本發(fā)明涉及育種方法，具體地說(shuō)，涉及一種紅麻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法。

背景技術(shù)：

紅麻又稱“洋麻”，是錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維作物。因其在長(zhǎng)江流域及其以北地區(qū)不能自然留種，北方麻區(qū)每年要從華南地區(qū)引入大量種子。紅麻表現(xiàn)出強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì)，其雜種優(yōu)勢(shì)率高達(dá)35％-40％。長(zhǎng)期以來(lái)，紅麻雜種優(yōu)勢(shì)利用是國(guó)內(nèi)外紅麻育種的主攻目標(biāo)。

但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由單一細(xì)胞質(zhì)雄性不育系組配的雜交種在生產(chǎn)中的大面積推廣和長(zhǎng)期利用可能成為某一病害生理小種的哺育品種，從而存在某一病害大流行的風(fēng)險(xiǎn)。解決這一問(wèn)題的基本途徑是獲得多種細(xì)胞質(zhì)來(lái)源的雄性不育系，而不同細(xì)胞質(zhì)來(lái)源的雄性不育系的選育源于細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)的遺傳多樣性。但迄今為止，植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)一般源于自然突變或采用遠(yuǎn)緣雜交的方法獲得，而自然突變幾率很低，遠(yuǎn)緣雜交又難以成功，因此，許多作物因雄性不育種質(zhì)的缺乏至今尚未選育出細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。若能采用轉(zhuǎn)雄性不育相關(guān)基因的方法創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)將具有極重要的科學(xué)意義和廣闊的利用前景。

申請(qǐng)人團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于植物雄性不育種質(zhì)創(chuàng)新及其分子基礎(chǔ)的研究工作。2008年，周瑞陽(yáng)指導(dǎo)的博士研究生李剛采用同重標(biāo)簽相對(duì)定量與絕對(duì)定量(簡(jiǎn)稱itraq)技術(shù)分析了紅麻雄性不育系和保持系花藥線粒體蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)差異表達(dá)的pdil(proteindisulfideisomerase-like，類蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，縮寫(xiě)為“pdil”)蛋白。該蛋白質(zhì)部分氨基酸殘基的同源比對(duì)表明，它與atpdil5-2、ospdil5-2和ospdil5-3直系同源。2010年，周瑞陽(yáng)指導(dǎo)的另一位博士研究生金剛在此基礎(chǔ)上，根據(jù)genbank中公布的ospdil5-2、ospdil5-3、atpdil5-2及其他同源基因的cdna序列，基于同源克隆和race技術(shù)，克隆了兩個(gè)紅麻pdil同源基因，并通過(guò)全長(zhǎng)cdna的擴(kuò)增加以驗(yàn)證。兩個(gè)基因分別命名為hcpdil5-2a和hcpdil5-2b，在ncbi基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)分別為hq638208和hq898859。同時(shí)，這兩個(gè)基因在不育系開(kāi)花期的不同組織器官的表達(dá)量存在差異，其中hcpdil5-2a在各組織的表達(dá)均受到不育胞質(zhì)的影響，而hcpdil5-2b的表達(dá)僅在營(yíng)養(yǎng)器官中受到不育胞質(zhì)的影響。說(shuō)明hcpdil5-2a可能與雄性不育有關(guān)。但與雄性不育可能有關(guān)與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的創(chuàng)制是兩個(gè)完全不同的問(wèn)題。

經(jīng)過(guò)多年的探索性研究發(fā)現(xiàn)，采用花粉管通道法轉(zhuǎn)紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因，成功創(chuàng)造出了紅麻細(xì)胞核雄性不育種質(zhì)，繼而轉(zhuǎn)育成紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。對(duì)此，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種紅麻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種紅麻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法，包括如下步驟：

s1、構(gòu)建可超量表達(dá)目標(biāo)基因的重組表達(dá)載體；目標(biāo)基因如seqidno.1所示；

s2、將上述重組表達(dá)載體采用花粉管通道法導(dǎo)入紅麻中，收獲t0代種子；

s3、播種上述t0代種子獲得t1代植株，在t1代植株中篩選出花藥不開(kāi)裂的轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)hms株；

s4、將上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)與非轉(zhuǎn)基因的野生型雜交，獲得f1代植株；

s5、將表現(xiàn)可育的f1代植株與穩(wěn)定表現(xiàn)雄性不育的hms株測(cè)交，建立雄性不育株與可育株長(zhǎng)期保持1:1分離的永久分離群體；

所述穩(wěn)定表現(xiàn)雄性不育的hms株為s3中在海南和南寧種植均表現(xiàn)雄性不育的轉(zhuǎn)基因雄性不育株；

s6、以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)hms株或s5所述永久分離群體中的雄性不育株為母本，與異源保持系雜交，并進(jìn)行核置換回交；即可獲得質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；

s7、以s6中質(zhì)核異源雄性不育系選育過(guò)程中任一世代的雄性不育株為母本，以非轉(zhuǎn)基因的野生型品種/系為父本，進(jìn)行核置換回交，即可選育出質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；

此后，還可以選育得到的質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系或選育得到的質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為細(xì)胞質(zhì)供體，與新的同源或異源保持系進(jìn)行核置換回交，又可選育出新的質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系或質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

需要說(shuō)明的是，同源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料為同一來(lái)源的非轉(zhuǎn)基因野生型保持系或品種(系)；異源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料沒(méi)有親緣關(guān)系的雄性不育保持系或常規(guī)品種(系)。

作為優(yōu)選，s2中，將重組表達(dá)載體采用花粉管通道法導(dǎo)入紅麻保持系722b中。該紅麻品種722b為廣西大學(xué)周瑞陽(yáng)選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系；原始品種來(lái)源見(jiàn)：桂科鑒字第[2007]177號(hào)。

作為優(yōu)選，所述重組表達(dá)載體含有camv35s啟動(dòng)子，用于使所述基因序列超量表達(dá)。

作為優(yōu)選，在回交的同時(shí)，與多個(gè)栽培品種測(cè)定配合力，每個(gè)世代選擇配合力高、性狀與父本相似，且花藥不開(kāi)裂的雄性不育株繼續(xù)回交，同時(shí)父本套袋自交，回交不低于5～6代。

作為優(yōu)選，所述異型保持系為722b以外的保持系或品種(系)，例如p3b、f3b、763b、k03b、l23b或917b等。

本發(fā)明涉及到的原料均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實(shí)施方式。

更為具體地，本發(fā)明所述方法涉及步驟如下：

1、目標(biāo)基因序列：

以紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因?yàn)槟繕?biāo)基因。hcpdil5-2a基因orf序列長(zhǎng)度為1268bp(不包括終止密碼子)，用于構(gòu)建超量表達(dá)載體的orf序列長(zhǎng)度為960bp(不包括終止密碼子)，二者相差308bp。故目標(biāo)基因?yàn)榉侨L(zhǎng)hcpdil5-2a基因，其具體序列如seqidno.1所示。

2、目標(biāo)基因的擴(kuò)增：

提取紅麻發(fā)育花藥中總rna，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cdna第一鏈；然后根據(jù)cdna序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)xbai、kpni特異引物對(duì)hcpdil5-2a-ty，通過(guò)rt-pcr方法擴(kuò)增紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因。

所述特異引物對(duì)hcpdil5-2a-ty包括：

正向引物：5’-tctagaatgttgctgttctcgatcttga-3’；

反向引物：5’-ggtacctcaatcttctttcttctcaggtcta-3’。

其中，所述pcr的反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)體系用雙蒸水補(bǔ)足到總體積20μl。

其中，pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，然后94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10min。

利用天根凝膠回收試劑盒回收上述片段后，將其連入pmd-19t(simple)載體(從寶生物工程有限公司購(gòu)得)中，構(gòu)建成測(cè)序中間載體，稱為非全長(zhǎng)phcpdil5-2a，然后用該載體進(jìn)行基因擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證，最后進(jìn)行序列測(cè)定，驗(yàn)證克隆序列的正確性。

3、重組表達(dá)載體pbi121-hcpdil5-2a-gfp的構(gòu)建：

將上述步驟2中獲得的含有非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因編碼區(qū)cdna的phcpdil5-2a中間測(cè)序載體經(jīng)過(guò)xbai和kpni雙酶切后獲得帶有酶切粘性末端的非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因片段。pbi121-gfp載體也用同樣的xbai和kpni雙酶切，回收帶有camv35s啟動(dòng)子的載體片段。將非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因片段與載體片段用連接酶連接，得到以camv35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因的植物超量表達(dá)載體，稱為pbi121-hcpdil5-2a-gfp。

植物表達(dá)載體pbi121-gfp可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)，也可以自行構(gòu)建。

4、目標(biāo)基因植物重組表達(dá)載體導(dǎo)入：

采用花粉管通道法進(jìn)行。

其具體步驟是：

(1)選株：選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的紅麻植株，將次日要開(kāi)放的花蕾，用嫁接用塑料夾子將花蕾頂部夾住或使用棉線等將花蕾頂部扎緊使其不能正常開(kāi)放，以防外來(lái)花粉污染；

(2)自花授粉：花開(kāi)之日早上6:00，取掉塑料夾子或松開(kāi)棉線，用衛(wèi)生紙蘸取花粉涂抹到柱頭上使其自交，然后繼續(xù)用塑料夾子夾住花瓣或用棉線等捆扎花瓣，繼續(xù)防止外來(lái)花粉污染；

(3)微量注射重組表達(dá)載體：自花授粉3-5小時(shí)后即可形成花粉管通道，此時(shí)即可去掉塑料夾子或棉線等捆扎物，使花瓣張開(kāi)，同時(shí)用經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒處理過(guò)的微量進(jìn)樣器吸取pbi121-hcpdil5-2a-gfp植物表達(dá)載體質(zhì)粒10μl，將針頭沿著花粉管插入至子房中，并將質(zhì)粒注入子房中即完成超表達(dá)載體的微量注射。

(4)收獲：待上述注射pbi121-hcpdil5-2a-gfp植物表達(dá)載體質(zhì)粒的果實(shí)自然成熟后，單株上的同類種子合并編號(hào)，即獲得t0代種子。

5、轉(zhuǎn)基因紅麻細(xì)胞核雄性不育種質(zhì)的獲得：

播種上述t0代種子即獲得t1代植株，于開(kāi)花期調(diào)查t1代植株育性，如花藥不能開(kāi)裂即為雄性不育株，計(jì)算雄性不育株與總植株數(shù)的比率，并檢測(cè)目標(biāo)基因是否導(dǎo)入雄性不育株中，對(duì)于已經(jīng)導(dǎo)入目標(biāo)基因的雄性不育株，命名為hms株。而對(duì)于未檢測(cè)到目標(biāo)基因的雄性不育株，可能是其它原因?qū)е碌男坌圆挥?，不作進(jìn)一步的分析。

6、紅麻轉(zhuǎn)基因細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育

(1)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核雄性不育系的選育：hms植株與非轉(zhuǎn)基因的野生型雜交f1代在南寧春播或者夏播，在秋季開(kāi)花，表現(xiàn)正?？捎?，說(shuō)明目標(biāo)基因所致的雄性不育性在南寧表現(xiàn)隱性性狀；但hms株是在海南冬繁的t1代發(fā)現(xiàn)的，說(shuō)明目標(biāo)基因在海南冬季短日和相對(duì)低溫(相對(duì)于南寧秋季的氣溫較低)條件下表現(xiàn)顯性性狀，目標(biāo)基因的雄性不育性對(duì)溫度或日長(zhǎng)敏感。但在海南冬繁條件下，hms株的表現(xiàn)有3種類型：(1)穩(wěn)定型hms株：穩(wěn)定表現(xiàn)雄性不育，環(huán)剝不能恢復(fù)其育性；(2)環(huán)剝恢復(fù)型hms株：在海南表現(xiàn)雄性不育，但環(huán)剝可使其育性恢復(fù)，可實(shí)現(xiàn)自交純合；(3)自然恢復(fù)型hms株：海南開(kāi)花前期表現(xiàn)雄性不育，但隨著海南氣溫的升高，開(kāi)花后期自然恢復(fù)可育。由此表明hms的光溫敏感性由多個(gè)基因控制，選擇海南和南寧均表現(xiàn)雄性不育的hms株是完全可能的。根據(jù)這一特性，將上述南寧表現(xiàn)可育的(hms株與非轉(zhuǎn)基因的野生型雜交)f1代與穩(wěn)定表現(xiàn)雄性不育的hms株測(cè)交，其后代表現(xiàn)可育株與不育株1:1分離；將該世代中可育株(基因型為雜合體)與不育株雜交，其后代仍然表現(xiàn)可育株與不育株為1:1分離。此后，將這種1:1分離世代在隔離區(qū)自由授粉，從不育株上收獲種子播種，即可建立雄性不育株與可育株長(zhǎng)期保持1:1的永久分離群體。

(2)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育：將上述永久分離群體中的不育株與異型保持系(與轉(zhuǎn)基因材料沒(méi)有親緣關(guān)系的雄性不育保持系)雜交，并與異型保持系核置換回交，即可獲得具有hms株細(xì)胞質(zhì)、異型保持系細(xì)胞核的雄性不育系，異型保持系即為該不育系的保持系。由于該類型不育系的細(xì)胞質(zhì)源于轉(zhuǎn)基因創(chuàng)造的雄性不育細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核源于轉(zhuǎn)基因供體材料以外的異型保持系，其質(zhì)核來(lái)源不同，故稱為質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

(3)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法：以上述永久分離群體中的不育株與同型保持系雜交或任一回交后代中的雄性不育株為母本，與轉(zhuǎn)基因雄性不育株為同一品種來(lái)源的品種/系為父本，進(jìn)行飽和回交。其回交父本即為雄性不育保持系。由此選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，因其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均源于同一品種，故為質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

本發(fā)明過(guò)了長(zhǎng)達(dá)7年的探索性研究，付出了巨大的創(chuàng)新性勞動(dòng)。其創(chuàng)造性在于，采用轉(zhuǎn)基因方法細(xì)胞核雄性不育種質(zhì)，繼而與異性保持系進(jìn)行核置換回交，選育出質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；在此基礎(chǔ)上又與同源保持系進(jìn)行核置換回交，選育出質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明所得雄性不育系的細(xì)胞核源于非轉(zhuǎn)基因的保持系或品種(系)，因而不含轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，與非轉(zhuǎn)基因植物無(wú)異，不存在安全風(fēng)險(xiǎn)和市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)；所得雄性不育系的細(xì)胞質(zhì)源于栽培品種(系)，有利于組配出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合；由此可創(chuàng)造出多種細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)，從而避免了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上由于單一細(xì)胞質(zhì)雜交種的大面積推廣和長(zhǎng)期利用可能導(dǎo)致的某一病害大流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)，具有極為廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明超量表達(dá)載體pbi121-hcpdil5-2a-gfp的構(gòu)建過(guò)程。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1超量表達(dá)載體pbi121-hcpdil5-2a-gfp的構(gòu)建

1、目標(biāo)基因序列：

以紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因?yàn)槟繕?biāo)基因。hcpdil5-2a基因orf序列長(zhǎng)度為1268bp(不包括終止密碼子)，用于構(gòu)建超量表達(dá)載體orf序列長(zhǎng)度為960bp(不包括終止密碼子)，二者相差380bp。故目標(biāo)基因?yàn)榉侨L(zhǎng)hcpdil5-2a基因，其具體序列如seqidno.1所示。

2、目標(biāo)基因的擴(kuò)增：

提取紅麻發(fā)育花藥中總rna，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cdna第一鏈；然后根據(jù)cdna序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)xbai、kpni特異引物對(duì)hcpdil5-2a-ty，通過(guò)rt-pcr方法擴(kuò)增紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因。

所述特異引物對(duì)hcpdil5-2a-ty包括：

正向引物：5’-tctagaatgttgctgttctcgatcttga-3’；

反向引物：5’-ggtacctcaatcttctttcttctcaggtcta-3’。

其中，所述pcr的反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)體系用雙蒸水補(bǔ)足到總體積20μl。

其中，pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，然后94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10min。

利用天根凝膠回收試劑盒回收上述片段后，將其連入pmd-19t(simple)載體(從寶生物工程有限公司購(gòu)得)中，構(gòu)建成測(cè)序中間載體，稱為非全長(zhǎng)phcpdil5-2a，然后用該載體進(jìn)行基因擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證，最后進(jìn)行序列測(cè)定，驗(yàn)證克隆序列的正確性。

3、超量表達(dá)載體pbi121-hcpdil5-2a-gfp的構(gòu)建：

由步驟1所述紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因的開(kāi)放閱讀框序列與植物表達(dá)載體pbi121構(gòu)建而成。其具體方法是：

上述步驟2中獲得的含有非全長(zhǎng)hcpdil5-2a編碼區(qū)cdna的phcpdil5-2a中間測(cè)序載體經(jīng)過(guò)xbai和kpni雙酶切后獲得帶有酶切粘性末端的非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因片段。pbi121-gfp載體也用同樣的xbai和kpni雙酶切，回收帶有camv35s啟動(dòng)子的載體片段。將非全長(zhǎng)hcpdil5-2a基因片段與載體片段用連接酶連接，得到以camv35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的紅麻非全長(zhǎng)hcpdil5-2a的植物超量表達(dá)載體，稱為pbi121-hcpdil5-2a-gfp。

實(shí)施例2紅麻轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)資源的獲得

2010年10月，以紅麻品種722b(廣西大學(xué)周瑞陽(yáng)選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系；原始品種來(lái)源見(jiàn)：桂科鑒字第[2007]177號(hào))為材料，按照本發(fā)明的方法，于開(kāi)花期用微量注射器將實(shí)施例1制備的超量表達(dá)載體pbi121-hcpdil5-2a-gfp注入供試材料子房中。2011年4月，在海南冬繁的t1代群體中發(fā)現(xiàn)12株花藥不開(kāi)裂，即為雄性不育株。分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中2株已導(dǎo)入目標(biāo)基因，命名為hms1、hms2，即為轉(zhuǎn)基因紅麻雄性不育種質(zhì)。

實(shí)施例3紅麻轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核雄性不育系的構(gòu)建

以上述hms1、hms2為母本與非轉(zhuǎn)基因的722雜交，形成hms1/722f0:1和hms2/722f0:1種子。然后，根據(jù)hms株的育性表現(xiàn)特征，采用海南環(huán)剝的方法恢復(fù)hms育性，實(shí)現(xiàn)了hms株的育性分離和自交純合，選育出了海南和南寧穩(wěn)定表現(xiàn)雄性不育的hms株。此后，將(hms1/非轉(zhuǎn)基因野生型722b)和(hms2/非轉(zhuǎn)基因野生型722b)雜交f1代與穩(wěn)定性hms株測(cè)交，按照本發(fā)明步驟6中的方法分別建立hms1和hms2雄性不育株/雄性可育株為1:1永久分離群體。分子鑒定表明，hms1和hms2植株及其后代永久分離群體中的雄性不育株，均已導(dǎo)入目標(biāo)基因，表現(xiàn)為雄性不育性與目標(biāo)基因共分離。

實(shí)施例4紅麻轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的創(chuàng)制

2012年10月，分別以上述hms1和hms2永久分離群體中的不育株為母本，以異源保持系p3b、f3b、763b、k03b、l23b、917b(均為廣西大學(xué)周瑞陽(yáng)選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系；原始品種來(lái)源見(jiàn)：桂科鑒字第[2007]177號(hào))為父本雜交，其雜交f1代所有植株均表現(xiàn)為雄性不育，表明其為細(xì)胞質(zhì)遺傳的雄性不育；此后，按照本發(fā)明步驟6中的方法(2)進(jìn)行核置換回交，在回交世代中，與恢復(fù)系福紅992(引自福建農(nóng)林大學(xué))測(cè)定配合力，并選育性狀與父本相似、花藥不開(kāi)裂且配合力高的株系繼續(xù)與父本回交，于2015年10月選育出了具有hms1和hms2細(xì)胞質(zhì)，具有p3b、f3b、763b、k03b、l23b、917b細(xì)胞核的質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其相應(yīng)的輪回親本即為該不育系的保持系。

實(shí)施例5紅麻轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的創(chuàng)制

2013年10月，以實(shí)施例4中所述hms1、hms2永久分離群體中不育株與異源保持系雜交f1代表現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育的植株為母本，以非轉(zhuǎn)基因的野生型722b為父本，其雜交后代所有植株均表現(xiàn)為雄性不育，表明其細(xì)胞核遺傳的雄性不育性經(jīng)過(guò)與異源保持系雜交之后已轉(zhuǎn)換為細(xì)胞質(zhì)雄性不育；此后，以此類雄性不育株為母本，繼續(xù)與非轉(zhuǎn)基因的野生型722b進(jìn)行核置換回交，在回交世代中，與恢復(fù)系福紅992(引自福建農(nóng)林大學(xué))測(cè)定配合力，并選育性狀與父本相似、花藥不開(kāi)裂且配合力高的株系繼續(xù)與父本回交，于2016年10月選育出了具有hms1和hms2細(xì)胞質(zhì)、722b細(xì)胞核的質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

此后，還可以實(shí)施例4中選育的質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系或?qū)嵤├?中選育的質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為細(xì)胞質(zhì)供體，與新的同源或異源保持系進(jìn)行核置換回交，又可選育出新的質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系或質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

分子鑒定表明，由此選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系不存在載體質(zhì)粒序列，這是因?yàn)檩喕赜H本為非轉(zhuǎn)基因保持系，原有hms1和hms2的細(xì)胞核已被輪回親本置換所致。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>廣西大學(xué)

<120>一種紅麻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法

<130>khp161119323.4

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>960

<212>dna

<213>hcpdil5-2a

<400>1

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