本發(fā)明一種肌肉干細(xì)胞的體外高效培養(yǎng)方法，涉及一種包括肌肉組織消化酶，肌肉細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)板包被溶液的通用型肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可以快速獲取并擴(kuò)增肌肉干細(xì)胞，并保持肌肉干細(xì)胞的再生活力的方法。

背景技術(shù)：

肌肉干細(xì)胞，即衛(wèi)星細(xì)胞，是肌肉組織中存在于肌纖維的肌膜與基底膜之間，形態(tài)為小梭形扁平的單個(gè)核細(xì)胞。肌肉干細(xì)胞在肌肉組織受損，肌纖維發(fā)生斷裂的情況下被激活，而后肌肉干細(xì)胞會(huì)大量增值，并且相互融合形成再生型肌纖維，從而補(bǔ)充替代受損肌纖維。肌肉干細(xì)胞的這些功能，是肌肉組織維持穩(wěn)定（homeostasis）和再生（regeneration）的基礎(chǔ)。骨骼肌再生障礙性疾病患者，肌肉干細(xì)胞的功能受損，而且其數(shù)量也下降，從而導(dǎo)致肌肉再生障礙。這類患者的肌肉組織無法維持正常的結(jié)構(gòu)和功能，大量纖維組織代替了正常的肌肉組織，肌肉的正常結(jié)構(gòu)被破壞，肌肉的力量也逐漸下降,從而嚴(yán)重影響患者生活水平，甚至危及生命。骨骼肌再生障礙性疾病是再生醫(yī)學(xué)所針對(duì)的一類典型疾病。這類疾病包括肌肉退行性病、外傷、衰老和癌癥惡液質(zhì)等，影響著廣泛人群。再生醫(yī)學(xué)的目標(biāo)，是恢復(fù)疾病組織和器官的正常功能和再生能力。肌肉干細(xì)胞治療的策略是投放肌肉干細(xì)胞來修復(fù)受損肌肉，進(jìn)而扭轉(zhuǎn)上述疾病過程，甚至治愈疾病。而治療所投放的細(xì)胞需要具備兩個(gè)重要的功能：重建受損的肌肉纖維和補(bǔ)充肌肉內(nèi)干細(xì)胞的數(shù)量。這樣才能實(shí)現(xiàn)恢復(fù)受損組織及其再生能力，也正是再生醫(yī)學(xué)的目的。

此外，以體外組織工程代表的生物技術(shù)，也需要大量的，具有再生能力的肌肉干細(xì)胞，這樣才能生成具有肌肉功能的人工組織，才能使下游工作例如藥物篩選，醫(yī)學(xué)發(fā)育組織學(xué)模型等成為可能。

細(xì)胞來源一直是肌肉組織干細(xì)胞治療的一個(gè)重大問題。治療一塊肌肉通常需要幾千萬到幾億細(xì)胞。這意味著要想獲得如此多的細(xì)胞，細(xì)胞擴(kuò)增是必須的技術(shù)手段。從九十年代至今，已經(jīng)有十?dāng)?shù)個(gè)臨床試驗(yàn)使用這一策略，即獲取肌肉活檢，培養(yǎng)和大規(guī)模增殖肌肉來源的細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞注入患者的肌肉組織。但是，這些臨床研究的一直無法得到顯著的治療效果，無論肌肉組織的結(jié)構(gòu)恢復(fù)還是肌肉力量，都只有不顯著的、似是而非的改善。早期臨床試驗(yàn)的問題一直到最近才被揭示出來。2005和2012 年的幾篇在Science 雜志發(fā)表的研究，已經(jīng)闡明了基本的原因： 肌肉干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中會(huì)迅速失去再生能力，例如在體內(nèi)形成肌肉纖維的能力在5-8天的培養(yǎng)后即接近完全喪失。本來肌肉干細(xì)胞治療是希望注射入患者體內(nèi)的細(xì)胞形成新的肌肉纖維并補(bǔ)充肌肉干細(xì)胞庫，從而達(dá)到重建受損的肌肉組織的目的。 但是已有的臨床試驗(yàn)沒有意識(shí)到一個(gè)問題：即其所使用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)無法保持骨骼肌干細(xì)胞的再生能力。這樣的細(xì)胞注入患者體內(nèi)，自然無法有效產(chǎn)生新的肌肉纖維，自然無法達(dá)到所設(shè)想的治療效果。但直到今天，仍然可以檢索到19 項(xiàng)正在實(shí)施的，使用這種失去功能的細(xì)胞進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。此外，市場上常見的提供肌肉干細(xì)胞的公司仍然在使用這種過時(shí)的，會(huì)使細(xì)胞失去再生能力的培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)細(xì)胞。對(duì)于使用這樣細(xì)胞的科研和臨床用戶，結(jié)果堪憂。

這一現(xiàn)象，顯示了在臨床治療和科研中對(duì)于肌肉干細(xì)胞干性保持方面認(rèn)識(shí)上的不足，代表了肌肉再生醫(yī)學(xué)所必須面對(duì)和解決的一個(gè)重要問題。本發(fā)明即是為解決這一問題，為多種肌肉研究和臨床應(yīng)用提供再生功能有保障的肌肉干細(xì)胞。體外的肌肉誘導(dǎo)分化使用同細(xì)胞培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基。細(xì)胞生長至高聚合度后開始自然分化，形成多個(gè)核的肌管結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)基廣泛使用的肌肉培養(yǎng)方法例如Rando (1994)的方法，通常利用細(xì)胞貼壁能力的差異來提高肌肉前體細(xì)胞在培養(yǎng)中的純度，并且使用bFGF來維持肌肉前體細(xì)胞的性狀。我們發(fā)現(xiàn)上述的方法對(duì)于細(xì)胞干性的保持是有疑問的，例如上述這些方法無法保持細(xì)胞的Pax7表達(dá)，而這一蛋白是保持肌肉細(xì)胞體內(nèi)外再生功能必不可少的。我們改變了培養(yǎng)方法，具體而言，培養(yǎng)基中含雞胚提取物，培養(yǎng)板也使用膠原蛋白包被。這一創(chuàng)新使得培養(yǎng)的細(xì)胞保持Pax7表達(dá)，并且在體外可以穩(wěn)定形成肌管，體內(nèi)可以形成再生型肌肉纖維。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一種肌肉干細(xì)胞的體外高效培養(yǎng)方法提供了一種小鼠肌肉干細(xì)胞的制備方法，采用該方法，可方便快捷地獲得大量的小鼠肌肉干細(xì)胞。這些細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)肌肉干細(xì)胞標(biāo)志物Pax7，保持體內(nèi)體外再生活力，可以用于廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，包括但不局限于細(xì)胞治療、組織工程、藥物篩選，以及肌肉發(fā)育和分子生物學(xué)研究。

本發(fā)明一種肌肉干細(xì)胞的體外高效培養(yǎng)方法，包括下列步驟：①將離體并剪碎的小鼠肢體骨骼肌加入組織消化液，在37°C孵育2小時(shí), 1000rpm離心5min,去上清,得經(jīng)消化解離的組織和細(xì)胞；②經(jīng)消化的組織按體積比1:10加入血清以終止酶消化；1000rpm離心5min,去上清；③經(jīng)消化的組織置于膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，并加肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37℃，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；④當(dāng)肌肉干細(xì)胞生長到70-80%豐度時(shí)，收獲細(xì)胞，用于細(xì)胞傳代或下游應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述組織消化液由0.2%I型膠原酶溶解于無血清DMEM培養(yǎng)基，肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基由DMEM，20%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，1% 雞胚提取物組成。

所述膠原蛋白包被液含 5 mg/ml I型鼠尾膠原蛋白。

所述原代肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方法是:在385 ml DMEM中加入100 ml FBS, 5 ml 青霉素和鏈霉素，10 ml 雞胚提取物組成。混勻，無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。

所述I型膠原酶溶液使用無血清DMEM培養(yǎng)基為溶劑，優(yōu)選的pH=7.5-7.8。

本發(fā)明所公開的方法適用于從正常野生型小鼠、基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中分離和分化肌肉干細(xì)胞。

本發(fā)明中所使用的小鼠為成年的8-12周小鼠。

通過本發(fā)明技術(shù)可以得到較純的小鼠肌肉干細(xì)胞，并表達(dá)肌肉干細(xì)胞標(biāo)志物Pax7。此外，細(xì)胞還表達(dá)肌肉系轉(zhuǎn)錄因子Myf-5,MyoD;細(xì)胞分化成肌管后穩(wěn)定表達(dá)特征性的肌肉結(jié)構(gòu)蛋白Desmin。

本發(fā)明能夠分離和培養(yǎng)較純的小鼠肌肉干細(xì)胞，其中Pax7陽性表達(dá)的細(xì)胞占50%以上；能夠分離到的細(xì)胞生長旺盛，能夠在體外誘導(dǎo)分化化形成大量典型的肌管；能夠分離到的細(xì)胞生長旺盛 ，能夠在體內(nèi)形成大量典型的再生型肌肉纖維。

附圖說明

圖1 本發(fā)明培養(yǎng)的Pax7轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)的肌肉干細(xì)胞：a是紅色熒光標(biāo)記（Pax7-TexRed）的Pax7；b是藍(lán)色熒光標(biāo)記（DAPI）的細(xì)胞核；c是光鏡（phase）標(biāo)尺，標(biāo)尺=100μm。

圖2 肌肉干細(xì)胞標(biāo)志物Pax7和Myf-5在所培養(yǎng)細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)：A. 本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)骨骼肌干細(xì)胞標(biāo)記物Pax7，Pax7使用紅色熒光標(biāo)記（Pax7-TexRed），細(xì)胞核使用藍(lán)色熒光標(biāo)記（DAPI），本圖中所示的肌肉干細(xì)胞來自GFP熒光小鼠，所有細(xì)胞組成型地表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）；B. 本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)骨骼肌干細(xì)胞標(biāo)記物Myf-5，Myf5蛋白使用紅色熒光標(biāo)記（Myf5-TexRed），細(xì)胞核使用藍(lán)色熒光標(biāo)記（DAPI），Myf5陽性細(xì)胞核顯示為粉色。標(biāo)尺=100μm。

圖3 體外肌肉再生能力鑒定結(jié)果：A. 本發(fā)明培養(yǎng)的骨骼肌前體細(xì)胞在分化條件下形成典型的肌管結(jié)構(gòu)；B. 本發(fā)明培養(yǎng)的骨骼肌前體細(xì)胞在分化條件下高表達(dá)骨骼肌成熟分化標(biāo)志性蛋白Desmin, Desmin使用紅色熒光標(biāo)記（Desmin-TexRed），細(xì)胞核使用藍(lán)色熒光標(biāo)記（DAPI）；C. 肌管Desmin染色的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)，可見典型的肌節(jié)（sacomere）和Z-band結(jié)構(gòu)的形成，圖中所示結(jié)果來自于第十代（Passage 10）培養(yǎng)的骨骼肌干細(xì)胞。標(biāo)尺=100μm。

圖4 體內(nèi)移植后肌纖維再生能力結(jié)果：A. 來自綠色熒光蛋白（GFP）組成型表達(dá)小鼠的肌肉干細(xì)胞注射到裸鼠受損肌肉內(nèi)，四周后可以在受體肌肉內(nèi)檢測到的大量GFP陽性肌肉纖維，受體的肌肉纖維為GFP陰性；B. GFP免疫組化染色，顯示相同的GFP陽性肌肉纖維的分布模式，以及再生肌肉纖維所具有的特征性的中心性細(xì)胞核。 標(biāo)尺=100μm。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1.試劑配方和配制方法：

培養(yǎng)基組織消化液組成是0.2%I型膠原酶余量為無血清DMEM培養(yǎng)基，pH=7.5-7.8;肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基由DMEM，20%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，1% 雞胚提取物組成。膠原蛋白包被液含 5 mg/ml I型鼠尾膠原蛋白。DMEM都是商品化的培養(yǎng)基。

組織消化液的配制方法是:稱量0.1克I型膠原酶，充分溶解于50毫升無血清DMEM培養(yǎng)基中，使用無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。

原代肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方法是：在385 ml DMEM中 加入100 ml FBS, 5 ml 青霉素和鏈霉素，10 ml 雞胚提取物組成。無菌濾膜過濾，濾液保存在4胚提。

實(shí)施例2.小鼠肌肉干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：

在無菌超凈臺(tái)中將新鮮獲取的8-12周成年小鼠四肢肌肉剪碎。而后加入組織消化液 8 ml 消化液用于每克組織，在37°C孵育2小時(shí)， 1000rpm離心5min,去上清，得經(jīng)消化解離的組織和細(xì)胞；經(jīng)消化的組織按體積比1:10加入血清以終止酶消化；1000rpm離心5min,去上清。經(jīng)消化的組織置于膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，并加肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5天后， 當(dāng)肌肉干細(xì)胞生長到70-80%豐度時(shí)，收獲細(xì)胞，用于細(xì)胞傳代或下游應(yīng)用，例如體外肌管形成或者細(xì)胞治療。

通過本發(fā)明技術(shù)可以得到較純的小鼠肌肉干細(xì)胞。Pax7是肌肉細(xì)胞特征性的標(biāo)志蛋白，我們用該標(biāo)志蛋白鑒定細(xì)胞培養(yǎng)的純度。

實(shí)施例3.小鼠肌肉干細(xì)胞的維持和保存：

體外培養(yǎng)的小鼠肌肉干細(xì)胞可以直接加90%胎牛血清和10%二甲基亞砜DMSO組成的細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞在液氮中。

細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)細(xì)胞聚合度超過80%后，細(xì)胞會(huì)發(fā)生自發(fā)分化并形成肌管。所以當(dāng)擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)，要在細(xì)胞聚合度60-70% 時(shí)及時(shí)傳代，以免細(xì)胞過度分化。

實(shí)施例4小鼠肌肉干細(xì)胞的分化：

以5000細(xì)胞每平方厘米的接種密度，將細(xì)胞接種于I型膠原蛋白包被的培養(yǎng)板。培養(yǎng)基體積為每5000細(xì)胞給予1 ml，肌管形成過程中無需更換培養(yǎng)基。細(xì)胞將繼續(xù)增值至高聚合度，并且開始分化，形成多個(gè)細(xì)胞核的肌管結(jié)構(gòu)。肌管形成通常在接種后7-14 天達(dá)到高峰。

實(shí)施例5.肌肉干細(xì)胞治療：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：野生型C57小鼠，GFP轉(zhuǎn)基因鼠以及裸鼠和由本研究室飼養(yǎng)。

抗體和其它試劑：Pax7, Pax3,Myogenin (Developmental Studies Hybridoma Bank)； Laminin (C-20) (Sigma)； Laminin (Abcam), MyoD (C-20), Desmin (RD301), and GFP (FL) (Santa Cruz). DMEM胎牛血清,青霉素和鏈霉素購自HyClone公司，膠原酶(collagenase type I)購自Worthington Biochemical公司，鼠尾膠原(collagen type I)購自BD公司。

肌肉損傷模型：取8-12 周裸鼠，經(jīng)全身麻醉后，將30 ul (0.03 mg/ml）Naja mossambica cardiotoxin (Sigma)注射到小鼠脛前?。═A）中。一天后，將20 ul，內(nèi)有1X105個(gè)來源于GFP轉(zhuǎn)基因鼠的經(jīng)培養(yǎng)的肌肉干細(xì)胞注射到同一肌肉中。四周后處死實(shí)驗(yàn)小鼠并收集肌肉用于組織學(xué)分析。

實(shí)施例6細(xì)胞治療的肌肉組織學(xué)分析：

經(jīng)細(xì)胞注射的TA組織收集后立即置于組織冰凍切片溶液Optimal Cutting Temperature compound (Tissue-Tek)，并于液氮中速凍。而后冰凍組織用來制備8 um 厚冰凍切片。切片于-20 C 保存。切片直接置于熒光顯微鏡下觀察，以發(fā)現(xiàn)GFP陽性的肌肉纖維，代表著移植的細(xì)胞在宿主體內(nèi)生成了再生型的肌肉纖維。GFP在509nm 具有特征性峰值的信號(hào)，區(qū)別于肌肉組織的背景熒光，可以被具有窄譜濾鏡的熒光顯微鏡采集，例如具有SEMROCK濾鏡的Olypus VS110顯微鏡系統(tǒng)。

上述應(yīng)用實(shí)例結(jié)果顯示，本發(fā)明所得到的小鼠肌肉干細(xì)胞具備顯著的體內(nèi)外再生能力，表現(xiàn)為在體外可以穩(wěn)定形成肌管結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)能夠形成再生型的肌肉纖維。這些結(jié)果表明使用本發(fā)明獲取的小鼠肌肉細(xì)胞可以達(dá)到多種應(yīng)用的要求，包括組織工程，藥物篩選，肌肉發(fā)育研究以及細(xì)胞治療。