本發(fā)明涉及螯合物及其含片的制備方法，具體為一種L-茶氨酸硒螯合物及制備方法和含該螯合物的含片及制備方法。

背景技術(shù)：

硒是生物體內(nèi)必需的營養(yǎng)元素之一。人體缺硒會造成重要器官的功能失調(diào)，導(dǎo)致許多嚴(yán)重疾病的發(fā)生。硒可以清除體內(nèi)自由基，抗衰老；加入損傷心肌的修復(fù)，預(yù)防和治療肝、腎、哮喘、妊娠高血壓等病；對鉛、鎘、汞、砷、鉈等重金屬有拮抗作用，可減輕上述化學(xué)物質(zhì)對人體的危害；有“抗癌之王”的美稱，能明顯抑制腫瘤擴(kuò)展；維護(hù)白血球活性，是一種免疫效用增強(qiáng)劑。因此，堅持適量補(bǔ)硒，是增強(qiáng)人體健康、防備疾病、延年益壽的有效辦法。目前市場上補(bǔ)硒保健品主要分為無機(jī)硒(亞硒酸鈉)、有機(jī)硒(硒酵母)、納米硒。上海四通納米技術(shù)港有限公司出產(chǎn)的“硒旺膠囊”是目前市場上唯一通過國家認(rèn)定，獲衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“納米硒”產(chǎn)品，比傳統(tǒng)無機(jī)硒(亞硒酸鈉)、有機(jī)硒(硒酵母)的生物活性高5-7倍，同時又它具有無機(jī)硒、有機(jī)硒沒有的低毒性，但生產(chǎn)成本高，難以在市場上推廣。硒酵母在體內(nèi)轉(zhuǎn)化率非常低，不能滿足補(bǔ)硒人群的硒需求而且氣味比較大。

茶氨酸(L-Theanine)是茶葉中含量最高的游離氨基酸，約占游離氨基酸總量的50％以上，占茶葉干重的1％-2％。茶氨酸為白色針狀體，易溶于水。具有甜味和鮮爽味，是茶葉的滋味的組分。茶氨酸含量約為新茶的1～2％左右，其含量隨發(fā)酵過程減少。茶氨酸本身還具有許多生理功能：(1)能影響腦內(nèi)神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)的變化，增強(qiáng)記憶力；(2)有鎮(zhèn)靜作用，可預(yù)防神經(jīng)失調(diào)癥、失眠癥、經(jīng)期綜合癥等；(3)能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，可用于對腦栓塞、腦出血、腦中風(fēng)、腦缺血以及老年癡呆等疾病的防治；(4)有降血壓作用；(5)能增強(qiáng)抗癌藥物的療效；(6)能抑制癌細(xì)胞的漫潤；(7)能提高免疫力。1964年，日本批準(zhǔn)了L-茶氨酸為食品添加劑使用，而美國FDA也在1985年給予了L-茶氨酸GRAS的分類，意味著可以自由地用于各種食品中。茶氨酸在中國研究進(jìn)展比較慢，直到2014年7月18日，衛(wèi)計委終于批準(zhǔn)了它作為新食品原料。

早在六七十年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氨基酸和小肽具有促進(jìn)鈣、鐵、鋅等金屬離子吸收的作用，而且氨基酸和肽的金屬復(fù)合體的生物學(xué)利用率比無機(jī)鹽高，且無毒副作用。因此，開發(fā)兼具茶氨酸多種生理功能和微量元素高生物學(xué)利用率的的多肽螯合硒保健品具有重要意義。無論是單一氨基酸還是用蛋白質(zhì)水解得到的復(fù)合氨基酸，當(dāng)其與金屬離子螯合時，螯合工藝大致相同，主要有：水體系合成法、微波固相法、室溫固相法及電解合成法。水體系合成法工藝周期長，螯合反應(yīng)溫度和pH較難控制，易被廢液污染，但產(chǎn)率較高。此工藝是氨基酸螯合微肥生產(chǎn)較為理想的選擇。微波固相法合成操作簡便省時，制得產(chǎn)品純度較高，但易產(chǎn)生副產(chǎn)物且在微波下易焦糊，很難大規(guī)模生產(chǎn)。室溫固相法主要用于納米材料的合成，對螯合原料純度要求較高。電解合成法昂貴又費(fèi)時。目前國內(nèi)外研究較多的是谷氨酸硒、蛋氨酸硒等，而對于L-茶氨酸與硒離子的螯合物幾乎沒有相關(guān)報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種L-茶氨酸硒螯合物及制備方法和含該螯合物的含片及制備方法，生產(chǎn)成本較低，不受資源限制，環(huán)境污染小，可大量生產(chǎn)且產(chǎn)品比較安全。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種L-茶氨酸硒螯合物的制備方法，以L-茶氨酸和硒鹽為原料，以pH值為7-10的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在70-90℃下混合，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液分離純化，獲得L-茶氨酸硒螯合物；所述L-茶氨酸與硒鹽溶液質(zhì)量比為(3-1)：1；所述的L-茶氨酸由枯草芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，以L-谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽為底物發(fā)酵制備得到。

優(yōu)選的，所述L-茶氨酸硒螯合物具體制備步驟如下：

步驟1，合成L-茶氨酸原料液；

步驟2，將L-茶氨酸原料液脫色過濾后，濾液備用；

步驟3，在濾液中加入濾液質(zhì)量濃度為35％的硒鹽水溶液；用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH值為7-10，氮?dú)獯祾?，?0-90℃下進(jìn)行2h螯合反應(yīng)；

步驟4，螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，進(jìn)行純化；將所得螯合液濃縮至原體積1/3-1/6，加入5-8倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉淀靜置8-15h，除去上清液，將沉淀用95％的乙醇洗滌抽濾多次，取濾餅干燥后得到L-茶氨酸硒螯合物。

進(jìn)一步，所述的步驟1的具體步驟如下，

1.1將枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，在37℃下靜置培養(yǎng)16h進(jìn)行一次活化后，再轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基上進(jìn)行二次活化；將經(jīng)兩次活化好的枯草芽孢桿菌二級種子液按體積分?jǐn)?shù)3％接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)12-16h；

1.2收集振蕩培養(yǎng)的發(fā)酵液離心后得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液；采用分光光度計測定酶活，選取酶活0.01U/mL-0.2U/mL的粗酶液備用，進(jìn)行催化反應(yīng)；

1.3分別加入粗酶液質(zhì)量10％的L-谷氨酰胺和粗酶液質(zhì)量10％的乙胺鹽酸鹽溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，L-谷氨酰胺的濃度為15-50mmol/L，乙胺鹽酸鹽的濃度為20-80mmol/L；用乙胺水調(diào)節(jié)催化反應(yīng)體系至pH值為10，37℃靜置培養(yǎng)5-8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

再進(jìn)一步，步驟2中，加入L-茶氨酸原料液重量2％的活性炭進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為60-80℃，反應(yīng)時間為3-8min。

優(yōu)選的，所述硒鹽為亞硒酸鈉。

一種由本發(fā)明所述的方法制備得到的L-茶氨酸硒螯合物。

一種含L-茶氨酸硒螯合物的含片制備方法，按質(zhì)量份數(shù)計，取粉末狀的L-茶氨酸硒螯合物20-35％，β-環(huán)糊精5-20％，葡萄糖5-20％，蔗糖2-10％，檸檬酸1-3％，麥芽糊精5-20％，混合后按質(zhì)量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得含L-茶氨酸硒螯合物的含片。

一種由本發(fā)明所述的方法制備得到含L-茶氨酸硒螯合物的含片。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明采用微生物酶法制備L-茶氨酸，在此基礎(chǔ)上，采用水體系合成法螯合硒離子和L-茶氨酸，生產(chǎn)成本低，環(huán)境安全性高，資源消耗少，能夠進(jìn)行大量安全生產(chǎn)。L-茶氨酸被評為“最值得開發(fā)的食品新材料”，其特有的生理功能與硒離子補(bǔ)血功能相結(jié)合，不但能提高彼此的生物利用率，還能獲得清香茶風(fēng)味，在食品行業(yè)具有廣泛應(yīng)用前景。將L-茶氨酸硒螯合物制成含片，既有顯著的茶葉特色又能作為提供營養(yǎng)的休閑食品。本發(fā)明制備的L-茶氨酸硒螯合物結(jié)合牢固，如圖1所示，在胃中不會析出硒離子，不會造成胃腸刺激。

本發(fā)明所述的含L-茶氨酸硒螯合物的含片既有茶氨酸所含的茶香味和鮮爽味，且含硒量高，吸收快，毒副作用低。L-茶氨酸與硒離子螯合物可以通過改善機(jī)體免疫系統(tǒng)來提高免疫功能，增強(qiáng)對疾病的抵抗能力。

進(jìn)一步的，本發(fā)明通過乙醇純化析出結(jié)晶，得到產(chǎn)品純度較好，含量可到90％以上，回收率為90％-93％，晶體質(zhì)地均勻，色澤純凈，質(zhì)量上佳。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)例中所述L-茶氨酸和L-茶氨酸硒螯合物由紫外掃描儀U-1800得到的吸收光譜曲線。

圖中：a為L-茶氨酸的吸收光譜曲線，b為L-茶氨酸硒螯合物的吸收光譜曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

實(shí)施例1

一種含L-茶氨酸硒螯合物的含片制備方法，包括如下步驟：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)16h，再轉(zhuǎn)接到3mL液體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級種子液按3％體積分?jǐn)?shù)接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)12h。

第二：收集發(fā)酵液于8000rpm離心25min，得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。采用分光光度計測定酶活。選取酶活0.01U/mL的粗酶液20mL備用進(jìn)行催化反應(yīng)。

第三：分別加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(濃度15mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度20mmol/L)溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，用乙胺水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至pH10，37℃靜置培養(yǎng)5h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：將原料液過濾，除去雜質(zhì)。加入原料液重量2％的活性炭攪拌，進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為60℃，反應(yīng)時間為3min。脫色后再次過濾，濾液備用。

第五：加入質(zhì)量濃度為35％的硒鹽溶液，加入量為茶氨酸溶液質(zhì)量的1/3，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7，氮?dú)獯祾?，?0℃下反應(yīng)2h進(jìn)行螯合反應(yīng)。采用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質(zhì)量及穩(wěn)定性。所述硒鹽為亞硒酸鈉。

第六：螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻。將反應(yīng)液在4000rpm下離心20min，將所得螯合液濃縮至原體積1/3，加入5倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉淀靜置8h，去除上清液，用等體積95％乙醇水溶液洗滌2-3次，真空冷凍干燥。即獲得L-茶氨酸硒螯合物。真空冷凍干燥溫度為5℃-40℃，本具體實(shí)施例優(yōu)選5℃。

第七：依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末20％，β-環(huán)糊精5％，葡萄糖5％，蔗糖2％，檸檬酸1％，麥芽糊精5％，混合后按質(zhì)量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得L-茶氨酸硒含片。

實(shí)施例2

一種含L-茶氨酸硒螯合物的含片制備方法，包括如下步驟：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)16h，再轉(zhuǎn)接到3mL液體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級種子液按3％體積分?jǐn)?shù)接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)14h。

第二：收集發(fā)酵液于8000rpm離心25min，得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。采用分光光度計測定酶活。選取酶活0.15U/mL的粗酶液20mL備用進(jìn)行催化反應(yīng)。

第三：分別加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(濃度20mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度40mmol/L)溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，用乙胺水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至pH10，37℃靜置培養(yǎng)7h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：將原料液過濾，除去雜質(zhì)。加入原料液重量2％的活性炭攪拌，進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為70℃，反應(yīng)時間為6min。脫色后再次過濾，濾液備用。

第五：加入質(zhì)量濃度為35％的硒鹽溶液，加入量為茶氨酸溶液質(zhì)量的2/3，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH8，氮?dú)獯祾?，?0℃下反應(yīng)2h進(jìn)行螯合反應(yīng)。采用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質(zhì)量及穩(wěn)定性。所述硒鹽為亞硒酸鈉。

第六：螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻。將反應(yīng)液在4000rpm下離心40min，將所得螯合液濃縮至原體積1/5，加入6倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉淀靜置12h，去除上清液，用等體積95％乙醇水溶液洗滌2-3次，20℃下真空冷凍干燥。即獲得L-茶氨酸硒螯合物。

第七：依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末28％，β-環(huán)糊精15％，葡萄糖15％，蔗糖7％，檸檬酸2％，麥芽糊精15％，混合后按質(zhì)量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得L-茶氨酸硒含片。

實(shí)施例3

一種富含L-茶氨酸硒螯合物的含片制備方法，包括如下步驟：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)16h，再轉(zhuǎn)接到3mL液體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級種子液按3％體積分?jǐn)?shù)接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)16h。

第二：收集發(fā)酵液于8000rpm離心25min，得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。采用分光光度計測定酶活。選取酶活0.2U/mL的粗酶液20mL備用進(jìn)行催化反應(yīng)。

第三：分別加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(濃度50mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度80mmol/L)溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，用乙胺水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至pH10，37℃靜置培養(yǎng)8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：將原料液過濾，除去雜質(zhì)。加入原料液重量2％的活性炭攪拌，進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為80℃，反應(yīng)時間為8min。脫色后再次過濾，濾液備用。

第五：加入質(zhì)量濃度為35％的硒鹽溶液，加入量為茶氨酸溶液質(zhì)量的100％，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH10，氮?dú)獯祾?，?0℃下反應(yīng)2h進(jìn)行螯合反應(yīng)。采用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質(zhì)量及穩(wěn)定性。所述硒鹽為亞硒酸鈉。

第六：螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻。將反應(yīng)液在4000rpm下離心60min，將所得螯合液濃縮至原體積1/6，加入8倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉淀靜置15h，去除上清液，用等體積95％乙醇水溶液洗滌2-3次，40℃下真空冷凍干燥。即獲得L-茶氨酸硒螯合物。

第七：依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末35％，β-環(huán)糊精20％，葡萄糖20％，蔗糖10％，檸檬酸3％，麥芽糊精20％，混合后按質(zhì)量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得L-茶氨酸硒含片。

本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各方面的單個例子，本發(fā)明范圍還包括功能等同的方法和組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有脫離權(quán)利要求限定范圍的前提下，仍然可以對本發(fā)明做出各種改進(jìn)和變換，所做的改進(jìn)和變換仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。