技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于藥物技術(shù)和食品領(lǐng)域，具體地涉及反柄紫芝中的萜類化合物及其藥物組合物，以及其在制備治療腎臟纖維化的藥物或保健食品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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腎臟纖維化是慢性腎病進(jìn)展到腎臟衰竭(尿毒癥)的必經(jīng)階段。腎臟纖維化典型的病理特征是細(xì)胞外基的分泌增加而降解減少，致使細(xì)胞外基質(zhì)積聚，因此減少細(xì)胞外基質(zhì)是干預(yù)纖維化的重要思路之一。細(xì)胞外基質(zhì)種類較多，其中纖粘連蛋白(fibronectin)是其主要成分之一。因此，觀察化合物對TGF‐β1誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞分泌纖粘連蛋白的抑制作用可以反映化合物的抗腎臟纖維化效果，這已經(jīng)成為業(yè)界共識(shí)，但目前關(guān)于這方面的小分子藥物還比較缺乏。

反柄紫芝(Ganoderma cochlear)與紫芝具有類似功效，在民間被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)其含有抗腎臟纖維化活性物質(zhì)，而現(xiàn)有技術(shù)中未見有本發(fā)明涉及的化合物及其抗腎臟纖維化的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供具有抗腎臟纖維化價(jià)值的化合物cochlearoids A-D(1-4)及cochlearine B(5)及其該發(fā)明的化合物在制備抗腎臟纖維化的藥物中的應(yīng)用，以及以該化合物為有效成分的藥物組合物。

本發(fā)明的上述目的是由下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

具有下述結(jié)構(gòu)式的cochlearoids A-D(1-4)及cochlearine B(5)：

(+)-1和(-)-1R₁＝H,R₂＝A,R₃＝OAc

(+)-2和(-)-2R₁＝H,R₂＝A,R₃＝H

(+)-3和(-)-3R₁＝H,R₂＝B,R₃＝OH

(+)-4和(-)-4R₁＝B,R₂＝H,R₃＝OH

(+)-1,(+)-2,(+)-3,(+)-4:7R,9S,13S

(-)-1,(-)-2,(-)-3,(-)-4:7S,9R,13R

(+)-5和(-)-5

(+)-5:5S,6R

(-)-5:5R,6S

制備所述的化合物1-5的方法，取反柄紫芝(Ganoderma cochlear)子實(shí)體100kg，粉碎后用70％的乙醇室溫提取(6×300L×48h)，合并提取液并減壓回收溶劑得粗提取物，將粗提取物混懸于適量水中，然后用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物(2kg)。經(jīng)硅膠色譜柱進(jìn)行分離，以氯仿：甲醇(100:1–1:1)梯度洗脫，每種溶劑梯度為1.5倍柱體積，按照每份2000mL收集得7個(gè)合并組份；組份6(160g)經(jīng)MCI gel CHP 20P柱層析(MeOH：H₂O,60％-100％)，TLC檢測合并斑點(diǎn)相同組分得12個(gè)組份(組份6.1-6.12)。組份6.10(18g)經(jīng)Sephadex LH‐20(MeOH)分離得到5個(gè)組份(組份6.5.1-6.5.5)。其中組份6.5.3(100mg)經(jīng)半制備液相色譜儀(MeOH:H₂O，66:34)分離得到消旋的化合物5(6.8mg)。組份6.11(40g)經(jīng)硅膠色譜柱進(jìn)行分離，以(石油醚:丙酮，30:1–1:1)梯度洗脫，收集得7個(gè)合并組份(組份6.11.1-6.11.7)；其中組份6.11.5(3g)經(jīng)Sephadex LH‐20(MeOH)分離得到5個(gè)組份；其中組份6.11.5.4(300mg)經(jīng)半制備液相色譜儀(acetonitrile:H₂O，88:12)分離得到消旋的化合物1(3.1mg)、2(1.2mg)、3(1.8mg)、4(2.0mg)和5(1.1mg)?；衔?-4經(jīng)IC柱，化合物5經(jīng)AD‐H柱手性拆分為它們的對映體。化合物1-5手性拆分的流動(dòng)相條件分別為n‐hexane/ethanol(90:10)，n‐hexane/ethanol,(92:8)，n‐hexane/ethanol(90:10)，n‐hexane/ethanol(84:16)，n‐hexane/ethanol(70:30)。(Table 1)，流速均為1mL/min。

治療腎臟纖維化的藥物組合物，含有治療有效量的上述化合物和藥學(xué)上可接受的載體。

上述化合物在制備治療腎臟纖維化藥物中的應(yīng)用。

上述化合物在制備保健食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明化合物可以單獨(dú)直接應(yīng)用或組合應(yīng)用，也可以與其它藥物包括植物提取物組成復(fù)方的形式使用，可以使用不同的藥用輔料，制成多種固體制劑和液體制劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)口服和注射兩種形式給藥。使用量可根據(jù)給藥途徑、患者的年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化進(jìn)行一次或多次使用。

附圖說明：

圖1表示化合物抑制TGF‐β1誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞分泌纖粘蛋白。#p<0.01,TGF‐β1組versus Control組；*p<0.05,**p<0.01,加藥組versus TGF‐β1組；抑制率％＝(造模組纖粘連蛋白含量-藥物組纖粘連蛋白含量/造模組纖粘連蛋白含量-對照組纖粘連蛋白含量)x 100％。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：

化合物1–5的分離純化：

取反柄紫芝(Ganoderma cochlear)子實(shí)體100kg，粉碎后用70％的乙醇室溫提取(6×300L×48h)，合并提取液并減壓回收溶劑得粗提取物，將粗提取物混懸于適量水中，然后用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物(2kg)。經(jīng)硅膠色譜柱進(jìn)行分離，以氯仿：甲醇(100:1–1:1)梯度洗脫，每種溶劑梯度為1.5倍柱體積，按照每份2000mL收集得7個(gè)合并組份；組份6(160g)經(jīng)MCI gel CHP 20P柱層析(MeOH：H₂O,60％-100％)，TLC檢測合并斑點(diǎn)相同組分得12個(gè)組份(組份6.1-6.12)。組份6.10(18g)經(jīng)Sephadex LH‐20(MeOH)分離得到5個(gè)組份(組份6.5.1-6.5.5)。其中組份6.5.3(100mg)經(jīng)半制備液相色譜儀(MeOH:H₂O，66:34)分離得到消旋的化合物5(6.8mg)。組份6.11(40g)經(jīng)硅膠色譜柱進(jìn)行分離，以(石油醚:丙酮，30:1–1:1)梯度洗脫，收集得7個(gè)合并組份(組份6.11.1-6.11.7)；其中組份6.11.5(3g)經(jīng)Sephadex LH‐20(MeOH)分離得到5個(gè)組份；其中組份6.11.5.4(300mg)經(jīng)半制備液相色譜儀(acetonitrile:H₂O，88:12)分離得到消旋的化合物1(3.1mg)、2(1.2mg)、3(1.8mg)、4(2.0mg)和5(1.1mg)?；衔?-4經(jīng)IC柱，化合物5經(jīng)AD‐H柱手性拆分為它們的對映體?；衔?-5手性拆分的流動(dòng)相條件分別為n‐hexane/ethanol(90:10)，n‐hexane/ethanol,(92:8)，n‐hexane/ethanol(90:10)，n‐hexane/ethanol(84:16)，n‐hexane/ethanol(70:30)。(Table 1)，流速均為1mL/min。

化合物1–5的結(jié)構(gòu)確證：

化合物1–5的結(jié)構(gòu)式如下所示：

(+)-1和(-)-1R₁＝H,R₂＝A,R₃＝OAc

(+)-2和(-)-2R₁＝H,R₂＝A,R₃＝H

(+)-3和(-)-3R₁＝H,R₂＝B,R₃＝OH

(+)-4和(-)-4R₁＝B,R₂＝H,R₃＝OH

(+)-1,(+)-2,(+)-3,(+)-4:7R,9S,13S

(-)-1,(-)-2,(-)-3,(-)-4:7S,9R,13R

(+)-5和(-)-5

(+)-5:5S,6R

(-)-5:5R,6S

化合物1–5的結(jié)構(gòu)鑒定：Table 1.¹NMR數(shù)據(jù)

Table 2 ¹³C NMR數(shù)據(jù)

Cochlearoid A(1):yellowish gum；{[α]_D²³+35.2(c 0.16,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₃+3.33,Δε₂₃₉+7.85,Δε₂₈₂–2.58；(+)-cochlearoid A}；{[α]_D²⁰–44.5(c 0.15,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₃–7.77,Δε₂₃₉–7.18；(–)-cochlearoid A}；UV(MeOH)λ_max(logε)337(3.91),204(4.70)nm；EIMS m/z 656[M]⁺；HREIMS m/z 656.3347[M]⁺(calcd for C₄₀H₄₈O₈,656.3349).¹H and ¹³C NMR data,see Tables 1 and 2.

Cochlearoid B(2):yellowish gum；{[α]_D²⁴+99.0(c 0.10,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₃+7.0,Δε₂₃₉+18.25,Δε₂₇₈–4.53,Δε₃₂₅+3.43；(+)-cochlearoid B}；{[α]_D²⁴–98.4(c 0.17,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₃–5.82,Δε₂₃₉–11.76,Δε₂₇₈+2.91,Δε₃₂₅–2.33；(–)-cochlearoid B}；UV(MeOH)λ_max(logε)339(3.86),203(4.61)nm；ESIMS m/z 597[M-H]^-；HREIMS m/z 598.3306[M]⁺(calcd for C₃₈H₄₆O₆,598.3294)；¹H and ¹³C NMR data,see Tables 1 and 2.

Cochlearoid C(3):yellowish gum；{[α]_D²³+84.6(c 0.13,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₃+3.97,Δε₂₄₁+21.72,Δε₂₇₉–5.83,Δε₃₂₄+1.99；(+)-cochlearoid C}；{[α]_D²³–89.2(c 0.11,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₃–4.69,Δε₂₄₁–26.84,Δε₂₇₉+5.77,Δε₃₂₄–3.49；(–)-cochlearoid C}；UV(MeOH)λ_max(logε)336(4.04),203(4.76)nm；ESIMS m/z 681[M–H]^-；HREIMS m/z 682.3879[M]⁺(calcd for C₄₃H₅₄O₇,682.3870)；¹H and ¹³C NMR data,see Tables 1 and 2.

Cochlearoid D(4):yellowish gum；{[α]_D²³+58.3(c 0.06,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₅–18.75,Δε₂₄₁+25.77,Δε₂₈₂–6.76,Δε₃₄₅–4.68；(+)-cochlearoid D}；{[α]_D²³–50.7(c 0.14,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₁₅+13.48,Δε₂₄₁–19.51,Δε₂₈₂+3.46,Δε₃₄₅+1.92；(–)-cochlearoid D}；UV(MeOH)λ_max(logε)343(4.07),232(4.52),203(4.75)nm；ESIMS m/z 681[M–H]^-；HREIMS m/z 682.3881[M]⁺(calcd for C₄₃H₅₄O₇,682.3870)；¹H and ¹³C NMR data,see Tables 1 and 2.

Cochlearine B(5):yellowish gum；{[α]_D²³+42.8(c 0.14,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₀₄+12.49,Δε₂₃₉–23.95,Δε₃₄₉+6.50；(+)-cochlearine B}；{[α]_D²³–43.3(c 0.23,MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₀₄–15.02,Δε₂₃₉+19.96,Δε₃₄₉–6.52；(–)-cochlearine B}；UV(MeOH)λ_max(logε)345(3.68),315(3.71),276(3.89),203(4.57)nm；ESIMS m/z 524[M–H]^-；HREIMS m/z 525.1783[M]⁺(calcd for C₃₁H₂₇NO₇,525.1788)；¹H and ¹³C NMR data,see Tables 1and 2.

實(shí)施例2：

實(shí)施例1中化合物中的任一種，按常規(guī)法加注射用溶媒，精濾，灌封滅菌后可制成注射液。

實(shí)施例3：

實(shí)施例1中化合物中的任一種，按常規(guī)法配以各種藥用輔料可制成片劑。

使用實(shí)施例1中化合物中的任一種作為藥物活性成分，使用幾種賦形劑作為制備組合藥物片劑的輔料成分，按照一定比例配比制成每片含有藥物成分1-100mg的片劑樣品。

實(shí)施例4：

實(shí)施例1中化合物中的任一種按常規(guī)法配以各種藥用輔料可制成膠囊劑：

含有實(shí)施例1中化合物中的任一種作為有效成分的藥物組合膠囊制劑的制備，使用實(shí)施例1中化合物中的任一種作為藥物活性成分、使用幾種賦形劑作為制備組合藥物膠囊劑的輔料成分，按照一定比例配比制成每粒膠囊中含有化合物成分1-100mg的膠囊制劑。

實(shí)施例5：

取實(shí)施例1的方法制得的化合物1份，10份植脂末，混勻，按照常規(guī)方法制成固體飲料。

實(shí)施例6：

本發(fā)明化合物及其與藥用輔料組成的藥物組合物的抗腎臟纖維化的藥理作用。

采用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清Fibronectin(FN)表達(dá)水平。用純化的抗Fibronectin抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入含表達(dá)Fibronectin的待測樣品，再與HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成抗體‐抗原‐酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Fibronectin的表達(dá)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中Fibronectin濃度。

樣本處理：

1)細(xì)胞培養(yǎng)上清：無菌管收集，2,000rpm/min，離心20min。仔細(xì)收集上清。分裝凍存于‐80℃。

2)刮取底壁細(xì)胞，總蛋白裂解液裂解，12,000rpm，4℃離心10min，收集上清，Bradford法測量總蛋白含量。

ELISA檢測：

操作按試劑盒說明進(jìn)行：

1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：酶標(biāo)包被板設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，倍比稀釋(稀釋后各孔加樣量都為100μL)加入Fibronectin的標(biāo)準(zhǔn)品。

2)加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品和酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同)、待測樣品孔(樣品稀釋度為10倍)，每孔加入50μL稀釋的Bio‐conjugate試劑，輕輕晃動(dòng)混勻。

3)溫育：室溫，2h。

4)洗滌：棄去板中液體，甩干，洗液洗6次，30秒/次。吸水紙拍干。

5)加酶：每孔加入100μL稀釋的Streptavidin‐HRP試劑。

6)溫育：室溫，1h。

7)洗滌：棄去板中液體，甩干，洗液洗6次，30秒/次。吸水紙拍干。

8)顯色：每孔加入TMB Substrate Solution 100μL。室溫，10min。

9)終止：每孔加入終止液100μL。

10)測定：以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀450nm讀吸光度(OD值)。

11)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果計(jì)算：利用標(biāo)準(zhǔn)品定量曲線分析計(jì)算樣品濃度并以control組Fibronectin含量校正，得出相對含量。

以上結(jié)果表明化合物1-5的對映體均不同程度地抑制TGF‐β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞分泌纖粘連蛋白，鑒于該指標(biāo)是腎臟纖維化病理的主要表現(xiàn)之一，與臨床疾病密切相關(guān)，因此表明本發(fā)明化合物具有抗腎臟纖維化作用。