專利名稱：茶氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶氨酸的新制造方法。
背景技術(shù)：
茶氨酸作為綠茶風(fēng)味的主要成分被已知，作為以茶為代表的食品香味成分是重要的物質(zhì)。含有茶氨酸的γ-谷氨酰衍生物，被指出作為動(dòng)物和植物體中的生理活性物質(zhì)發(fā)揮作用。例如，在Chem.Parm.Bull.，19(7)1301-1307(1971)中，報(bào)導(dǎo)了茶氨酸或者L-谷氨酰胺拮抗于由咖啡因誘發(fā)的痙攣。由此認(rèn)為這些化合物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，期待著作為生理活性物質(zhì)的有用性。
以往，作為茶氨酸的制造方法，一般是從在含有茶氨酸的玉露的生產(chǎn)用茶園中得到的茶葉干燥物中提取的方法。但是，使用該方法時(shí)，有以下2個(gè)缺點(diǎn)。即，(1)茶氨酸在茶葉干燥物中、只蓄積1.5％左右的程度，和(2)在一般的煎茶用茶園中、光合成活躍，所以，合成的茶氨酸被迅速分解、蓄積量少。因此，指出在從茶葉干燥物的提取法中，工業(yè)化生產(chǎn)充分量的茶氨酸比較困難，不實(shí)用。
從這樣的情況出發(fā)，期待著工業(yè)生產(chǎn)方法的開發(fā)，作為其一，報(bào)導(dǎo)了化學(xué)有機(jī)合成茶氨酸的方法(上述Chem.Parm.Bull.，19(7)1301-1307(1971))。但是，指出該有機(jī)合成反應(yīng)收率低，在合成物的分離精制等中，存在必須進(jìn)行復(fù)雜操作的問(wèn)題。
另外，作為其他工業(yè)生產(chǎn)方法，報(bào)導(dǎo)了利用來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，由L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的酶法(特開平11-225789)。此外，開發(fā)了將該酶固定在載體上的酶法(特開平5-328986)。但是，在使用來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶時(shí)，在合成茶氨酸反應(yīng)的同時(shí)，通過(guò)水解反應(yīng)，L-谷氨酸作為副反應(yīng)物被合成。因此，存在作為副產(chǎn)物的L-谷氨酸使精制茶氨酸變得復(fù)雜的問(wèn)題。
專利文獻(xiàn)1特開平11-225789號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開平5-328986號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Chem.Parm.Bull.，19(7)1301-1307(1971)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是鑒于上述問(wèn)題而完成的發(fā)明，其目的在于提供茶氨酸的有效制造方法。
發(fā)明人等為了解決上述課題而反復(fù)深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬、霉菌或酵母中的1種或2種以上的微生物的谷氨酰胺酶時(shí)，可以以高收率合成茶氨酸，并且副產(chǎn)物極其少量，以致基本上完成本發(fā)明。即，本發(fā)明的要點(diǎn)涉及一種茶氨酸的制造方法，其特征在于，使來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬、霉菌、或酵母中的1種或2種以上微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物的混合物。
根據(jù)本發(fā)明，提供茶氨酸的有效新制造方法，可以進(jìn)行簡(jiǎn)易而工業(yè)性有利的生產(chǎn)。即，通過(guò)使用來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬、霉菌、或酵母中的1種或2種以上的微生物的谷氨酰胺酶，確認(rèn)高于以往的茶氨酸轉(zhuǎn)化率，可以工業(yè)性生產(chǎn)。


圖1是表示使用來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬的谷氨酰胺酶和來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶，由L-谷氨酰胺和乙胺，酶合成茶氨酸時(shí)的合成茶氨酸量、谷氨酸量的表。
圖2是表示使用來(lái)自霉菌的谷氨酰胺酶和來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶，由L-谷氨酰胺和乙胺，酶合成茶氨酸時(shí)的合成茶氨酸量、谷氨酸量的表。
圖3是表示使用來(lái)自酵母的谷氨酰胺酶和來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶，由L-谷氨酰胺和乙胺，酶合成茶氨酸時(shí)的合成茶氨酸量、谷氨酸量的表。
圖4是表示茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和分離物質(zhì)的IR光譜的圖表。
具體實(shí)施例方式
接著，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式詳細(xì)地說(shuō)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍限定于下述的實(shí)施方式，不變更其要點(diǎn)，可以進(jìn)行各種改變而實(shí)施。另外，本發(fā)明的技術(shù)范圍，涉及到等效的范圍。
所謂在本發(fā)明中可以使用的茶氨酸，是茶葉中所含的谷氨酸衍生物，并是茶風(fēng)味的主要成分，作為以呈味為用途的食品添加劑使用。具體地，是稱為γ-谷氨?；阴０贰-谷氨酸-γ-乙酰胺等的化合物。
所謂本發(fā)明中使用的乙胺衍生物，可以列舉乙胺、乙胺鹽酸鹽、乙胺氯化金酸鹽、乙胺脂肪酸鹽、乙胺苦味酸鹽、乙胺的N-苯磺酰基化合物、乙胺的N-對(duì)甲苯磺?；衔锏?，但不限于這些。另外，其中特別優(yōu)選使用乙胺、乙胺鹽酸鹽。
所謂本發(fā)明中的谷氨酰胺酶，是具有水解L-谷氨酰胺、生成L-谷氨酸的谷氨酰胺酶活性，在提高豆醬·醬油等發(fā)酵食品的香味、提高呈味性中使用的谷氨酰胺酶。已知谷氨酰胺酶在堿性條件下，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移活性變得比水解活性高，在以茶氨酸為代表的烷基酰胺的合成中也可以利用。
本發(fā)明中的谷氨酰胺酶活性，通過(guò)以L-谷氨酰胺為底物、使酶作用，定量所生成的L-谷氨酸而測(cè)定。可以使用市售的試劑盒例如F試劑盒L-谷氨酸(Roche Diagnostics公司)測(cè)定所生成的L-谷氨酸量。作為該酶的單位，將每1分鐘生成1μmol谷氨酸的酶量定義為“mU”。另外，使用該定義，將溶液中的每1mg蛋白質(zhì)的酶量定義為谷氨酰胺酶比活性“mU/mg”。
所謂本發(fā)明中的芽孢桿菌(Bacillus)屬，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)中，是具有革蘭氏陽(yáng)性的好氣性菌、桿菌、芽胞形成能力、運(yùn)動(dòng)性等各項(xiàng)性質(zhì)的微生物。
來(lái)自本發(fā)明中的芽孢桿菌(Bacillus)屬的谷氨酰胺酶的起源沒有特別的限定，優(yōu)選是來(lái)自枯草桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、多粘芽孢桿菌(Bacillus polymixa)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、Bacillus thermoproteolyticus的酶。從優(yōu)選谷氨酰胺酶比活性特別高的菌的觀點(diǎn)出發(fā)，最優(yōu)選的是來(lái)自枯草桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的谷氨酰胺酶。
另外，來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬的谷氨酰胺酶也可以使用應(yīng)用生物工程學(xué)、通過(guò)基因重組等的修飾菌而制造的谷氨酰胺酶。
所謂本發(fā)明中的霉菌，是在真菌類中，成為菌絲相互纏繞的無(wú)定形集合體的菌類的總稱，在藻菌類、多數(shù)子囊菌類和一部分擔(dān)子菌類中可見。
來(lái)自本發(fā)明中的霉菌的谷氨酰胺酶的起源，沒有特別的限定，但優(yōu)選是來(lái)自米曲菌(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉菌(Penicillium notatum)、Rizopus stolonifer、Mucor sponosus的霉。從優(yōu)選谷氨酰胺酶比活性特別高的菌的觀點(diǎn)出發(fā)，最優(yōu)選的是來(lái)自米曲菌(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)的谷氨酰胺酶。
另外，來(lái)自霉菌的谷氨酰胺酶，也可以使用應(yīng)用生物工程學(xué)、通過(guò)基因重組等的修飾菌而制造的谷氨酰胺酶。
所謂本發(fā)明中的酵母，是屬于子囊菌類的菌類。不含葉綠素，出芽繁殖，但也有分裂繁殖。應(yīng)用于酒類、醬油、面包等的制造。
來(lái)自本發(fā)明中的酵母的谷氨酰胺酶的起源，沒有特別的限定，優(yōu)選是來(lái)自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、魯氏酵母(Saccharomyces rouxii)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、南極假絲酵母(Candida antarctica)、Hansenulla anomala、八孢裂殖酵母(Schizosaccaromyces octosporus)的酶。從優(yōu)選谷氨酰胺酶比活性特別高的菌的觀點(diǎn)出發(fā)，最優(yōu)選的是來(lái)自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、魯氏酵母(Saccharomyces rouxii)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、南極假絲酵母(Candida antarctica)的谷氨酰胺酶。
另外，來(lái)自酵母的谷氨酰胺酶，也可以使用應(yīng)用生物工程學(xué)、通過(guò)基因重組等的修飾菌而制造的谷氨酰胺酶。
作為來(lái)自上述芽孢桿菌(Bacillus)屬、霉菌、酵母等微生物的谷氨酰胺酶，可以使用(1)微生物本身、或(2)從微生物提取的粗酶。但是，從茶氨酸轉(zhuǎn)化率的觀點(diǎn)看，優(yōu)選從微生物中精制谷氨酰胺酶而使用。谷氨酰胺酶的精制方法，可以使用公知的任一種酶精制方法?？梢岳荆缰V，使用溶劑的分配，透析，超濾，電泳，由中性鹽的分級(jí)鹽析，使用乙醇、丙酮的分級(jí)沉淀法，HPLC等。其中，優(yōu)選組合溶劑分配和各種色譜、HPLC來(lái)精制谷氨酰胺酶。還可以組合CM-纖維素柱色譜、葡聚糖凝膠G150柱色譜、羥磷灰石柱色譜、Butyl-Toyopearl柱色譜。
這樣，在本發(fā)明的茶氨酸的制造方法中，優(yōu)選使來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬、青霉菌(Penicillium)屬、Rizopus屬、毛霉菌(Mucor)屬、曲霉菌(Aspergillus)屬、Hansenulla屬、裂殖酵母(Schizosaccaromyces)屬、假絲酵母(Candida)屬中的1種或2種以上的微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物。此時(shí)，(1)優(yōu)選是在這些微生物的培養(yǎng)上清的谷氨酰胺酶比活性成為10mU/mg以上的條件下培養(yǎng)的情況，另外，(2)對(duì)谷氨酰胺酶，從減少副產(chǎn)物出發(fā)，優(yōu)選使用使本發(fā)明中的主產(chǎn)物茶氨酸與副產(chǎn)物谷氨酸的比(茶氨酸/谷氨酸)大于5的谷氨酰胺酶。
本發(fā)明中的茶氨酸酶合成時(shí)的液體性質(zhì)沒有特別的限定，但pH優(yōu)選約9～12、更優(yōu)選約10～11。另外，反應(yīng)溫度沒有特別的限定，優(yōu)選約0℃～45℃、更優(yōu)選約4℃～30℃。作為底物使用的L-谷氨酰胺、乙胺衍生物濃度沒有特別的限定，但優(yōu)選L-谷氨酰胺約0.1摩爾以上、乙胺衍生物約1摩爾以上。所謂本發(fā)明中的L-谷氨酰胺，除含有純的L-谷氨酰胺外，含有L-谷氨酰胺鈉鹽等適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽。
從反應(yīng)液分離精制由本發(fā)明的方法合成的茶氨酸時(shí)，可以使用公知的任一種氨基酸精制方法，可以例示例如柱色譜，使用溶劑的分配，透析，晶析，超濾，電泳，由中性鹽的分級(jí)鹽析，使用乙醇、丙酮的分級(jí)沉淀法、HPLC等。其中，優(yōu)選組合溶劑分配和各種色譜、HPLC來(lái)精制谷氨酰胺酶。還可以組合CM-纖維素柱色譜、葡聚糖凝膠G150柱色譜、羥磷灰石柱色譜、Butyl-Toyopearl柱色譜。
所謂本發(fā)明中的載體，是將谷氨酰胺酶固定的物體，例如，可以列舉Celite、硅藻土、高嶺土(kaolinite)、硅膠、分子篩、多孔玻璃、活性炭、碳酸鈣、陶瓷等的無(wú)機(jī)載體，陶瓷粉、聚乙烯醇、聚丙烯、殼聚糖、離子交換樹脂、疏水吸附樹脂、螯合樹脂、合成吸附樹脂等的有機(jī)高分子等，但不限于這些。
實(shí)施例以下，由實(shí)施例和試驗(yàn)例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。這些是本發(fā)明的實(shí)施例的一部分，本發(fā)明不限于該實(shí)施例和試驗(yàn)例。
實(shí)施例1在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化鈉、pH為7.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)枯草桿菌(Bacillussubtilis)。離心分離所得到的培養(yǎng)液，得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為67mU/mg。
實(shí)施例2在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化鈉、pH為7.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(AmershamBioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為53mU/mg。
實(shí)施例3在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化鈉、pH為7.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)。離心分離所得到的培養(yǎng)液，得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))、將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為43mU/mg。
實(shí)施例4在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化鈉、pH為7.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。離心分離所得到的培養(yǎng)液，得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為40mU/mg。
實(shí)施例5在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化鈉、pH為7.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。離心分離所得到的培養(yǎng)液，得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為5mU/mg。
比較例1來(lái)自硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)的精制谷氨酰胺酶的配制使用含有0.6％谷氨酸鈉、0.1％酵母提取物、1.0％葡萄糖、0.05％KH2PO4、0.05％K2HPO4、0.07％MgSO4·7H2O、0.01％EDTA-Fe的培養(yǎng)液(pH7)，在30L容積的發(fā)酵缸(jar fermenter)(30L、通氣1vvm＝25L/分鐘、旋轉(zhuǎn)數(shù)2000rpm)中培養(yǎng)硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)約20小時(shí)。洗凈所得到的培養(yǎng)液175L份的菌體后，在7.5L的30mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中懸濁，在5～20℃下超聲波破碎，得到菌體破碎物。
一邊用7％氨水將pH調(diào)整為7，一邊對(duì)菌體破碎物進(jìn)行硫酸銨分餾，得到45～90％飽和餾份。將其溶解在0.01M磷酸鉀緩沖液中，相對(duì)于同緩沖液透析。使之吸附在DEAE-纖維素柱(15×60cm)上，用含有0.1M食鹽的緩沖液洗提谷氨酰胺酶，得到谷氨酰胺酶液。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為15mU/mg。
實(shí)施例6由精制谷氨酰胺酶的茶氨酸的酶合成使用精制谷氨酰胺酶(0.1mL)，在pH10.0、溫度30℃的條件下，將10mL底物溶液(0.5M的L-谷氨酰胺和各種濃度的乙胺)進(jìn)行茶氨酸的酶合成。
實(shí)施例7由HPLC的茶氨酸量和谷氨酸量的定量進(jìn)行了茶氨酸的酶合成的酶反應(yīng)液中的茶氨酸量和谷氨酸量，在適當(dāng)稀釋反應(yīng)液后、通過(guò)HPLC進(jìn)行定量。使用得到的茶氨酸量(mol/L)和谷氨酸量(mol/L)，計(jì)算從底物的谷氨酸量(mol/L)的摩爾轉(zhuǎn)化率(％)。
HPLC的定量條件如下表所示。
表1

試驗(yàn)例1來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬的谷氨酰胺酶和來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶的茶氨酸酶合成使用在實(shí)施例1～實(shí)施例5和比較例1中調(diào)制的來(lái)自各微生物的谷氨酰胺酶，以實(shí)施例6的條件進(jìn)行茶氨酸酶合成試驗(yàn)。試驗(yàn)后的茶氨酸量和谷氨酸量，以實(shí)施例7的條件進(jìn)行測(cè)定。在圖1中表示試驗(yàn)的結(jié)果。
在使用實(shí)施例1～實(shí)施例5和比較例1的任一種谷氨酰胺酶時(shí)，從L-谷氨酰胺向茶氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率都是50％以上。特別是，實(shí)施例1～實(shí)施例4的谷氨酰胺酶的摩爾轉(zhuǎn)化率分別是78％、76％、72％和70％的高值。另一方面，從L-谷氨酰胺向L-谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率(副產(chǎn)物的生成)，實(shí)施例1～實(shí)施例4的谷氨酰胺酶是6％以下的低值，但在實(shí)施例5和比較例1的谷氨酰胺酶中顯示15％以上的高值。在使用谷氨酰胺酶合成茶氨酸時(shí)，除向茶氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率高以外，優(yōu)選向作為副產(chǎn)物的L-谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率低。如此，可以使茶氨酸的精制工序簡(jiǎn)易化。在本試驗(yàn)例中，為了滿足這樣的條件，優(yōu)選使用來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬的谷氨酰胺酶、其培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為10mU/mg以上。
實(shí)施例8在含有2.0％麥芽提取物(Malt extract)、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物(Yeast extract)、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)Aspergilus oryzae。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(AmershamBioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為42mU/mg。
實(shí)施例9在含有2.0％麥芽提取物、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)黑曲霉(Aspergillusniger)。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為39mU/mg。
實(shí)施例10在含有2.0％麥芽提取物、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)Rizopus stolonifer。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose FastFlow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為15mU/mg。
實(shí)施例11在含有2.0％麥芽提取物、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)Mucor sponosus。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose FastFlow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為5mU/mg。
試驗(yàn)例2來(lái)自霉菌的谷氨酰胺酶和來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶的茶氨酸酶合成使用在實(shí)施例8～實(shí)施例11和比較例1調(diào)制的來(lái)自各微生物的谷氨酰胺酶，以實(shí)施例6的條件進(jìn)行茶氨酸酶合成試驗(yàn)。試驗(yàn)后的茶氨酸量和谷氨酸量，以實(shí)施例7的條件測(cè)定。在圖2中表示試驗(yàn)結(jié)果。
在使用實(shí)施例8～實(shí)施例11和比較例1的任一種谷氨酰胺酶時(shí)，從L-谷氨酰胺向茶氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率都是50％以上。特別是、實(shí)施例8和實(shí)施例9的谷氨酰胺酶的摩爾轉(zhuǎn)化率分別是72％和73％的高值。另一方面，從L-谷氨酰胺向L-谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率(副產(chǎn)物的生成)，實(shí)施例8和實(shí)施例9的谷氨酰胺酶是5％以下的低值，但在比較例1的谷氨酰胺酶中為10％以上的高值。在使用谷氨酰胺酶合成茶氨酸時(shí)，除向茶氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率高以外，優(yōu)選向作為副產(chǎn)物的L-谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率低。如此，可以使茶氨酸的精制工序簡(jiǎn)易化。在本試驗(yàn)例中，為了滿足這樣的條件，優(yōu)選使用來(lái)自霉菌(特別是曲霉菌(Aspergillus)屬、Rizopus屬、毛霉菌(Mucor)屬)的谷氨酰胺酶，(1)其培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為10mU/mg以上，或者(2)在從L-谷氨酰胺的摩爾轉(zhuǎn)化率中，本實(shí)施例中的作為主產(chǎn)物的茶氨酸與作為副產(chǎn)物的谷氨酸的比(茶氨酸/谷氨酸的比＝X)，X＞5。
實(shí)施例12在含有0.3％麥芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(AmershamBioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為45mU/mg。
實(shí)施例13在含有0.3％麥芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)魯氏酵母(Saccharomyces rouxii)。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為40mU/mg。
實(shí)施例14在含有0.3％麥芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為30mU/mg。
實(shí)施例15在含有0.3％麥芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)南極假絲酵母(Candida antarctica)。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為25mU/mg。
實(shí)施例16在含有0.3％麥芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH為5.0的培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)Hansenullaanomala。離心分離所得到的培養(yǎng)液、得到培養(yǎng)上清液。在該培養(yǎng)上清液中添加冷乙醇，離心分離所得到的沉淀、進(jìn)行回收。在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，進(jìn)行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通過(guò)鹽溶液的洗提而提高蛋白質(zhì)的純度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，將得到的谷氨酰胺酶溶液進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到精制谷氨酰胺酶。培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為15mU/mg。
試驗(yàn)例3來(lái)自酵母的谷氨酰胺酶和來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)屬的谷氨酰胺酶的茶氨酸酶合成使用在實(shí)施例12～實(shí)施例16和比較例1調(diào)制的來(lái)自各屬的谷氨酰胺酶，以實(shí)施例6的條件進(jìn)行茶氨酸酶合成試驗(yàn)。試驗(yàn)后的茶氨酸量和谷氨酸量，以實(shí)施例7的條件測(cè)定。在圖3中表示試驗(yàn)的結(jié)果。
在使用實(shí)施例12～實(shí)施例16和比較例1的任一種谷氨酰胺酶時(shí)，從L-谷氨酰胺向茶氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率都是50％以上。特別是、實(shí)施例12～實(shí)施例15的谷氨酰胺酶的摩爾轉(zhuǎn)化率分別是70％以上的高值。另一方面，從L-谷氨酰胺向L-谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率(副產(chǎn)物的生成)，實(shí)施例12～實(shí)施例15的谷氨酰胺酶都是低值，但在比較例1的谷氨酰胺酶中為10％的高值。在使用谷氨酰胺酶合成茶氨酸時(shí)，除向茶氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率高以外，優(yōu)選向作為副產(chǎn)物的L-谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率低。如此，可以使茶氨酸的精制工序簡(jiǎn)易化。在本試驗(yàn)例中，為了滿足這樣的條件，優(yōu)選使用來(lái)自酵母(特別是酵母菌(Saccharomyces)屬、假絲酵母(Candida)屬)的谷氨酰胺酶，其培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為10mU/mg以上。
實(shí)施例17使用CHITOPEARL 4010的固定化谷氨酰胺酶的配制在50mM磷酸緩沖液(pH7.4)中，使作為殼聚糖珠(chitosan beads)的市售品CHITOPEARL 4010(富士紡績(jī)(株))浸漬24小時(shí)。在25mL的實(shí)施例3中配制的谷氨酰胺酶(15mg/mL)中浸漬10mL的該平衡化后的CHITOPEARL 4010，振蕩約2小時(shí)。此后，在2.5％戊二醛溶液中加入除去了附著液的CHITOPEARL 4010，再振蕩2小時(shí)。在戊二醛處理后，使用30倍量的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)，洗凈到吸光度(280nm)為0.01，在柱中填充。
實(shí)施例18固定化谷氨酰胺酶的酶反應(yīng)使用在實(shí)施例17中調(diào)制的固定化谷氨酰胺酶，以30℃、SV＝0.2的流速將底物溶液(4％谷氨酰胺、25％乙胺、pH10.0)通過(guò)柱時(shí)，可以以70％的收率得到茶氨酸。
實(shí)施例19使用陰離子交換樹脂的固定化谷氨酰胺酶的配制相對(duì)于25mL在實(shí)施例3中得到的精制谷氨酰胺酶(15mg/mL)，添加10mL作為陰離子交換樹脂的DIAION HPA25(三菱化學(xué)(株))后，振蕩約2小時(shí)。此后，在2.5％戊二醛溶液中加入除去了附著液的HPA25，再振蕩2小時(shí)。在戊二醛處理后，使用30倍量的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)，洗凈到吸光度(280nm)為0.01，在柱中填充。
實(shí)施例20固定化谷氨酰胺酶的酶反應(yīng)使用在實(shí)施例19中調(diào)制的固定化谷氨酰胺酶，以30℃、SV＝0.2的流速將底物溶液(4％谷氨酰胺、25％乙胺、pH10.0)通過(guò)柱時(shí)，可以以75％的收率得到茶氨酸。
實(shí)施例21茶氨酸的精制從茶氨酸反應(yīng)液的分離精制，在通過(guò)減壓濃縮從反應(yīng)液除去乙胺后，進(jìn)行由RO膜的脫鹽，此后，進(jìn)行Dowex50×8、Dowex1×2柱色譜，由乙醇處理而進(jìn)行。
當(dāng)使該分離物質(zhì)應(yīng)用于氨基酸分析器、紙色譜分析法，顯示與茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同樣的性狀。另外，用鹽酸或谷氨酰胺酶進(jìn)行水解處理分離物質(zhì)，以1∶1的比例生成L-谷氨酸和乙胺。這樣，因?yàn)橛晒劝滨０访杆夥蛛x物質(zhì)，所以顯示乙胺結(jié)合在L-谷氨酸的γ位。另外，由L-谷氨酸脫氫酶(GluDH)確認(rèn)水解生成的L-谷氨酸是L型。在圖4中表示茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和分離物質(zhì)的IR光譜。兩種物質(zhì)都顯示同樣的光譜。從這些可以確認(rèn)分離物質(zhì)是茶氨酸。
權(quán)利要求
1.一種茶氨酸的制造方法，其特征在于使來(lái)自芽孢桿菌屬、霉菌、或酵母中的1種或2種以上微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的茶氨酸的制造方法，其特征在于所述谷氨酰胺酶是在芽孢桿菌屬、霉菌、或酵母中的1種或2種以上微生物的培養(yǎng)上清液的谷氨酰胺酶比活性為10mU/mg以上的條件下培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的茶氨酸的制造方法，其特征在于所述谷氨酰胺酶，使作為主產(chǎn)物的茶氨酸與作為副產(chǎn)物的谷氨酸的比(茶氨酸/谷氨酸)大于5。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的茶氨酸的制造方法，其特征在于所述谷氨酰胺酶被固定在載體上。
全文摘要
本發(fā)明提供一種茶氨酸的有效的新制造方法，其目的在于能夠以副產(chǎn)物少、簡(jiǎn)單而且工業(yè)性有利地進(jìn)行茶氨酸生產(chǎn)。通過(guò)在谷氨酰胺和乙胺衍生物的混合物中，使用來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬、霉菌(特別是曲霉菌(Aspergillus)屬、Rizopus屬、毛霉菌(Mucor)屬)、或酵母(特別是Hansenulla屬、酵母菌(Saccharomyces)屬、假絲酵母(Candida)屬)中的1種或2種以上的來(lái)自微生物的谷氨酰胺酶，解決上述課題。
文檔編號(hào)C12P13/02GK1977047SQ20058002183
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2005年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月28日
發(fā)明者岡田幸隆, 小關(guān)誠(chéng), 青井暢之 申請(qǐng)人:太陽(yáng)化學(xué)株式會(huì)社