本發(fā)明屬于天然藥物及化學(xué)藥物領(lǐng)域，特別涉及一類新的雜萜化合物及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細菌感染可引發(fā)人體多種疾病。目前，臨床上耐藥菌感染日益嚴(yán)重，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)，耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-TB)等不斷蔓延，且細菌耐藥性逐漸呈多藥耐藥發(fā)展趨勢。近些年來，臨床上因耐藥菌感染所致的病死率逐年升高，反映出傳統(tǒng)抗菌藥物已難滿足現(xiàn)代臨床治療的需求。因此，研究開發(fā)新型抗菌藥物具有重要的臨床應(yīng)用價值。

紅千層(Callistemon rigidus)為桃金娘科(Myrtaceae)紅千層屬植物，原產(chǎn)澳大利亞，我國的廣東、廣西等地有引種，常被用作抗菌劑和殺蟲劑等。研究表明紅千層屬植物的精油及乙醇提取物具有一定的抗菌活性(Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1974,6:539-542)，然而其活性物質(zhì)并不明確。Lounasmaa M等在1977年首次對紅千層屬植物的化學(xué)成分進行了研究，從中分離鑒定出間苯三酚衍生物Myrtucommulone A(Phytochemistry,1977,16(11):1851-52)及其他成分(Journal of Natural Products,1999,62:1666-1667)，但這些成分的抗菌活性未見報道。因此，紅千層的化學(xué)成分研究尚不深入，抗菌活性物質(zhì)還不明確，有待研究和發(fā)掘。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一類結(jié)構(gòu)新穎的雜萜類化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述雜萜化合物在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一類新結(jié)構(gòu)雜萜化合物，是由環(huán)聚酮-間苯三酚-單萜雜合而成，命名為Callistrilone E和epi-Callistrilone E，它們是一對差向異構(gòu)體(C-13位構(gòu)型不同)，結(jié)構(gòu)如式I所示；Callistrilone E的構(gòu)型為7bR,9R,11aR,13S；epi-Callistrilone E的構(gòu)型為7bR,9R,11aR,13R；

上述雜萜化合物的提取分離方法包括以下步驟：將紅千層(Callistemon rigidus)枝葉粉碎，用95％(w/w)乙醇滲漉提取，提取物濃縮后用石油醚萃取，再通過硅膠柱層析、Sephadex LH-20、十八烷基鍵合硅膠(ODS)柱層析及制備型HPLC分離純化，得到上述雜萜化合物。

上述的雜萜化合物具有抗菌作用，并可以用于制備抗菌藥物與制劑(含清創(chuàng)與消毒制劑)；

所述的菌包括金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、糞腸球菌和耐萬古霉素屎腸球菌中的至少一種；

所述的抗菌藥物還包括藥學(xué)上可接受的輔料。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了紅千層中一類結(jié)構(gòu)新穎的雜萜化合物Callistrilone E和epi-Callistrilone E。該類化合物是由34個碳原子組成的環(huán)聚酮-間苯三酚-單萜雜合物，是一新型結(jié)構(gòu)的化學(xué)實體。

(2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Callistrilone E和epi-Callistrilone E在較低濃度(0.25～0.50μg/mL)下即對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介耐藥金葡菌、凝固酶陰性葡萄球菌、糞腸球菌和耐萬古霉素屎腸球菌均具有顯著的抗菌活性。

(3)本發(fā)明的Callistrilone E和epi-Callistrilone E對真核細胞毒性較低。

附圖說明

圖1為雜萜化合物Callistrilone E的¹H NMR譜圖，

圖2為雜萜化合物Callistrilone E的¹³C NMR譜圖，

圖3為雜萜化合物Callistrilone E的HSQC譜圖，

圖4為雜萜化合物Callistrilone E的HMBC譜圖，

圖5為雜萜化合物Callistrilone E的X射線衍射結(jié)構(gòu)圖，

圖6為雜萜化合物epi-Callistrilone E的¹H NMR譜圖，

圖7為雜萜化合物epi-Callistrilone E的¹³C NMR譜圖，

圖8為雜萜化合物epi-Callistrilone E的HSQC譜圖，

圖9為雜萜化合物epi-Callistrilone E的HMBC譜圖,

圖10為雜萜化合物epi-Callistrilone E的X射線衍射結(jié)構(gòu)圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

化合物的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定：

(1)干燥紅千層(Callistemon rigidus)枝葉12kg，粉碎成粗粉，用30L 95％(w/w)乙醇滲漉提取，合并滲漉液并減壓濃縮至無醇味，得到的總浸膏約1.8kg。浸膏加水混懸后用石油醚萃取，得到石油醚萃取部位560g。

(2)石油醚萃取部位進行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，按照石油醚和乙酸乙酯體積比為100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:100和0:100的洗脫梯度進行洗脫，經(jīng)薄層色譜(TLC)分析并合并相似流份，得到15個主流份Fr.1～Fr.15。其中流份Fr.5(石油醚/乙酸乙酯100:7洗脫部分，45g)繼續(xù)經(jīng)硅膠柱層析，按照環(huán)已烷和乙酸乙酯體積比為100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:100的洗脫梯度進行洗脫，得到8個亞流份Fr.5A～Fr.5H。

(3)①對亞流份Fr.5D(環(huán)已烷/乙酸乙酯100:7洗脫部分，17.5g)，進行反相ODS柱層析，以甲醇-水(MeOH-H₂O)為洗脫劑，按照甲醇和水體積比為60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的洗脫梯度進行洗脫，收集洗脫液(洗脫體積100-2500mL)，經(jīng)TLC分析并合并相似流份，得到5個流份Fr.5Da～Fr.5De。

②取流份Fr.5Dd溶解后上樣于Sephadex LH-20色譜柱，以氯仿-甲醇(CHCl₃-MeOH)按體積比1:1混合得到的混合溶劑為洗脫劑，流速為0.5mL/min進行洗脫，收集洗脫液(洗脫體積100-1500mL)，經(jīng)TLC分析并合并相似流份，得到3個流份Fr.5Dd1～Fr.5Dd3。

③取流份Fr.5Dd2濃縮后用甲醇溶解，然后用反相制備型HPLC分離純化，以體積比為90:10的甲醇-水為洗脫劑，流速為3mL/min進行洗脫，先后得到Callistrilone E(17.2mg)和epi-Callistrilone E(10.2mg)。

(4)①Callistrilone E的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色塊狀晶體；香草醛-濃硫酸反應(yīng)(TLC)顯紫紅色；m.p.196～198℃；UV(MeOH)λ_max(logε)206(4.46),232(4.24),298(4.46)nm；IR(KBr)ν_max 3188,2973,2934,2871,1720,1624,1585,1471,1424,1381,1231,1058cm^-1；HR-ESI-MS m/z 567.3348[M+H]⁺(計算值C₃₄H₄₇O₇:567.3316)。¹H NMR、¹³C NMR、HSQC和HMBC核磁共振圖譜見圖1～4。X射線衍射結(jié)構(gòu)見圖5。由于該化合物的結(jié)構(gòu)存在阻轉(zhuǎn)異構(gòu)現(xiàn)象，其氫譜(¹H NMR)和碳譜(¹³C NMR)表現(xiàn)為兩套類似的數(shù)據(jù)，歸屬見表1。

根據(jù)以上理化和光譜數(shù)據(jù)，鑒定Callistrilone E的結(jié)構(gòu)如式I所示。

②epi-Callistrilone E的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色粉末；香草醛-濃硫酸反應(yīng)(TLC)顯紫紅色；UV(MeOH)λ_max(logε)206(2.54),234(2.59),298(3.46)nm；IR(KBr)ν_max 3186,2972,2932,2870,1721,1624,1585,1471,1422,1381,1231,1055cm^-1；HR-ESI-MS m/z 567.3334[M+H]⁺(計算值C₃₄H₄₇O₇:567.3316)。¹H NMR、¹³C NMR、HSQC和HMBC核磁共振圖譜見圖6～9。X射線衍射結(jié)構(gòu)見圖10。氫譜(¹H NMR)和碳譜(¹³C NMR)數(shù)據(jù)歸屬見表2。

根據(jù)以上理化和光譜數(shù)據(jù)，鑒定epi-Callistrilone E的結(jié)構(gòu)如式I所示。

表1.Callistrilone E的¹H(500MHz)和¹³C(125MHz)NMR數(shù)據(jù)

*為OH信號；溶劑為CDCl₃，δ單位為ppm，J單位為Hz

表2.epi-Callistrilone E的¹H(500MHz)和¹³C(125MHz)NMR數(shù)據(jù)

*為OH信號；溶劑為CDCl₃，δ單位為ppm，J單位為Hz

實施例2

Callistrilone E和epi-Callistrilone E對多種細菌的抑制作用

金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC29213、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC33591(MRSA)、萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌S.aureus Mu50(VISA)、凝固酶陰性葡萄球菌S.epidermidis ATCC12228、糞腸球菌E.faecalis ATCC29212、耐萬古霉素屎腸球菌E.faecium ATCC700221、大腸埃希菌E.coli ATCC25922、銅綠假單胞菌Ps.aeruginosa ATCC 27853，以上菌株均來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

采用肉湯微量二倍稀釋法，測定化合物體外抑菌作用的最小抑菌濃度(MIC)，具體操作方法如下：

(1)細菌培養(yǎng)：以胰酪胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)實驗菌，35℃隔夜培養(yǎng)(12-16h)至約0.5個Mcfarland濃度(1×10⁸CFU)時備用。

(2)先將測試樣品在乙醇中溶解成較高濃度，繼而用Cation-Adjusted Mueller Hinton(CAMH)肉湯進行系列倍比稀釋使樣品濃度范圍從256μg/mL到0.25μg/mL。另外，采用相同培養(yǎng)液配制好一定濃度的苯唑西林和萬古霉素作為陽性對照。

(3)在96孔板上每孔加入100μL不同濃度的含藥培養(yǎng)液和100μL經(jīng)CAMH適當(dāng)稀釋的含菌培養(yǎng)液，使最終菌濃度達5×10⁵CFU/mL。以不含藥的CAMH肉湯加菌液作陰性對照(CAMH培養(yǎng)基、菌液各100μL)，以不加菌液的CAMH肉湯培養(yǎng)基作空白對照(CAMH培養(yǎng)基200μL)。將96孔板密封后置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育24h。

(4)以陰性對照孔內(nèi)細菌明顯生長為前提條件，通過肉眼觀察，以加藥后孔內(nèi)細菌無明顯生長的藥物最低濃度為該藥物的MIC(μg/mL)，實驗平行重復(fù)三次。結(jié)果見表3。

表3.Callistrilone E和epi-Callistrilone E對多種細菌的抑制作用

結(jié)果顯示，化合物Callistrilone E和epi-Callistrilone E對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介耐藥金葡菌、凝固酶陰性葡萄球菌、糞腸球菌、耐萬古霉素屎腸球菌均具有顯著的抗菌活性，MIC值為0.25–0.50μg/mL，均優(yōu)于陽性藥苯唑西林和萬古霉素。

尤其是上述化合物對耐甲氧西林金葡菌，萬古霉素中介耐藥金葡菌和耐萬古霉素屎腸球菌的抗菌活性顯著優(yōu)于苯唑西林、萬古霉素等現(xiàn)有臨床藥物，這對于將該類化合物作為新型抗耐藥菌藥物研發(fā)具有重要意義。

本發(fā)明的Callistrilone和epi-Callistrilone E作為分子結(jié)構(gòu)完全不同于已有抗菌藥物的新化學(xué)實體，對于耐藥菌具有良好的活性，有可能作為新化學(xué)實體發(fā)展為新型抗菌藥物。

實施例3

Callistrilone E和epi-Callistrilone E對正常細胞的影響

試驗方法：人胚腎細胞HEK 293(購自中國科學(xué)院上海細胞庫)于含有10％(v/v)胎牛血清及雙抗(青霉素和鏈霉素各100U/ml)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，用PBS洗滌，0.25％(w/v)的胰蛋白酶消化，然后用新鮮DMEM培養(yǎng)基懸浮細胞，調(diào)整細胞密度為1×10⁶個/ml，鋪96孔板，每孔200μl，待細胞貼壁后，加不同濃度的樣品，在37℃、5％CO₂條件下共培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用移液槍吸出孔中液體，每孔加入100μl DMSO，室溫下輕搖10分鐘，用酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測每個孔的吸光度OD值。按下列公式計算細胞生長抑制率，重復(fù)實驗至少3次以上。細胞生長抑制率計算公式：抑制率(％)＝(1-加藥組OD值)/對照組OD值×100％。結(jié)果見表4。

表4.Callistrilone E和epi-Callistrilone E對HEK 293的細胞毒性

試驗結(jié)果顯示：即使在200μg/ml的高濃度下，本發(fā)明的化合物Callistrilone E和epi-Callistrilone E對人正常細胞胚胎腎細胞HEK 293僅表現(xiàn)出很低的細胞毒作用，細胞生長抑制率為10.13％和12.75％。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。