯，AlexaFluor類熒光探針琥珀酰亞胺酯，以及FAM、FITC、羅丹明琥珀酰亞胺酯。用6-疊氮己胺和丙炔胺同購買的熒光探針琥珀酰亞胺酯反應(yīng)得到對(duì)應(yīng)的含1，3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)的熒光探針，并合成了生物素探針。吲哚菁類熒光探針如下，6-疊氮己胺合成和氨基同琥珀酰亞胺酯反應(yīng)按照文獻(xiàn)報(bào)道不加贅述。U，l，,r-四甲基-3-乙基-3，-疊氮基丙基』引哚三甲川花菁(Cy3)合成4.55g(lOmmol)1,1-甲基3-乙基-2-(P-苯胺)乙烯基-吲哚啉和4.20g(lO讓ol)1,1,2-三甲基-3-疊氮基丙基-吲哚啉于50mL吡啶和2mL乙酸酐中，加熱回流過夜。將溶劑蒸發(fā)后反應(yīng)合物溶于100ml二氯甲垸，100ml水洗二氯甲烷層三次，100ml飽和NaCl溶液洗二氯甲烷層，硫酸鈉干燥后旋干，柱層析。洗脫劑甲醇二氯甲垸(0-10%)的產(chǎn)物2.12g(36.8%)譜圖數(shù)據(jù)1HNMR(CDC13,400MHz)S0.98-1.02(t,3H),1.52-1.61(m,2H),1.89-1.96(m，2H),2,06(s,12H),2,81(s,3H),4.17-4.25(t,2H),7.25-7.53(m,4H),7.55-7.60(d,2H),7.62-7.68(d,2H),7.90-8.00(d,4H),8.08-8,15(d,2H),8.58-8.62(t,1H)。l-乙基-l'-疊氮正己基-3，3，3'，3'-四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁(Cy5)合成3.96g(10mmol)l-乙基-2-正苯胺基丁二烯基-3,3-二甲基-6-磺酸基吲哚，3.98g(10mmol)l-疊氮正己基-2，3，3-三甲基卩引哚碘鹽溶于25mL吡啶和25mL乙酸酐中，加熱回流過夜。將溶劑蒸發(fā)后反應(yīng)混合物溶于100ml二氯甲烷，100ml水洗二氯甲烷層三次，100ml飽和NaCl溶液洗二氯甲烷層，硫酸鈉干燥后旋干，柱層析。洗脫劑甲醇二氯甲垸(0-10%)的產(chǎn)物2.85g(35.9%)譜圖數(shù)據(jù)1HNMR(CDC13,400MHz)S1.24-1.39(m,5H)，1.53(s,12H),1.68(m,6H),3.25(t,2H)，3.36(t,2H),4.05(t，2H)，6.09(d,lH),6.29(d，1H),6.74(t,lH),6.94-7.35(m,7H),7.94(q,2H)。本發(fā)明購買了BODIPY630/650-X,SE、BODIPYFL,SE、BODIPY530/550,SE、BODIPY493/503,SE、BODIPY558/568,SE、BODIPY564/570,SE、BODIPY576/589,SE、BODIPY581/591,SE、BODIPYFL-X,SE、BODIPYTR-X,SE、BODIPYTMR-X，SE、BODIPYR6G,SE、BODIPYFLC5，SE、以及AlexaFluor350、405、430、488、500、514、532、555、546、568、594、610、633、647、660、680、700、750和FAM、FITC、羅丹明琥珀酰亞胺酯，用這些活化好的熒光探針和丙炔胺反應(yīng)，得到含親偶極基團(tuán)的熒光探針，用這些活化好的熒光探針和6-疊氮己胺反應(yīng)得到含1,3-二偶極基團(tuán)的熒光探針。(五)"點(diǎn)擊"反應(yīng)條件建立，具體如下反應(yīng)物1反應(yīng)物2產(chǎn)物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>0.025g(0.1mmoi;)0.054g(0.1mmoi;)C54H45BrP3Cu四氫呔喃0.025g(0.1mmo1)0.054g(0.1mmo1)C54H45BrP3Cu乙腈0.025g(0.1mmoi;)0.054g(0.1mmoi;)C54H45BrP3CuDMSO以上反應(yīng)條件下反應(yīng)過夜，旋干反應(yīng)液直接柱層析純化。譜圖數(shù)據(jù)^NMR(CDCl3,400MHz)50.75-2.5(m,44H),3.0陽3.2(s,1H),3.4-3.8(m，14H)，3.9-4.2(b,4H)，4.3-4.8(b,3H)，5.2-5.4(s,1H)，6.20-6.5(s,1H),8.1-9.5(b,3H)。(六)攜帶1，3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)的RNA合成本發(fā)明用以上合成的攜帶1,3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)亞磷酰胺單體和未修飾的單體，通過亞磷酰胺固相合成了3—100nt的攜帶1,3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)的RNA。并用TaKaRaT7RNAPolymemse試劑盒和我們合成的攜帶l，3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)的三磷酸底物合成了100nt以上的攜帶l,3—二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)的RNA。實(shí)施例2:RNA在合成不同階段時(shí)被修飾方法使用以下一種或多種方法都可以得到功能分子修飾的RNA。RNA合成中脫堿基保護(hù)過程中"點(diǎn)擊"反應(yīng)攜帶親偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用炔基亞磷酰胺(如炔基甘油亞磷酰胺、炔基三甘醇亞磷酰胺)為底物對(duì)RNA進(jìn)行修飾合成，引入炔基；攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針1,1,1，，1'-四甲基-3-乙基-3，-疊氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁；催化劑Cu(CH3CN)4PF6;溶劑乙醇氨水溶液；lOOnmol未脫堿基保護(hù)的攜帶親偶極基團(tuán)RNA溶于乙醇氨溶液中，加入200nmol攜帶1,3-二偶極基生物分子探針，100nmmol催化劑加熱過夜。旋干氨水后，按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA后處理方法處理，最終得到連接功能分子的RNA67nmo1。脫2'位保護(hù)基過程中"點(diǎn)擊"反應(yīng)攜帶親偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用炔基亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入炔基；攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針1,1，1，,1'-四甲基-3-乙基-3，-疊氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁催化劑C54H45BrP3Cu;溶劑四氫呋喃；lOOnmol未脫2'位保護(hù)基的攜帶親偶極基團(tuán)RNA溶于100^1四氫呋喃，加入lOOnmolC54H45BrP4Cu，200nrno1攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針，lOOOnmol四丁基氟化銨反應(yīng)4—12小時(shí)后，蒸干反應(yīng)液，按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA后處理方法處理，最終得到連接生物熒光探針的RNA52腦o1。RNA合成后"點(diǎn)擊"反應(yīng)攜帶親偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用炔基亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入炔基。或用TaKaRaT7RNAPolymerase試劑盒結(jié)合本發(fā)明已合成的攜帶親偶極基團(tuán)三磷酸苷合成攜帶炔基的RNA;攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針1，U',l，-四甲基-3-乙基-3，-疊氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁；.催化劑硫酸銅和抗壞血酸鈉；催化劑穩(wěn)定劑TBTA/TCEP;溶劑水；50nmo1攜帶親偶極基團(tuán)RNA溶于50nm水，加入lOOnmol硫酸銅、lOOnmol抗壞血酸鈉、100nmolTBTA，500nmo1攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針，反應(yīng)1一24小時(shí)后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化連接產(chǎn)物，得產(chǎn)物24nmo1。RNA合成中脫堿基保護(hù)過程中"點(diǎn)擊"反應(yīng)攜帶1，3-二偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用疊氮亞磷酰胺為底物，對(duì)RNA進(jìn)行修飾合成，引入疊氮基；攜帶親偶極基團(tuán)功能分子1，1，r,r-四甲基-3-乙基-3'-乙炔基丙基-苯并ll引哚二甲川花菁；催化劑Cu(CH3CN)4PF6;溶劑乙醇氨水溶液；lOOnmol未脫堿基保護(hù)的攜帶1，3-二偶極基團(tuán)RNA溶于乙醇氨溶液中，加入200nmo1攜帶親偶極基團(tuán)功能分子，100nmmol催化劑加熱過夜。旋干氨水后，按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA后處理方法處理，最終得到連接功能分子的RNA42nmo1。脫2'位保護(hù)基過程中"點(diǎn)擊"反應(yīng)攜帶1,3-二偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用疊氮亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入疊氮基。攜帶親偶極基團(tuán)功能分子u，r，r-四甲基-3-乙基3'-乙炔基丙基-苯并吲哚三甲川花菁催化劑C54H45BrP4Cu溶劑四氫呋喃lOOnmol未脫2'位保護(hù)基的攜帶13-二偶極基團(tuán)RNA溶于100^1四氫呋喃，加入lOOnmolC54H45BrP4Cu，200nrno1攜帶親偶極基團(tuán)功能分子，lOOOnmol四丁基氟化銨反應(yīng)4—12小時(shí)后，蒸干反應(yīng)液，按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA后處理方法處理，最終得到連接生物熒光探針的RNA36nmo1。RNA合成后"點(diǎn)擊"反應(yīng)攜帶1，3-二偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用疊氮亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入疊氮基?；蛴肨aKaRaT7RNAPolymerase試劑盒結(jié)合本發(fā)明已合成的攜帶1，3-二偶極基團(tuán)三磷酸苷合成攜帶疊氮基的RNA;攜帶親偶極基團(tuán)功能分子1,1,1，,1，-四甲基-3-乙基-3，-乙炔基丙基-苯并吲哚三甲川花菁；.催化劑硫酸銅和抗壞血酸鈉；催化劑穩(wěn)定劑TBTA/TCEP;溶劑水；50nmol攜帶1，3-二偶極基團(tuán)RNA溶于50nm水，加入lOOnmol硫酸銅、lOOnmol抗壞血酸鈉、100nmolTBTA，50Onmo1攜帶親偶極基團(tuán)功能分子，反應(yīng)1一24小時(shí)后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化連接產(chǎn)物，得產(chǎn)物29nmo1。以下實(shí)施例例舉不同功能分子探針同RNA連接方法。實(shí)施例3:膽固醇同RNA連接攜帶親偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用炔基亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入炔基；攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針疊氮基膽固醇；催化劑C54H45BrP4Cu;溶劑四氫呋喃。lOOnmol未脫2'位保護(hù)基攜帶親偶極基團(tuán)RNA溶于100^1四氫呋喃，加入lOOnmolC54H45BrP4Cu，500nrno1疊氮基膽固醇，lOOOnmol四丁基氟化銨反應(yīng)4一12小時(shí)后，蒸干反應(yīng)液，按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA后處理方法處理，最終得到連接膽固醇分子的RNA76nmo1。其它長鏈烷烴以及非極性活性分子(如脂質(zhì)體分子、疏水性藥物等)連接方法同膽固醇連接相同。實(shí)施例4:聚乙二醇(PEG)同RNA連接攜帶親偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用炔基亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入炔基；攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針疊氮基聚乙二醇；催化劑Cu(CH3CN)4PF6;溶劑乙醇氨水溶液；lOOnmol未脫堿基保護(hù)攜帶親偶極基團(tuán)RNA溶于乙醇氨溶液中，加入500nrno1攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針，100nmmolCu(CH3CN)4PF6加熱過夜。旋干氨水后，按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA后處理方法處理，最終得到連接聚乙二醇的RNA83nmol。實(shí)施例5:聚醚酰亞胺(PEI)同RNA連接攜帶親偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用炔基亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入炔基。攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針疊氮基聚醚酰亞胺(PEI)催化劑Cu(CH3CN)4PF6溶劑乙醇氨lOOnmol未脫堿基保護(hù)攜帶親偶極基團(tuán)RNA溶于乙醇氨溶液中，加入500nmol攜帶1,3-二偶極基團(tuán)生物分子探針100nmmolCu(CH3CN)4PF6加熱過夜。旋干氨水后，按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA后處理方法處理，最終得到連接聚醚酰亞胺的RNA72nmo1。其它極性穩(wěn)定活性分子(如糖類分子、激素類分子、放射性探針分子、熒光探針分子、光感探針分子、抗生素分子、酶抑制分子、或藥物分子等)都可以通過本實(shí)驗(yàn)條件同RNA連接。實(shí)施例6:多肽同RNA連接攜帶1,3-二偶極基團(tuán)RNA:化學(xué)固相合成中用疊氮亞磷酰胺對(duì)RNA進(jìn)行修飾，引入疊氮基?；蛴肨aKaRaT7RNAPolymerase試劑盒結(jié)合本發(fā)明已合成的攜帶1,3-二偶極基團(tuán)三磷酸苷合成攜帶疊氮基的RNA;攜帶親偶極基團(tuán)功能分子炔基修飾的多肽；催化劑硫酸銅和抗壞血酸鈉；催化劑穩(wěn)定劑TBTA;溶劑水；50nmo1攜帶1,3-二偶極基團(tuán)RNA溶于50ran水，加入lOOnmol硫酸銅、lOOnmol抗壞血酸鈉、100nmolTBTA，500nmo1炔基修飾的多肽，反應(yīng)2小時(shí)后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化連接產(chǎn)物，得產(chǎn)物32nmo1。其它極性不穩(wěn)定活性分子(如抗體或抗體的活性部分、糖類分子、激素類分子、蛋白類分子、多肽類分子、以及放射性探針分子、熒光探針分子、光感探針分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或藥物分子等)都可以通過本實(shí)驗(yàn)條件同RNA連接。實(shí)施例7:對(duì)被修飾RNA的生物活性檢測(cè)通過對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2所述方法合成了的l,l,r,l，-四甲基-3-乙基-3'-疊氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁(Cy3.5)修飾的小干擾RNA(siRNA)。生物活性測(cè)定首先，取lpl/孔Lipofectamine2000，用50^1Opti-MEMIReducedSerumMedium稀釋。輕輕混和后在室溫孵育5min;取適量CY3.5-siRNA(根據(jù)不同轉(zhuǎn)染濃度取量，50nM為1.25^1/孔)，用50^1Opti-MEMIReducedSerumMedium稀釋，輕輕混和均勻；稀釋的Lipofectamine2000(a)經(jīng)過5min的孵育后，與稀釋Cy3.5-siRNA(b)輕輕混和，室溫靜置20min，以形成FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和物。將Cy3.5-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和液(c)加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中，輕輕搖晃孔板，使混和；在37C的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖(7)，結(jié)果表明，通過本發(fā)明可以將Cy3和RNA連接，而且修飾后未影響siRNA沉默效果。權(quán)利要求1、一種修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，主要包括有(A)帶有1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的亞磷酰胺單體底物，或帶有1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)三磷酸苷底物；(B)帶有與1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3-二偶極基團(tuán)的生物分子探針，所述亞磷酰胺單體底物或三磷酸苷底物與生物分子探針可通過1，3-二偶極基團(tuán)與對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述l,3_二偶極基團(tuán)為氧化腈基、疊氮基、重氮甲基、硝酮基、或腈胺基；親偶極基團(tuán)為烯基、或炔基。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述烯基為乙烯基、或丁烯基；所述炔基為乙炔基、丙炔基，或環(huán)狀炔基。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述亞磷酰胺單體底物為炔基三甘醇亞磷酰胺或炔基甘油亞磷酰胺；所述三磷酸苷底物為5'-疊氮基尿嘧啶核苷三磷酸和5，-乙炔基尿嘧啶苷三磷酸。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述生物分子探針為生物熒光探針、免疫探針、生物素、抗原或半抗原、放射性探針分子、光感探針分子、或蛋白標(biāo)簽分子。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述生物分子探針為帶有疊氮基或炔基的吲哚類菁生物熒光探針或苯并吲哚類菁生物熒光探針。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述生物分子探針為1,1,r,r-四甲基-3-乙基-3，-疊氮基丙基』引哚三甲川花菁或分子探針為i-乙基-r-疊氮正己基-3，3，3，，3'-四甲基-6-磺酸基』引哚五甲川花菁。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述試劑盒還包括有催化劑、溶劑，所述催化劑包為含亞銅離子化合物；所述溶劑為水、四氫呋喃、DMSO、乙腈、或四氫呋喃與水的混合物、或DMSO與水的混合物、或其中多種溶劑混合物。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述催化劑為硫酸銅和抗壞血酸鈉、溴化亞銅、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu、Cu絲中的一種或多種。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的修飾體外合成RNA的試劑盒，其特征是，所述試劑盒還包括有催化劑穩(wěn)定劑，該催化劑穩(wěn)定劑為TBTA，TCEP中的一種或多種。11、一種修飾體外合成RNA的方法，其特征是，主要包括以下步驟(l)在化學(xué)合成核糖核酸時(shí)，以帶有l(wèi)，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的亞磷酰胺單體或三磷酸苷為底物合成核糖核酸；(2)然后在化學(xué)合成過程中或合成完畢后，待修飾核糖核酸與帶有與1，3—二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3—二偶極基團(tuán)的生物分子探針在亞銅離子化合物的催化劑催化下進(jìn)行"點(diǎn)擊"反應(yīng)，核糖核酸被修飾。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的修飾體外合成RNA的方法，其特征是，所述l，3—二偶極基團(tuán)為氧化腈基、疊氮基、重氮甲基、硝酮基、或腈胺基；親偶極基團(tuán)為烯基、或炔基。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的修飾體外合成RNA的方法，其特征是，所述烯基為乙烯基、或丁烯基；所述炔基為乙炔基、丙炔基，或環(huán)狀炔基。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的修飾體外合成RNA的方法，其特征是，所述亞磷酰胺單體底物為炔基三甘醇亞磷酰胺或炔基甘油亞磷酰胺。15、根據(jù)權(quán)利要求11所述的修飾體外合成RNA的方法，其特征是，所述生物分子探針為生物熒光探針、免疫探針、生物素、抗原或半抗原、放射性探針分子、光感探針分子、或蛋白標(biāo)簽分子。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的修飾體外合成RNA的方法，其特征是，所述活性生物分子探針為帶有疊氮基或炔基的吲哚類菁生物熒光探針或苯并吲哚類菁生物熒光探針。17、根據(jù)權(quán)利要求11所述的修飾體外合成RNA的方法，其特征是，所述溶劑為水、四氫呋喃、DMSO、乙腈、或四氫呋喃與水的混合物、或DMSO與水的混合物、或其中多種溶劑混合物；所述催化劑為硫酸銅和抗壞血酸鈉、溴化亞銅、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu、Cu絲中的一種或多種。18、根據(jù)權(quán)利要求11所述的修飾體外合成RNA的方法，其特征是，步驟(2)中，進(jìn)行"點(diǎn)擊"反應(yīng)時(shí)還加有催化劑穩(wěn)定劑，該催化劑穩(wěn)定劑為TBTA，TCEP中的一種或多種。全文摘要本發(fā)明公開了一種修飾體外合成RNA的方法和試劑盒，具體為(1)在化學(xué)合成RNA時(shí)，以帶有1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的亞磷酰胺單體為底物合成核糖核酸；(2)然后在化學(xué)合成過程中或合成完畢后，待修飾核糖核酸與對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3-二偶極基團(tuán)的生物分子探針在亞銅離子化合物的催化劑催化下進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)，核糖核酸被修飾。本發(fā)明方法提供的修飾RNA的試劑盒和方法避免了傳統(tǒng)分子連接方法在RNA合成或脫保護(hù)基過程中活性分子分解失活的缺點(diǎn)。成本低、操作簡便，條件溫和，修飾效果好，而且不影響任何RNA的生物活性。文檔編號(hào)C07K1/107GK101550175SQ20091003936公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者張必良,渠德忠,瑋王申請(qǐng)人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院