本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及奧貝膽酸衍生物及其制備方法與在制藥中的用途，尤其涉及奧貝膽酸衍生物在制備預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的藥物中的用途，其中，所述 FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況選自慢性肝病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，淤膽失調(diào)，代謝疾?。粌?yōu)選地，所述腎病為糖尿病腎??；所述心血管疾病選自動脈硬化，血脂障礙，高膽固醇血癥，高甘油三酯血癥，其中動脈硬化為動脈粥樣硬化。
背景技術(shù)：
奧貝膽酸是一種半合成的鵝去氧膽酸，也是法尼酯衍生物X受體的特異性激動劑，動物試驗已證明其改善IR和減輕肝臟脂肪含量的作用。
臨床試驗證明了奧貝膽酸除增加胰島素敏感性外，尚可改善肝臟炎癥和纖維化水平，并有一定的減輕體質(zhì)量作用阻司。
類法尼醇X受體(FXR)最初是孤兒核受體(orphan nuclear receptors)，其首次從鼠肝cDNA文庫被鑒定(B.M Forman等，Cell. 81：687-693 (1995))，它們是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核受體的家族成員，包括類固醇、類視黃醇和甲狀腺激素的受體(D.J．Mangelsdorf等，Cell. 83:841-850 (1995)).
如W0 00/37077所描述的，幾種天然型的膽汁酸(特別是鵝膽酸、脫氧膽酸、石膽酸(litocholic acids)以及與?；撬岷透拾彼岬南嚓P(guān)軛合物）結(jié)合在一起并以生理濃度激活FXR。還認(rèn)為FXR參與調(diào)節(jié)膽汁酸和膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
近來已經(jīng)將法尼酯X受體(FXR)以及孕烷X受體(PXR)鑒定為膽汁酸的特舁性核受體。通過法尼酯X受體的活化，膽汁酸抑制膽汁酸合成作用中的所述限速酶的表達，其中所述的限速酶是膽固醇7a-羥化酶(Cyp7a)。膽汁酸對孕烷X受體的活化同時引發(fā)了所述膽固醇7a-羥化酶的表達以及所述膽汁酸代謝酶細(xì)胞色素P4503a的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)(transcriptional induction)。還己知在高濃度下的膽汁酸對于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性以及巨噬細(xì)胞的功能會表現(xiàn)出免疫抑制作用。膽汁酸包括脫氧膽酸(DCA)以及鵝脫氧膽酸(CDCA)，已經(jīng)證明它們對于存在于巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞因子的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)型升高具有抑制活性，其中所述的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(11)-l，白細(xì)胞介素-6，以及腫瘤壞死因子Q (TNF Q)。
奧貝膽酸的另一不足是該藥尚有半衰期短，口服利用率不高的缺陷。
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于通過對奧貝膽酸的結(jié)構(gòu)改造，合成了一系列奧貝膽酸衍生物的新化合物，化合物進入體內(nèi)后的半衰期顯著延長，口服利用率明顯提高。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，設(shè)計、合成新型奧貝膽酸衍生物，從而開發(fā)療效好、副作用小的用于預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病的新的藥物。
具體而言，本發(fā)明第一方面提供了具有以下式(I)所示的奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w。
本發(fā)明第二方面提供制備本發(fā)明第一方面所述奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w的方法。
本發(fā)明第三方面提供制備本發(fā)明第一方面所述奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w。
本發(fā)明第四方面提供了本發(fā)明第一方面所述奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w在用于預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的藥物中的用途，其中，所述 FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況選自慢性肝病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，淤膽失調(diào)，代謝疾病；優(yōu)選地，所述腎病為糖尿病腎??；所述心血管疾病選自動脈硬化，血脂障礙，高膽固醇血癥，高甘油三酯血癥，其中動脈硬化為動脈粥樣硬化。
本發(fā)明第五方面提供一種藥物組合物，其包括臨床有效劑量的本發(fā)明第一方面所述奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w以及任選的藥學(xué)可接受的載體。
附圖說明
圖1為試驗例2藥代動力學(xué)評價
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明第一方面提供了具有式(I)所示的式(I)所示的奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w，
（I）
其中：
m 為0至1的整數(shù)；
n 為0至6的整數(shù)；
R1或R2是獨立是氫或C1-C8烷基或任選地取代的C1-C8烷基；
R3或R4是獨立是氫， ， ，或 ；
（波浪線表示連接位置）；其中R5為氨基酸側(cè)鏈基團，所述氨基酸選自：賴氨酸、精氨酸、組氨酸、鳥氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丙酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸；其中所述氨基酸包括D氨基酸、L氨基酸以及DL氨基酸。
R6或R7獨立地是氫、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10烷氧基、芳基 C1-C10烷基、鹵素、酰氨基、磺酰氨基、酰氧基或 C(O)R’，其中所述 R’為氫、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10烷氧基、芳基 C1-C10烷基、鹵素、酰氨基、磺酰氨基或酰氧基。
本發(fā)明提供奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w，其中所述化合物中具有代表性的化合物如下：
化合物1-1：
化合物1-2：
化合物1-3：
化合物2-1：
化合物2-2：
化合物2-3：
化合物3-1：
化合物3-2：
化合物3-3：
化合物4-1：
化合物4-2：
化合物4-3：
化合物5：
化合物6-1
化合物6-2
化合物6-3
化合物7：
化合物8：
化合物9：
化合物10：
化合物11
化合物12
。
本發(fā)明所用術(shù)語“藥用鹽”指可保留母體化合物預(yù)期生理活性而不會產(chǎn)生任何意料之外毒副作用的鹽，例如：鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽、磷酸鹽，硝酸鹽，以及醋酸鹽，草酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，蘋果酸鹽，苯甲酸鹽，雙羥萘酸鹽，海藻酸鹽，甲磺酸鹽，萘磺酸鹽、鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽、膽堿鹽、葡甲胺鹽等。
所述的溶劑化合物為水合物、醇合物等。
選擇和制備藥物可接受的鹽或溶劑化合物等是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，本發(fā)明的化合物1-6可以通過下述方式制備：
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，本發(fā)明的化合物7、化合物8可以通過下述方式制備：
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，本發(fā)明的化合物9、化合物10可以通過下述方式制備：
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，本發(fā)明的化合物11、化合物12可以通過下述方式制備：
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w，在制備用于預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的藥物中的用途，其中，所述 FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況選自慢性肝病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，淤膽失調(diào)，代謝疾病；優(yōu)選地，所述腎病為糖尿病腎?。凰鲂难芗膊∵x自動脈硬化，血脂障礙，高膽固醇血癥，高甘油三酯血癥，其中動脈硬化為動脈粥樣硬化。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w的藥物組合物，其包括臨床有效劑量的本發(fā)明奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、多晶型體、外消旋混合物或?qū)τ丑w以及任選的藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明所獲得的奧貝膽酸衍生物或其藥用鹽、溶劑化合物、外消旋混合物或?qū)τ丑w可以單獨或以藥物組合的形式給藥。本發(fā)明藥物組合可根據(jù)給藥途徑配成各種適宜的劑型。使用一種或多種生理上可接受的載體，包含賦形劑和助劑，它們有利于將活性化合物加工成可以在藥學(xué)上使用的制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┬问饺Q于所選擇的給藥途徑，可以按照本領(lǐng)域熟知的常識進行制造。
給藥途徑可以是口服、非腸道或局部給藥，優(yōu)選口服和注射形式給藥?？梢钥诜慕o藥制劑包括膠囊劑、顆粒劑和片劑等。患者吞咽有困難時，也可以采用舌下片或者其它非吞咽的方式給藥。本發(fā)明化合物也可以用于配制用于胃腸外給藥或者透皮給藥或者經(jīng)黏膜給藥?；蛘卟捎盟▌┗蛘呗裰矂┑姆绞浇o藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明化合物可以采用合適的藥物釋放系統(tǒng)以得到更有利的效果。
另外需要指出，本發(fā)明化合物使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、健康狀況、營養(yǎng)狀況、化合物的活性強度、使用時間、代謝速率、病癥的嚴(yán)重程度以及診治醫(yī)生的主觀判斷。優(yōu)選的使用劑量介于0.01～60mg/kg；最好24小時的給藥量為每公斤0.05～30mg，也可采用幾次給藥方式。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明，但應(yīng)理解本發(fā)明的范圍非僅限于這些實施例的范圍。
實施例1：化合物1-1的合成
在水浴條件下，Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸(44mmol，15.2g)、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用無水二氯甲烷 (30ml) 攪拌溶解。隨后加入6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)，常溫攪拌過夜。過濾除去固體不溶物，濾液蒸干溶劑；加乙醚到殘余物中，過濾除去溶液中的不溶雜質(zhì)。濾液濃縮，以乙醚為展開劑快速過柱，收集產(chǎn)物餾分。減壓濃縮得產(chǎn)物8.3g；化合物1。
ESI-MS m/z：676（M+1）+
實施例2：化合物1-2的合成
合成方法參考實施例 1，用Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-D-賴氨酸替換 Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸。得到化合物1-2。
ESI-MS m/z：676（M+1）+
實施例3：化合物1-3的合成
合成方法參考實施例 1，用Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-DL-賴氨酸替換 Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸。得到化合物1-3。
ESI-MS m/z：676（M+1）+
實施例4：化合物2-1的合成
在水浴條件下，Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸鹽酸鹽(44mmol，15.2g)、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用無水二氯甲烷 (30ml) 攪拌溶解。隨后加入6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)，常溫攪拌過夜。過濾除去固體不溶物，濾液蒸干溶劑；加乙醚到殘余物中，過濾除去溶液中的不溶雜質(zhì)。濾液濃縮，以乙醚為展開劑快速過柱，收集產(chǎn)物餾分。減壓濃縮得產(chǎn)物7.9g；化合物2收率72.3%。
ESI-MS m/z：732（M+1）+
實施例5：化合物3-1的合成
在水浴條件下，Nα-叔丁氧羰基-Nim-三苯甲基-L-組氨酸(44mmol，15.2g)、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用無水二氯甲烷 (30ml) 攪拌溶解。隨后加入6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)，常溫攪拌過夜。過濾除去固體不溶物，濾液蒸干溶劑；加乙醚到殘余物中，過濾除去溶液中的不溶雜質(zhì)。濾液濃縮，以乙醚為展開劑快速過柱，收集產(chǎn)物餾分。減壓濃縮得產(chǎn)物7.0g；化合物3收率64.0%。
ESI-MS m/z：694（M+1）+
實施例6 ：化合物4-1的合成
在水浴條件下，N-叔丁氧羰基-N'-(2-氯芐氧羰基)-L-鳥氨酸(44mmol，15.0g)、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用無水二氯甲烷 (30ml) 攪拌溶解。隨后加入6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)，常溫攪拌過夜。過濾除去固體不溶物，濾液蒸干溶劑；加乙醚到殘余物中，過濾除去溶液中的不溶雜質(zhì)。濾液濃縮，以乙醚為展開劑快速過柱，收集產(chǎn)物餾分。減壓濃縮得產(chǎn)物8.1g；化合物4收率74.1%。
ESI-MS m/z：648（M+1）+
實施例7 ：化合物5的合成
在水浴條件下，Nα- 叔丁氧羰基-甘氨酸(44mmol，14.6g)、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用無水二氯甲烷 (30ml) 攪拌溶解。隨后加入6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)，常溫攪拌過夜。過濾除去固體不溶物，濾液蒸干溶劑；加乙醚到殘余物中，過濾除去溶液中的不溶雜質(zhì)。濾液濃縮，以乙醚為展開劑快速過柱，收集產(chǎn)物餾分。減壓濃縮得產(chǎn)物7.8g；化合物5收率71.4%。
ESI-MS m/z：534（M+1）+
實施例8 ：化合物6-1的合成
在水浴條件下，將6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氫呋喃中，加入2gNaH，攪拌2h，加入Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸鹽酸鹽(22mmol，7.6g)、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，常溫攪拌過夜。過濾除去固體不溶物，濾液蒸干溶劑；加乙醚到殘余物中，過濾除去溶液中的不溶雜質(zhì)。濾液濃縮，以乙醚為展開劑快速過柱，收集產(chǎn)物餾分。減壓濃縮得產(chǎn)物7.8g；化合物6-1收率71.4%。
ESI-MS m/z：576（M+1）+
實施例9：化合物6-2的合成
合成方法參考實施例8，用Nα-叔丁氧羰基-D-精氨酸鹽酸鹽替換 Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸鹽酸鹽。得到化合物6-2。
實施例10：化合物6-2的合成
合成方法參考實施例8，用Nα-叔丁氧羰基-精氨酸鹽酸鹽替換 Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸鹽酸鹽。得到化合物6-3。
實施例11：化合物7的合成
6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)，丁二酸酐 (4.8g，48mmol) 依次加入甲苯 (100mL)中，然后加入 4-(N，N- 二甲基氨基 )吡啶（1.22g，10mmol) 反應(yīng)混合液在70～90℃攪拌 8個小時，減壓去除溶劑，并濃縮至干將殘余物通過HPLC分離（TFA）系統(tǒng)，得到產(chǎn)物6.3g；化合物7收率75.0%。
ESI-MS m/z：620（M+1）+
實施例11：化合物8的合成
在水浴條件下，將6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氫呋喃中，加入2gNaH，攪拌2h，加入丁二酸酐 (2.4g，24mmol) ， 4-(N，N- 二甲基氨基 )吡啶（1.22g，10mmol) 反應(yīng)混合液在70～90℃攪拌 8個小時，減壓去除溶劑，并濃縮至干將殘余物通過HPLC分離（TFA）系統(tǒng)，得到產(chǎn)物6.2g；化合物8收率56.3%。
ESI-MS m/z：520（M+1）+
實施例12 ：化合物9的合成
將6-乙基鵝去氧膽酸(5.0g,14.8mmol)和 TEA(6.0g,59.2mmol)在無水DCM(50mL) 中的攪拌溶液中逐滴加入三氯氧磷(5.3g,36mmol)然后在室溫下攪拌該混合物12小時，用水淬滅反應(yīng)。用 NaHCO3溶液和鹽水洗滌有機層，經(jīng)無水Na2SO4干燥，濃縮至干。用硅膠柱以 (PE:EA=30:1-1:1) 純化殘余物，得產(chǎn)物2.6g,化合物9收率23.6%。
ESI-MS m/z：580（M+1）+
實施例13 ：化合物10的合成
在水浴條件下，將6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氫呋喃中，加入2gNaH，攪拌2h，加入 TEA(6.0g,59.2mmol)在無水DCM(50mL) 中的攪拌溶液中逐滴加入三氯氧磷(2.6g,18mmol)然后在室溫下攪拌該混合物12小時，用水淬滅反應(yīng)。用 NaHCO3溶液和鹽水洗滌有機層，經(jīng)無水Na2SO4干燥，濃縮至干。用硅膠柱以 (PE:EA=30:1-1:1) 純化殘余物，得產(chǎn)物3.1g,化合物10收率28.1%。
ESI-MS m/z：500（M+1）+
實施例14 ：化合物11的合成
在-10℃和N2下，加入6-乙基鵝去氧膽酸(4.8g,14.1mmol)和NaI(4.30g,28.2mmol) 在無水THF(18mL)中的攪拌溶液中逐滴加入 LHMDS(42.3mL,THF中1.0M,28.5mmol)，然 后 在 室 溫 下 攪 拌 該 混 合 物 30分鐘，之后加入二叔丁基氯甲基磷酸酯(2.0g,48mmol)，再攪拌10小時。用NH4Cl溶液淬滅反應(yīng)，用 EA 萃取。用 NaHCO3溶液和鹽水洗滌有機層，經(jīng)無水Na2SO4干燥，濃縮至干。用硅膠柱以(PE:EA=50:1-3:1)純化殘余物，得產(chǎn)物2.6g,47%。
在 0℃下，加入上述得到的產(chǎn)物(2.5g,4.47mmol) 在無水 DCM(14mL) 中的溶液中加入TFA(8.3mL)。然后攪拌該混合物30分鐘，在減壓下去除溶解，并濃縮至干。將殘余物通過HPLC分離 (TFA) 系統(tǒng)，得到化合物11(1.2g,40%)，為白色固體。
ESI-MS m/z：640（M+1）+
實施例15 ：化合物12的合成
在水浴條件下，將6-乙基鵝去氧膽酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氫呋喃中，加入2gNaH，攪拌2h，加入NaI(4.30g,28.2mmol) 在無水THF(18mL)中的攪拌溶液中逐滴加入 LHMDS(22mL,THF中1.0M,14.3mmol)，然 后 在 室 溫 下 攪 拌 該 混 合 物 30分鐘，之后加入二叔丁基氯甲基磷酸酯(2.0g,48mmol)，再攪拌10小時。用NH4Cl溶液淬滅反應(yīng)，用 EA 萃取。用 NaHCO3溶液和鹽水洗滌有機層，經(jīng)無水Na2SO4干燥，濃縮至干。用硅膠柱以(PE:EA=50:1-3:1)純化殘余物，得產(chǎn)物2.5g,45%。
在 0℃下，加入上述得到的產(chǎn)物(2.5g,4.47mmol) 在無水 DCM(14mL) 中的溶液中加入TFA(8.3mL)。然后攪拌該混合物30分鐘，在減壓下去除溶解，并濃縮至干。將殘余物通過HPLC分離 (TFA) 系統(tǒng)，得到化合物12(1.1g,35%)，為白色固體。
ESI-MS m/z：530（M+1）+
比較實施例1：化合物G的制備（CN 104672290 A）
制備方法：在0℃下向化合物(III)(5.52g,30.9mmol) 的 DCM(100mL)溶液中添加Et3N(12.5g,124mmol) 和 Ac2O(9.49g,93mmol)?；旌衔镌?℃下攪拌1小時，室溫下攪拌3小時。逐滴加入DMAP(7.53g,61.8mmol)的 DCM(100mL) 溶液?；旌衔镌?45℃下攪拌10小時。然后通過DCM(1000mL) 稀釋，通過水(1000mL)和鹽水(1000mL) 洗滌，以Na2SO4干燥，過濾，濃縮。粗產(chǎn)品在硅膠上通過柱色譜純化 (以 PE/EtOAc ＝ 50:1至10:1洗脫 )，以獲得化合物6
的白色固體 (6.3g,75％ )。
向化合物6(5.0g,9.9mmol)的DCE(100mL)溶液中添加NIS(3.46g,20mmol)。混合物在500W鎢絲電燈泡下回流4小時。形成的混合物逐滴加入到NaHSO3溶液中。然后通過 DCM(1000mL) 稀釋，通過水(400mL)和鹽水(300mL)洗滌，以Na2SO4進行干燥，過濾，濃縮。粗產(chǎn)品在硅膠上通過柱色譜純化(以PE/EtOAc＝50:1至30:1洗脫)，以獲得化合物7的淡黃色油狀物 (2.6g,47％ )。
將化合物7(2.5g,4.9mmol) 的 P(OEt)3(22.6mL) 溶液回流5小時。冷卻混合物，濃縮以獲得殘渣。通過制備薄層層析 (PE/EtOAc＝2:1)純化，以獲得化合物8(1.9g,76％ )的無色油狀物。(I2作為 TLC 染色劑 )。
在0℃下向化合物8(1.8g,3.5mmol)DCM(22.5mL)溶液中添加TMSI(2.4g,12.4mmol)。混合物在室溫下攪拌12小時，濃縮該混合物。向殘渣中添加NaOMe(1.8g,33.3mmol)的MeOH(36mL) 溶液。形成的混合物在60℃下攪拌 10小時。然后通過DCM(90mL) 稀釋，通過水(45mL)洗滌。將無機層調(diào)節(jié)至 PH＝3，濃縮以獲得固體。將固體在MeOH中稀釋，過濾。濃縮過濾物，以獲得殘渣，通過制備型高效液相色譜純化，以獲得目標(biāo)化合物G(1.0g,45.7% ) 的白色固體。
ESI-MS m/z：456（M+1）+
試驗例1：生物活性
通過離體檢測評價發(fā)明所述的化合物對于TGR5受體的效能以及效力。參見，Kawamata于2003年在J.Biol.Chem.《生物化學(xué)雜志》Vol.（卷）278，NO.（期）11，p.9435-9440中發(fā)表的文獻）。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）檢測對于法尼酯X受體（FXR）的活性，利用不含細(xì)胞的酶聯(lián)免疫吸附試驗（EliSA）向人類法尼酯X受體中補充SRC-1（類固醇受體活化因子-1）肽。參見，Blanchard等人的WO 00/37077，結(jié)果見下表。
結(jié)果顯示；本發(fā)明所述的化合物是有效的X受體的特異性激動劑。化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12的生物活性與奧貝膽酸相比略好或基本一致。
試驗例2:藥代動力學(xué)評價
對本發(fā)明化合物(化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12)與比較實施例化合物（化合物G）進行體內(nèi)藥代動力學(xué)評價。
方法：
發(fā)明化合物(化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12)與比較實施例化合物（化合物G）分別以10g/L的濃度溶于空白溶液(30％PEG-400)中。
實驗動物為雄性小鼠，6至8周齡，體重190-215克，購自購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場?；谛∈篌w重隨機分成13組，每組3只動物。各組小鼠的給藥劑量和途徑見下表。
在藥代動力學(xué)試驗前，將小鼠禁食16小時。然后按照表中所示經(jīng)口服(15mg/kg) 給藥單個劑量的化合物。采取頸靜脈穿刺的方式在給藥后定時收集血液 200μL，其中對于經(jīng)靜脈給藥的動物組，在給藥后 0、15 分鐘、30 分鐘、1 小時、2 小時、4 小時、8 小時和 24 小時收集血液。將血樣收集于具有 EDTA 的樣品管中，立即在 4℃下以 4000rpm 離心血樣5分鐘，然后將血漿轉(zhuǎn)移到另一個樣品管中，儲存于-20攝氏度下。
對樣品進行藥代動力學(xué)檢驗，采用的方法和儀器如下：
HPLC ：Dionex U-3000（Thermo 公司)
System(SerialNO:4353) ；
MS：AB API4000Q Trap LC/MS/MS instrument(Serial NO.AR19020706)
柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2.0×50mm)
流動相：95%乙腈 (0.1%甲酸)和5%乙腈(0.1%甲酸)
定量方法：內(nèi)標(biāo)法
本發(fā)明化合物(上述實施例制備)與比較實施例化合物（比較實施例制備）藥代動力學(xué)結(jié)果下表。
NA：數(shù)據(jù)未得。
結(jié)果下表顯示，化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12的半衰期，均比之前公開的化合物G的半衰期顯著延長。生物利用率比化合物G提高了2～3倍，其中，化合物7的半衰期長達27.5小時，其藥代動力學(xué)圖譜見圖 1。