本發(fā)明涉及寄生蟲病傳播媒介檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種血吸蟲蟲卵檢測方法及該方法所用的試劑盒和引物。

背景技術(shù)：

血吸蟲也稱裂體吸蟲(schistosoma)。血吸蟲寄生于多數(shù)脊椎動(dòng)物，卵穿過靜脈壁進(jìn)入膀胱，隨尿排出。幼蟲在中間宿主螺類體內(nèi)發(fā)育。成熟幼蟲通過皮膚或口進(jìn)入終宿主體內(nèi)。曼森氏裂體吸蟲(s.mansoni,即曼氏血吸蟲)在大、小腸靜脈中，主要分布于非洲和南美洲北部。卵隨糞便排出。幼蟲進(jìn)入螺體，再通過皮膚回到終宿主體內(nèi)。日本裂體吸蟲(s.japonicum,即日本血吸蟲)主要見于中國大陸、日本、中國臺(tái)灣、東印度群島和菲律賓，除人外，還侵襲其他脊椎動(dòng)物，如家畜和大鼠等。埃及裂體吸蟲(s.haematobium，即埃及血吸蟲)主要分布于非洲、南歐和中東。埃及血吸蟲生活在膀胱靜脈內(nèi)，卵穿過靜脈壁進(jìn)入膀胱，隨尿排出。

血吸蟲蟲卵的檢測方法有很多，現(xiàn)有方法最常見的有：(1)直接涂片法，該方法是在玻片上將病人糞便或急性血吸蟲病人的粘液血便糞便直接涂片制備成糞膜，在顯微鏡下根據(jù)蟲卵形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒別的方法，方法簡便，但蟲卵檢出率低。(2)沉淀法，或者稱為集卵法，該方法是通過離心沉淀或靜置沉淀或淘洗后，將濃縮的含有蟲卵的糞渣涂片，鏡檢，比直接涂片法檢出率有所提高。(3)定量透明法，即改良加藤厚涂片法(kato-katz法)，是對(duì)蟲卵的定量方法，即在固定體積的糞渣中對(duì)蟲卵進(jìn)行顯微鏡下計(jì)數(shù)的方法。(4)毛蚴孵化法，是利用沉淀法收集到的沉淀蟲卵，在無氯的溫水(25-30℃)中培養(yǎng)，蟲卵可在數(shù)小時(shí)孵化出毛蚴。通過在解剖顯微鏡下對(duì)毛蚴的觀察，間接對(duì)蟲卵進(jìn)行檢測。(5)直腸粘膜活體組織檢查，該法是用直腸鏡或乙狀結(jié)腸鏡從直腸或乙狀結(jié)腸病變部位鉗取一小塊腸黏膜作壓片，然后在顯微鏡下觀察鑒別蟲卵。

然而，現(xiàn)有的檢測方法還有很多不完善的地方，例如最常見的直接涂片法是通過形態(tài)學(xué)區(qū)別鑒定來檢測，實(shí)際操作時(shí)糞便中成分各異，如果不是經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測者，有時(shí)很難區(qū)別鑒定形態(tài)相似的真菌孢子、不同蟲卵及其他微生物，也就是說該法結(jié)果是否準(zhǔn)確，高度依賴于檢測人員形態(tài)學(xué)區(qū)別鑒定的經(jīng)驗(yàn)；鏡檢技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)簡單，容易操作，缺點(diǎn)是對(duì)稀便不適應(yīng)，檢出率降低，尤其是改良加藤厚涂片法，對(duì)稀便無法制作合乎要求的片子。另外，為了提高檢出率，實(shí)際操作中往往需要對(duì)糞便進(jìn)行淘洗、濃縮，毛蚴孵化等操作，時(shí)間長，而且這個(gè)操作的生物安全要求高，而基層單位往往在不具備生物安全要求的條件下操作，對(duì)操作人員的健康造成直接威脅。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種血吸蟲蟲卵檢測方法及該方法所用的試劑盒和引物，以解決上述問題。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

用于檢測血吸蟲蟲卵的lamp引物組，所述lamp引物組包括f3和b3組成外引物對(duì)和fip和bip組成的內(nèi)引物對(duì)；

所述f3、b3、fip以及bip的核苷酸序列依次如seqidno:1～4所示。

優(yōu)選的，如上所述的用于檢測血吸蟲蟲卵的lamp引物組，所述引物組還包括一條lf環(huán)引物，所述lf環(huán)引物的核苷酸序列如seqidno:5所示。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothemalamplification,lamp)是近年來發(fā)展出來的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)。通過設(shè)計(jì)識(shí)別目的片段6個(gè)序列的4個(gè)特異引物，整個(gè)反應(yīng)可以在恒溫(60～65℃)條件下1h內(nèi)完成，由于采用4個(gè)引物，與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，它具有敏感、特異的特點(diǎn)。反應(yīng)不需要精密控溫設(shè)備和高級(jí)復(fù)雜的分析儀器，對(duì)操作人員的熟練度和專業(yè)水平要求不高，因此該方法特別適合基層或者實(shí)驗(yàn)條件較差的試驗(yàn)室進(jìn)行病原微生物的快速檢測。

引物的特異性是lamp檢測方法成敗的關(guān)鍵。引物的設(shè)計(jì)及篩選有其獨(dú)特的設(shè)計(jì)原則及規(guī)律。lamp反應(yīng)中內(nèi)引物fip/bip和外引物f3/b3的特異性決定了反應(yīng)的特異性。

lamp技術(shù)的引物設(shè)計(jì)，比pcr技術(shù)要復(fù)雜。它針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物。若再增加一對(duì)環(huán)引物(1oopprimer)，便可使反應(yīng)加速，提高擴(kuò)增效率。引物tm值是影響lamp反應(yīng)正常進(jìn)行的關(guān)鍵因素，在at/gc含量正常的引物組中，本申請(qǐng)f3/b3引物和fip/bip引物的tm值適中，在此溫度內(nèi)引物的擴(kuò)增效率最佳。

lamp中的環(huán)引物是在lamp反應(yīng)中形成環(huán)的部位進(jìn)行加速的，可以提高擴(kuò)增效率、縮短反應(yīng)時(shí)間。

本發(fā)明所采用的各引物的tm值均符合篩選原則，同時(shí)為保證引物末端的穩(wěn)定性，f3/b3，f2/b2，lf/lb的3’末端⊿g值要小于等于-4kcal/mol，f1c和b1c的5’端的⊿g值要小于等于-4kcal/mol。環(huán)引物lf位于f1c和f2c之間，lf3’末端⊿g值也要小于等于-4kcal/mol。

引物之間的距離，從f25’端到b25’端在120-180bp之間，從f2的5’端到f1c的3’端也就是莖環(huán)這一段在40-60bp之間，從f2的5’端到f3的3’端在0-20bp之間。引物自身不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

一種用于檢測血吸蟲蟲卵的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的lamp引物組、反應(yīng)混合液以及dna聚合酶；

優(yōu)選的，所述試劑盒中還含有指示劑；所述指示劑選自sybrgreeni、evagreen、picogreen、pekogreen、碘化丙啶、鈣黃綠素或羥基萘酚藍(lán)中的一種；

更優(yōu)選的，所述指示劑為羥基萘酚藍(lán)，且所述羥基萘酚藍(lán)加入所述反應(yīng)混合液中，濃度優(yōu)選為100μm～140μm。

本發(fā)明檢測試劑盒具有用樣少、特異性強(qiáng)、敏感性高、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，為檢測血吸蟲蟲卵提供了簡捷、有效的早期快速診斷途徑。

因?yàn)楫a(chǎn)物是雙鏈dna，也可以通過顏色變化直接觀察，即在反應(yīng)產(chǎn)物中加入sybrgreeni、evagreen、picogreen、pekogreen、碘化丙啶(pi)等雙鏈dna熒光顯色試劑或者黃連素(berberine)，在熒光燈下觀察顏色變化，如sybr-green、evagreen、picogreen、pekogreen、陽性為綠色熒光，陰性無綠色熒光。而pi陽性為紅色熒光，陰性無紅色熒光。黃連素在熒光下陽性為黃色熒光，而陰性無黃色熒光；

或者在反應(yīng)體系中加入20～30mm鈣黃綠素(calcein)和0.3～0.7mmmncl2，在反應(yīng)過程中和反應(yīng)后觀察顏色或熒光變化，可見光下陰性為橙色，陽性為綠色，在熒光燈下陰性無綠色熒光，陽性為綠色熒光。鈣黃綠素和mncl2也可在反應(yīng)結(jié)束后加入產(chǎn)物中觀察顏色或熒光變化。

羥基萘酚藍(lán)是一種金屬離子指示劑，由于反應(yīng)過程中隨著mg²⁺含量減少會(huì)逐漸從淺紫色變成天藍(lán)色，且與本領(lǐng)域常用的sybrgreeni相比，只有有效擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生，才會(huì)出現(xiàn)顏色變化，故不會(huì)出現(xiàn)因引物二聚體導(dǎo)致的假陽性。

此外，羥基萘酚藍(lán)的顯色不需要額外添加任何成分，因此不會(huì)對(duì)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性造成干擾?，F(xiàn)有技術(shù)擴(kuò)增結(jié)果的觀察，需要反應(yīng)結(jié)束后將顯色試劑加入，才能觀察結(jié)果，不能實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)結(jié)果；此外，觀察結(jié)果時(shí)需要將pcr管打開，添加顯色試劑，由于經(jīng)過擴(kuò)增的dna產(chǎn)物濃度很高，高達(dá)初始濃度的10⁹倍，極易造成實(shí)驗(yàn)環(huán)境污染。本發(fā)明優(yōu)選使用的羥基萘酚藍(lán)指示劑，對(duì)反應(yīng)體系幾乎沒有抑制作用，可以直接加到反應(yīng)體系中，在反應(yīng)過程中隨時(shí)可以看到顏色變化，不必等到反應(yīng)完全結(jié)束才觀察結(jié)果，也不需要打開pcr管。

優(yōu)選的，如上所述的用于檢測血吸蟲蟲卵的試劑盒，所述反應(yīng)混合液包括如下成分：

ph為8.6～9.0的15mm～25mmtris–hcl、1.2mm～1.6mmdntps、8mm～12mmkcl、8mm～12mm(nh4)2so4、6mm～10mmmgso4、0.6m～1.0m甜菜堿以及體積百分?jǐn)?shù)為0.07％～0.13％的tween20。

優(yōu)選的，如上所述的用于檢測血吸蟲蟲卵的試劑盒，所述dna聚合酶為具有鏈置換作用的bstdna聚合酶，活性單位為14～18u/μl。

bstdna聚合酶來源于bacillusstearothermophilus。它有5'→3'的聚合酶活性和雙鏈特異的5'→3'外切酶活性，但沒有3'→5'外切酶活性。具有熱穩(wěn)定性、鏈置換活性及聚合酶活性，在體外dna等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中起重要作用。

優(yōu)選的，如上所述的用于檢測血吸蟲蟲卵的試劑盒，所述試劑盒還包括去離子水。

優(yōu)選的，如上所述的用于檢測血吸蟲蟲卵的試劑盒，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)血吸蟲dna的陽性對(duì)照。

一種血吸蟲蟲卵的檢測方法，包括：

提取待檢測的血吸蟲蟲卵dna，添加權(quán)利要求3～5任一項(xiàng)所述的試劑盒中的試劑組成反應(yīng)體系進(jìn)行恒溫反應(yīng)；反應(yīng)過程中或反應(yīng)后觀察反應(yīng)液中指示劑的顏色變化或熒光強(qiáng)度變化。

在lamp循環(huán)中產(chǎn)生大量白色的焦磷酸鹽鎂，沉淀在管底，肉眼可見。所以也可以通過觀察白色沉淀，判斷結(jié)果；為了比較反應(yīng)產(chǎn)物的多少，可以用分光光度計(jì)檢測反應(yīng)產(chǎn)物的混濁度(實(shí)際上是檢測在lamp循環(huán)中產(chǎn)生的焦磷酸鹽)；

最終產(chǎn)物是由不同長度dna分子組成的混合物，故用2％-3％瓊脂糖凝膠電泳，可以看到類似梯狀條帶，也可以判斷陽性擴(kuò)增。

優(yōu)選的，如上所述的血吸蟲蟲卵的檢測方法，所述反應(yīng)體系中，f3、b3、fip、bip以及l(fā)f的摩爾比為1:1:(7～9):(7～9):(3～5)；

更優(yōu)選的，f3、b3、fip、bip以及l(fā)f的摩爾比為0.2μm:0.2μm:1.6μm:1.6μm:0.8μm。

優(yōu)選的，如上所述的血吸蟲蟲卵的檢測方法，所述恒溫反應(yīng)的條件為：

60℃～65℃恒溫反應(yīng)60min～80min；更優(yōu)選的，65℃恒溫反應(yīng)66min～70min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、本發(fā)明檢測對(duì)象是日本血吸蟲基因組dna，日本血吸蟲基因組dna具有保守、穩(wěn)定的特點(diǎn)，加上我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)該保守序列的6個(gè)位點(diǎn)的4條引物，擴(kuò)增產(chǎn)物也是具有特異和穩(wěn)定的特點(diǎn)；從而不依賴于對(duì)形態(tài)學(xué)經(jīng)驗(yàn)的積累，只需要學(xué)會(huì)簡單的dna操作即可掌握。

2)、本發(fā)明用bstdna聚合酶代替常規(guī)pcr的dna聚合酶，該酶耐高溫，有鏈置換功能和dna5’→3’聚合活性，在60-65℃等溫條件下對(duì)靶dna實(shí)現(xiàn)特異擴(kuò)增；由于不需要高溫變性、低溫退火和延伸的循環(huán)，省去了常規(guī)pcr變溫所需要的時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)快速高效的dna擴(kuò)增。

3)、本發(fā)明盡可能地減少樣本暴露，最大程度地保護(hù)樣本和操作人員，同時(shí)檢測時(shí)間也不長，只需要1小時(shí)。

4)、本發(fā)明所使用的儀器都是常規(guī)儀器，離心機(jī)和恒溫水浴鍋或者其他恒溫設(shè)備，不需要昂貴的pcr儀設(shè)備，成本大大降低。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明的引物，加lf或不加lf的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖2中顯示的是本發(fā)明提供的引物組可以對(duì)血吸蟲蟲卵dna進(jìn)行有效擴(kuò)增，加水陰性對(duì)照在延長反應(yīng)時(shí)間后也出現(xiàn)陽性反應(yīng)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

血吸蟲蟲卵dna的提取方法

1、糞便樣本的準(zhǔn)備：新鮮采集的糞便取少量，約0.5克，置于1.5毫升離心管中，加1毫升生理鹽水，振蕩器上充分振蕩，14000g離心30秒，棄上清；保存在酒精或其他溶液中的糞便，重復(fù)洗3次，棄上清。

2、裂解：沉淀中依次加入200微升裂解液(4m尿素，200mmtris,20mmnacl，200mmedta,ph7.4)和40微升蛋白酶k(1mg/ml)，迅速混勻，55度孵育0.5-1小時(shí)，直到液體澄清。用1毫升注射器(去針頭)來回吹吸3次。

3、核酸沉淀：加200微升結(jié)合液(6m鹽酸胍，10m尿素，10mmtris-hcl,20％tritonx-100(v/v),ph4.4),立刻混勻，70度孵育10分鐘。加入100微升異丙醇，充分混勻。

4、膜吸附核酸：將所有液體轉(zhuǎn)移到吸附柱，8,000g離心1分鐘，棄穿透液；

5、去抑制劑：吸附柱中加入500微升抑制劑去除液(5m鹽酸胍，20mmtris-hcl,40％無水乙醇(v/v)，ph6.6)，8,000g離心1分鐘，棄穿透液；

6、洗滌:吸附柱中加入500微升洗滌液(20mmnacl，2mmtris-hcl,80％無水乙醇(v/v),ph7.5)，8,000g離心1分鐘，棄穿透液。重復(fù)一次；

7、洗脫dna：吸附柱中加入100微升70度預(yù)熱的洗脫液(10mmtris-hcl,ph8.5)，8,000g離心1分鐘。

8、凍存洗脫下來的dna液待測。

實(shí)施例2

環(huán)介導(dǎo)等溫dna擴(kuò)增：取3個(gè)0.2mlpcr用薄壁管，分別標(biāo)記為陽性對(duì)照管，檢測管，陰性對(duì)照管；

各管中依次加入如下成分：

反應(yīng)混合液：15mmtris–hcl(ph8.6)、1.6mmdntps、8mmkcl、25mm鈣黃綠素、0.5mmmncl2、12mm(nh4)2so4、10mmmgso4、1.0m甜菜堿(sigma–aldrich)以及體積百分?jǐn)?shù)為0.13％的tween20；

16u的bstdna聚合酶(newenglandbiolabs)；

混合引物：0.2μmf3和0.2μmb3、1.4μmfip和1.4μmbip以及1.0μmlf；所述f3、b3、fip、bip以及l(fā)f的核苷酸序列依次如seqidno:1～5所示。

檢測管中加入5μl實(shí)施例1制備得到的dna；陰性對(duì)照管加入5μl去離子水陰性對(duì)照；陽性對(duì)照管加入標(biāo)準(zhǔn)血吸蟲dna的陽性對(duì)照。

短暫離心后放于63℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60min；85℃，2分鐘，滅活bstdna聚合酶。反應(yīng)過程中，如果有靶dna擴(kuò)增就會(huì)有顯色反應(yīng)，隨時(shí)可以觀察顏色變化，可見光下陰性為橙色，陽性為綠色，在熒光燈下陰性無綠色熒光，陽性為綠色熒光。

實(shí)施例3

環(huán)介導(dǎo)等溫dna擴(kuò)增：取3個(gè)0.2mlpcr用薄壁管，分別標(biāo)記為陽性對(duì)照管，檢測管，陰性對(duì)照管；

各管中加入如下成分：

反應(yīng)混合液：25mmtris–hcl(ph9.0)、1.2mmdntps、8mmkcl、100μm羥基萘酚藍(lán)、8mm(nh4)2so4、6mmmgso4、0.6m甜菜堿(sigma–aldrich)以及體積百分?jǐn)?shù)為0.07％的tween20；

16u的bstdna聚合酶(newenglandbiolabs)；

混合引物：0.2μmf3和0.2μmb3、1.8μmfip和1.8μmbip以及0.6μmlf；所述f3、b3、fip、bip以及l(fā)f的核苷酸序列依次如seqidno:1～5所示。

檢測管中加入5μl實(shí)施例1制備得到的dna；陰性對(duì)照管加入5μl去離子水陰性對(duì)照；陽性對(duì)照管加入標(biāo)準(zhǔn)血吸蟲dna的陽性對(duì)照。

短暫離心后放于63℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60min；85℃，2分鐘，滅活bstdna聚合酶。反應(yīng)過程中，如果有靶dna擴(kuò)增就會(huì)有顯色反應(yīng)，隨時(shí)可以觀察顏色變化，淺紫色的為陰性反應(yīng)，天藍(lán)色為陽性反應(yīng)。

實(shí)施例4

環(huán)介導(dǎo)等溫dna擴(kuò)增：取3個(gè)0.2mlpcr用薄壁管，分別標(biāo)記為陽性對(duì)照管，檢測管，陰性對(duì)照管；

各管中加入如下成分：

反應(yīng)混合液：20mmtris–hcl(ph8.8)、1.4mmdntps、10mmkcl、120μm羥基萘酚藍(lán)、10mm(nh4)2so4、8mmmgso4、0.8m甜菜堿(sigma–aldrich)以及體積百分?jǐn)?shù)為0.10％的tween20；

16u的bstdna聚合酶(newenglandbiolabs)；

混合引物：0.2μmf3和0.2μmb3、1.6μmfip和1.6μmbip以及0.8μmlf；所述f3、b3、fip、bip以及l(fā)f的核苷酸序列依次如seqidno:1～5所示。

檢測管中加入5μl實(shí)施例1制備得到的dna；陰性對(duì)照管加入5μl去離子水陰性對(duì)照；陽性對(duì)照管加入標(biāo)準(zhǔn)血吸蟲dna的陽性對(duì)照。

短暫離心后放于63℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60min；85℃，2分鐘，滅活bstdna聚合酶。反應(yīng)過程中，如果有靶dna擴(kuò)增就會(huì)有顯色反應(yīng)，隨時(shí)可以觀察顏色變化，淺紫色的為陰性反應(yīng)，天藍(lán)色為陽性反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)例1

由于日本血吸蟲經(jīng)過長期進(jìn)化，與宿主高度適應(yīng)，保留了很多與宿主相似的基因，找到一個(gè)特異的靶基因作為檢測目標(biāo)，實(shí)在不易。為了避開基因家族和表達(dá)基因的干擾，我們選擇了一段非表達(dá)序列(genbank:fn328142.1)作為靶標(biāo)。

genbank:fn328142.1

由此獲得外部引物對(duì)，f3和b3，以及內(nèi)部向前引物fip(由f1c和f2組成)、內(nèi)部向后引物(由b1c和b2組成)，以及加速引物lf。所有引物的方向都是5’→3’。

大量研究和應(yīng)用結(jié)果表明，沒有環(huán)引物的lamp法是不成功的，其反應(yīng)速度較慢；相反地，加了環(huán)引物的反應(yīng)大大提速(圖1)。圖1中顯示的是中拷貝的樣本中加入lf引物后反應(yīng)效率大大提高。

(注：圖1為本發(fā)明的引物，加lf或不加lf的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1目標(biāo)dna是血吸蟲蟲卵dna陽性對(duì)照。橫坐標(biāo)：時(shí)間(min)；縱坐標(biāo)：圖1-1為軟件計(jì)算相對(duì)值，圖1-2為渾濁度。由儀器檢測獲得。)

圖2中顯示的是本發(fā)明提供的引物組可以對(duì)血吸蟲蟲卵dna進(jìn)行有效擴(kuò)增，加水陰性對(duì)照在延長反應(yīng)時(shí)間后也出現(xiàn)陽性反應(yīng)。

(注：圖2目標(biāo)dna是由不同數(shù)量血吸蟲蟲卵提取總dna或水陰性對(duì)照。橫坐標(biāo)：時(shí)間(min)；縱坐標(biāo)：渾濁度。由儀器檢測獲得。)

實(shí)驗(yàn)例2

靈敏性研究

1)、標(biāo)準(zhǔn)靶dna分子模板的制備

取純化的陽性對(duì)照樣本dna，用te緩沖液進(jìn)行稀釋100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，0.01fg，0.001fg。

2)、環(huán)介導(dǎo)等溫dna擴(kuò)增與結(jié)果判斷

取0.2mlpcr用薄壁管30個(gè)，按實(shí)施例4所述的方法加樣并操作，區(qū)別在于，依次所加dna為上步制備的標(biāo)準(zhǔn)靶dna分子模板(1～9號(hào)管)，多余的一個(gè)管加入5μl去離子水作為陰性對(duì)照(10號(hào)管)。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)

反應(yīng)過程中，在自然光下觀察1～7管之間無差異，都能顯示天藍(lán)色的陽性反應(yīng)。第8、9、10管為淺紫色。說明該方法的敏感性為0.1fg/μldna。

盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。

sequencelisting

<110>南京市疾病預(yù)防控制中心

<120>血吸蟲蟲卵檢測方法及該方法所用的試劑盒和引物

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgacgtcgctttttgatcc19

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctgcggttcctctcgtact19

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtgggtgaacaatccaacgctttcgatgtcggctcttcct40

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agaccgtcgtgagacaggttaggcaacggccagattgtact41

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<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ggtgaattctgcttcacaatga22