本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多重DPO-PCR同時檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的引物組合及方法。

背景技術(shù)：

旋毛蟲(Trichinella spiralis)是一種危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生性線蟲，能夠感染包括人類在內(nèi)的150多種哺乳動物，呈世界性分布。旋毛蟲病感染來源于攝食了生的或未熟的含旋毛蟲包囊的豬肉或其他動物肉，且人感染旋毛蟲病可引起死亡，是一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全的人畜共患寄生蟲病，所以在肉品衛(wèi)生檢驗中為必檢項目。

弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能感染幾乎所有溫血動物的有核細(xì)胞，是引起世界范圍廣泛流行的人獸共患寄生蟲病。食入未煮熟的肉等被污染的食物易引起弓形蟲病。

血吸蟲是人畜互通寄生蟲。其儲存宿主種類較多，主要有牛、豬、犬、羊、馬、貓及鼠類等30多種動物。

多重PCR是指在一個反應(yīng)管內(nèi)加入多對引物同時對多個靶基因進(jìn)行擴增，可以實現(xiàn)對樣品的高通量檢測，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因物種的檢測。由于在PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入了多對引物，體系復(fù)雜，穩(wěn)定性不高，限制了其使用。雙啟動寡核苷酸(DPO，Dual priming oligonucleotide)引物的設(shè)計方法簡化了建立常規(guī)PCR方法的操作步驟，該DPO引物技術(shù)的主要原理為其引物包含兩個各自獨立的特異性引物區(qū)域，5′端序列由18-25個堿基組成并與靶基因序列配對，3′端序列由6-12個堿基用來引導(dǎo)PCR反應(yīng)的特異性延伸，這兩段獨立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine,I)進(jìn)行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu)，從而使5′和3′區(qū)域形兩個獨立功能的雙特異性引物結(jié)構(gòu)，研究表明5′和3′引物區(qū)域中任何有3個及以上堿基的錯配，PCR反應(yīng)將不能進(jìn)行，而且由于其特殊的結(jié)構(gòu)，引物自身以及引物之間很少形成二級結(jié)構(gòu)且對退火溫度不敏感，實驗過程中不需要對引物進(jìn)行篩選以及對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。該技術(shù)的優(yōu)點主要在于它對退火溫度等影響普通多重PCR的關(guān)鍵因素不敏感，適用范圍廣，而且該技術(shù)特異性強，擴增效率高，為多重PCR技術(shù)的應(yīng)用提供了新的前景。

采用DPO引物建立多重DPO-PCR方法對致病性微生物實施精準(zhǔn)檢測，對保障公共衛(wèi)生安全具有現(xiàn)實意義。本發(fā)明根據(jù)旋毛蟲ATP6靶基因、弓形蟲P22靶基因和血吸蟲28S rRNA的保守區(qū)設(shè)計合成了三對DPO引物，通過反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了同時檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的DPO-PCR精準(zhǔn)檢測方法。本發(fā)明可用于臨床病例的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，具有一定的實用性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏、準(zhǔn)確和快速的基于多重DPO-PCR技術(shù)的可同時旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測效率高和適用范圍廣的三組引物對。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):

根據(jù)旋毛蟲ATP6靶基因、弓形蟲P22靶基因和血吸蟲28S rRNA的保守區(qū)設(shè)計合成了三對DPO引物組合，所述引物組合如下：

Trichina-F：5’-TCTCCCTACTCAGATACAACTGAATIIIIIACAGCCAA-3’；

Trichina-R：5’-GGATTTATGTGTTTTTGTGTGTGTTIIIIITTCTGGTC-3’；

Toxo-F：5’-CGGCGCAACGAAGACTGTTGIIIIICCCTCCAGT-3’；

Toxo-R：5’-ACCTGCTTCGGCAACGCACTTIIIIIAGAGAACC-3’；

Schistosome-F：5’-TGAGATACCACAAAAGGTGTTGGIIIIICCAGACAGC-3’；

Schistosome-R：5’-GGGCTGCGATCTACAACTTTGIIIIITGATGCAG-3’；

其中，I為次黃嘌呤。

Trichina-F和Trichina-R為檢測旋毛蟲的引物，產(chǎn)物大小為419bp；Toxo-F和Toxo-R為弓形蟲的引物，產(chǎn)物大小為271bp；Schistosome-F和Schistosome-R為檢測血吸蟲的引物，產(chǎn)物大小為494bp。

本發(fā)明還提供含有所述引物組合的用于多重DPO-PCR檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液等中的至少一種。更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照。

本發(fā)明還提供了一種檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的多重DPO-PCR方法，利用所述的引物組合進(jìn)行多重DPO-PCR檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲這三種動物源性人獸共患寄生蟲病。具體的，所述方法包括以下步驟：1)提取待測患病動物肌肉組織或臟器樣品中的DNA；2)以步驟1)中提取的DNA為模板，進(jìn)行多重DPO-PCR擴增反應(yīng)；和3)分析擴增產(chǎn)物。所述多重DPO-PCR反應(yīng)體系以50μL計為：10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL，Mg²⁺(25mM)7.5μL，dNTP(2.5mM)5.5μL，每對DPO引物(10μM)各1μL，DNA模板各1μL，ddH₂O補至50μL。所述多重DPO-PCR反應(yīng)條件為：95℃5分鐘；94℃45s，48℃～68℃45s，72℃45s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。

前述方法中，步驟3)中采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，旋毛蟲的擴增產(chǎn)物大小為419bp，弓形蟲的擴增產(chǎn)物大小為271bp，血吸蟲的擴增大小為494bp。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明根據(jù)旋毛蟲ATP6靶基因、弓形蟲P22靶基因和血吸蟲28S rRNA的保守區(qū)分別設(shè)計特異性DPO-PCR引物，并基于這些引物建立了檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的多重DPO-PCR方法，可實現(xiàn)對患病動物肌肉組織或臟器樣品的定性檢測。實驗表明，本發(fā)明的檢測方法特異性好、通量高、快速，提高了檢測效率，為旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的檢測提供了更有效的方法。

附圖說明：

圖1是旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲單重DPO-PCR檢測結(jié)果示意圖，其中，旋毛蟲和弓形蟲PCR檢測示意圖的M為DNA Marker 100 ladder，血吸蟲的PCR檢測示意圖的M為DNA Marker DL2000，1-2為不同寄生蟲DPO-PCR檢測陽性結(jié)果。

圖2是旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲DPO-PCR檢測方法退火溫度不敏感性結(jié)果示意圖，其中，M為DNA Marker DL2000，1為48.3℃，2為49.5℃，3為51.4℃，4為53.7℃，5為56.4℃，6為59.1℃，7為61.7℃，8為64.1℃，9為66.1℃，10為67.4℃，11為68℃；左側(cè)的1-11為常規(guī)引物擴增獲得結(jié)果，右側(cè)的1-11為DPO引物擴增的結(jié)果。

具體實施方式

下面以具體實施方式對發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明

本發(fā)明參照特定的實施例進(jìn)行了描述，但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不違背本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的說明書和附圖應(yīng)該認(rèn)為是說明性的而非限制性的。

實施例1.檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的多重DPO-PCR方法

一、多重DPO-PCR引物組合的設(shè)計

根據(jù)旋毛蟲ATP6靶基因、弓形蟲P22靶基因和血吸蟲28S rRNA的保守區(qū)，分別設(shè)計了如下檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的保守區(qū)的多重DPO-PCR引物組合(引物序列中的I為次黃嘌呤)：

Trichina-F：5’-TCTCCCTACTCAGATACAACTGAATIIIIIACAGCCAA-3’(SEQ ID NO:1)

Trichina-R：5’-GGATTTATGTGTTTTTGTGTGTGTTIIIIITTCTGGTC-3’(SEQ ID NO:2)

Toxo-F：5’-CGGCGCAACGAAGACTGTTGIIIIICCCTCCAGT-3’(SEQ ID NO:3)

Toxo-R：5’-ACCTGCTTCGGCAACGCACTTIIIIIAGAGAACC-3’(SEQ ID NO:4)

Schistosome-F：5’-TGAGATACCACAAAAGGTGTTGGIIIIICCAGACAGC-3’(SEQ ID NO:5)

Schistosome-R：5’-GGGCTGCGATCTACAACTTTGIIIIITGATGCAG-3’(SEQ ID NO:6)

Trichina-F和Trichina-R為檢測旋毛蟲的引物，產(chǎn)物大小為419bp；Toxo-F和Toxo-R為弓形蟲的引物，產(chǎn)物大小為271bp；Schistosome-F和Schistosome-R為檢測血吸蟲的引物，產(chǎn)物大小為494bp。

二、檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的多重DPO-PCR方法

1、DNA的提取

采用DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA，參照試劑盒說明操作。

2、多重DPO-PCR擴增

采用Trichina-F、Trichina-R、Toxo-F、Toxo-R、Schistosome-F和Schistosome-R共6條多重DPO-PCR引物，分別以如下4組的基因組DNA為模板進(jìn)行多重DPO-PCR擴增，分別得到多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物：

組1以旋毛蟲的基因組DNA為模板；

組2以弓形蟲的基因組DNA為模板；

組3以血吸蟲的基因組DNA為模板；

組4以旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA為模板。

多重DPO-PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL，Mg²⁺(25mM)7.5μL，dNTP(2.5mM)5.5μL，每對DPO引物(10μM)各1μL，DNA模板各1μL，ddH₂O補至50μL。

多重DPO-PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃45s，48℃～68℃45s，72℃45s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。

3、多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

多重DPO-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并對擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

結(jié)果如圖1和圖2所示，組1(旋毛蟲)的PCR擴增產(chǎn)物含有1條帶，大小為419bp；組2(弓形蟲)的PCR擴增產(chǎn)物只含有1個條帶，大小為271bp；組3(血吸蟲)的PCR擴增產(chǎn)物含有1個條帶，大小為494bp；組4(旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲)的PCR擴增產(chǎn)物含有3條大小為419bp、271bp和494bp。說明本發(fā)明的多重DPO-PCR引物的可以快速有效地檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲。

實施例2.多重DPO-PCR引物組合的靈敏度檢測

1、DNA的提取

參照試劑盒說明操作提取旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因DNA。將得到的基因組DNA混合并進(jìn)行10倍稀釋，分別制備得到濃度為18ng/μL、1.8ng/μL、0.18ng/μL、0.018ng/μL和0.0018ng/μL的旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA。

2、多重DPO-PCR擴增

采用實施例1的步驟二中的檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的方法，分別以如下5組的基因組DNA為模板進(jìn)行多重DPO-PCR擴增，分別得到多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物：

組1：以18ng/μL的旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA(1μL)為模板；

組2：以1.8ng/μL的旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA(1μL)為模板；

組3：以0.18ng/μL的旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA(1μL)為模板；

組4：以0.018ng/μL的旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA(1μL)為模板；

組5：以0.0018ng/μL的旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA(1μL)為模板。

3、多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

多重DPO-PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別取5μL的多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

結(jié)果表明，本發(fā)明多重DPO-PCR引物組合具有較高的靈敏度，可檢測出樣品中僅含有0.0018ng/μL的微量DNA。

實施例3.多重DPO-PCR引物組合的退火溫度敏感性檢測

1、DNA的提取

參照試劑盒說明提取旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的基因組DNA。

2、多重DPO-PCR擴增

以步驟1獲得的旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲基因組DNA為模板，采用常規(guī)引物(如表1所示)或者實施例1的步驟二中的同時檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的方法，用不同的退火溫度(48.3℃、49.5℃、51.4℃、53.7℃、56.4℃、59.1℃、61.7℃、64.1℃、66.1℃、67.4℃、68℃)分別進(jìn)行PCR擴增，其余反應(yīng)條件不變，分別得到PCR擴增產(chǎn)物。

表1.擴增血吸蟲28S rRNA、旋毛蟲ATP6基因和弓形蟲P22基因常規(guī)引物序列

3、多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

多重DPO-PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別取5μL的多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

結(jié)果如圖2所示：電泳檢測結(jié)果顯示用不同的退火溫度(48.3℃、49.5℃、51.4℃、53.7℃、56.4℃、59.1℃、61.7℃、64.1℃、66.1℃、67.4℃、68℃)進(jìn)行PCR擴增得到的PCR擴增產(chǎn)物均含有大小為419bp、271bp和494bp的片段，無非特異性擴增條帶，說明本發(fā)明的多重DPO-PCR引物對退火溫度不敏感。

序列表

<110> 申請人名稱：海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心

<120> 一種檢測旋毛蟲、弓形蟲和血吸蟲的多重DPO-PCR引物組合及方法

<130> reference number：11348

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲ATP6靶基因DPO引物上游引物

<400> 1

tctccctact cagatacaac tgaatiiiii acagccaa 38

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲ATP6靶基因DPO引物下游引物

<400> 2

ggatttatgt gtttttgtgt gtgttiiiii ttctggtc 38

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲P22靶基因DPO引物上游引物

<400> 3

cggcgcaacg aagactgttg iiiiiccctc cagt 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲P22靶基因DPO引物下游引物

<400> 4

acctgcttcg gcaacgcact tiiiiiagag aacc 34

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲28S rRNA DPO引物上游引物

<400> 5

tgagatacca caaaaggtgt tggiiiiicc agacagc 37

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲28S rRNA DPO引物下游引物

<400> 6

gggctgcgat ctacaacttt giiiiitgat gcag 34

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲ATP6靶基因常規(guī)引物上游引物

<400> 7

tctccctact cagatacaac tgaattatta acagccaa 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲ATP6靶基因常規(guī)引物下游引物

<400> 8

ggatttatgt gtttttgtgt gtgttattca ttctggtc 38

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲P22靶基因常規(guī)引物上游引物

<400> 9

cggcgcaacg aagactgttg atgcaccctc cagt 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲P22靶基因常規(guī)引物下游引物

<400> 10

acctgcttcg gcaacgcact tgtaacagag aacc 34

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲28S rRNA常規(guī)引物上游引物

<400> 11

tgagatacca caaaaggtgt tggttggtcc agacagc 37

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲28S rRNA常規(guī)引物下游引物

<400> 12

gggctgcgat ctacaacttt gtactttgat gcag 34