本發(fā)明屬于離子探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于生物體系中內(nèi)源型過氧亞硝酸根離子檢測探針、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

過氧亞硝酸根離子(ONOO^-)是人體內(nèi)一種具有極高反應(yīng)活性的強(qiáng)氧化性物質(zhì)，線粒體是產(chǎn)生該物質(zhì)的主要細(xì)胞器。它由體內(nèi)的一氧化氮(NO)和超氧陰離子(·O₂^-)反應(yīng)生成，該反應(yīng)速度快，且不需要酶參與。過氧亞硝酸根離子可以和多種生物分子反應(yīng)并參與很多生理過程，因此，過氧亞硝酸根離子與眾多疾病相關(guān)，如休克、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血-再灌注損傷、老年癡呆、免疫系統(tǒng)病等。但是近年來一些研究表明，過氧亞硝酸根離子在免疫及神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等方面也會(huì)產(chǎn)生積極作用。因此，生物體內(nèi)過氧亞硝酸根離子的檢測及生物成像對(duì)生理學(xué)研究有重要意義。

但是，由于過氧亞硝酸根離子活性高、半衰期短、代謝產(chǎn)物復(fù)雜，因此其檢測具有一定難度。目前大多數(shù)過氧亞硝酸根離子檢測的熒光探針都存在反應(yīng)速度較慢、靈敏度較差、選擇性較差等缺點(diǎn)。因此，制備新型高效過氧亞硝酸根離子檢測探針，尤其是開發(fā)新的響應(yīng)單元具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

作為各種廣泛且細(xì)致的研究和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以9,10-二氫吖啶(DHAC)為響應(yīng)開關(guān)可作為過氧亞硝酸根離子檢測探針，在體外或細(xì)胞內(nèi)可快速、專一地檢測過氧亞硝酸根離子?；谶@種發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種過氧亞硝酸根離子檢測探針，其能夠在體外或細(xì)胞內(nèi)檢測過氧亞硝酸根離子，具有很好的專一性和靈敏度。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供過氧亞硝酸根離子檢測探針的合成方法，以及該過氧亞硝酸根離子檢測探針體外或細(xì)胞內(nèi)檢測過氧亞硝酸根離子的具體方法。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1，所述過氧亞硝酸根離子檢測探針的結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明的目的還可以進(jìn)一步由過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1的制備方法來實(shí)現(xiàn)，該方法的合成路線如下：

所述方法具體步驟包括：

步驟i、冰水浴下，稱取鄰碘苯甲酸和濃硫酸于圓底燒瓶中，將過硫酸鉀分批加入所述圓底燒瓶中，反應(yīng)30分鐘后，加入苯，室溫下劇烈攪拌5小時(shí)后，將所述圓底燒瓶中混合物倒在碎冰上，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH大于10后，二氯甲烷萃取，分離有機(jī)相，經(jīng)洗滌、干燥后，減壓蒸餾除去溶劑得到化合物1；

步驟ii、稱取所述步驟i得到的化合物1、2-氨基二苯甲酮以及催化劑于兩口瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺使之溶解，在氬氣氣氛下加熱反應(yīng)5小時(shí)后，減壓蒸餾除去溶劑，向殘留物中加入冰醋酸和濃硫酸，加熱反應(yīng)1小時(shí)后，將所述兩口瓶中混合物倒入冰水中，抽濾并向?yàn)V液中加入堿中和酸，抽濾，得到的濾渣通過柱層析分離得到化合物A-1；

步驟iii、稱取所述步驟ii得到的化合物A-1于無水乙醇中，加入還原劑，在氬氣氣氛下室溫反應(yīng)1小時(shí)后，加入鹽酸淬滅反應(yīng)，再加入堿去除殘余的酸，將反應(yīng)體系倒入水中，抽濾，濾渣重結(jié)晶后得到過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1。

優(yōu)選的是，其中，在所述步驟i中，所述氫氧化鈉溶液的濃度為4～8M。

優(yōu)選的是，其中，在所述步驟ii中，所述催化劑為醋酸銅，堿為吡啶，氬氣氣氛下加熱溫度為90～140℃，加入冰醋酸和濃硫酸后，加熱溫度為90～110℃。

優(yōu)選的是，其中，在所述步驟ii中，氬氣氣氛下加熱溫度為120℃，加入冰醋酸和濃硫酸后，加熱溫度為100℃。

優(yōu)選的是，其中，在所述步驟iii中，所述鹽酸的濃度為2M，堿為吡啶，重結(jié)晶所用的溶劑為丙酮/正己烷混合溶劑體系。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，還提供了所述過氧亞硝酸根離子檢測探針在中性或酸性水溶液中過氧亞硝酸根離子的熒光檢測中的應(yīng)用，其中，當(dāng)過氧亞硝酸根濃度為探針濃度0～1當(dāng)量時(shí)，體系熒光強(qiáng)度與過氧亞硝根離子濃度成線性關(guān)系。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，還提供了所述過氧亞硝酸根離子檢測探針在活細(xì)胞中過氧亞硝酸根離子的檢測中的應(yīng)用。

優(yōu)選的是，其中，所述活細(xì)胞為RAW264.7細(xì)胞株。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

1、通過三步反應(yīng)合成一種過氧亞硝酸根離子檢測針AH-1，該反應(yīng)操作簡單，且可以根據(jù)具體需求預(yù)先對(duì)各單體模塊進(jìn)行修飾，最后組合得到一系列具有不同性能探針分子，如提高探針靶向性、改變熒光發(fā)射波長等，合成方法可拓展性強(qiáng)；

2、過氧亞硝酸根離子檢測針AH-1對(duì)過氧亞硝酸根離子的響應(yīng)具有很好的專一性；

3、過氧亞硝酸根離子檢測針AH-1對(duì)過氧亞硝酸根離子的響應(yīng)具有很好的靈敏度；

4、過氧亞硝酸根離子檢測針AH-1對(duì)過氧亞硝酸根離子的響應(yīng)速度極快；

5、過氧亞硝酸根離子檢測針AH-1及其代謝產(chǎn)物A-1毒性很小，具有很好的生物相容性，因而具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施中探針AH-1及其代謝產(chǎn)物A-1的紫外、熒光光譜圖；

圖2為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中探針在1當(dāng)量過氧亞硝酸根離子作用下，熒光發(fā)射光譜496nm處強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線示意圖；

圖3為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中探針與不同當(dāng)量過氧亞硝酸根離子充分反應(yīng)后，熒光發(fā)射光譜496nm處強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線示意圖；

圖4為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中探針與不同當(dāng)量過氧亞硝酸根離子充分反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜示意圖；

圖5為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中探針與1當(dāng)量不同活性氧化物(ROS)反應(yīng)后，熒光發(fā)射光譜496nm處的強(qiáng)度示意圖；

圖6為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中不同pH條件下，AH-1、A-1以及AH-1與1當(dāng)量過氧亞硝酸根離子作用后熒光發(fā)射光譜496nm處的強(qiáng)度示意圖；

圖7為本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中探針AH-1及其代謝產(chǎn)物A-1的細(xì)胞毒性圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施中探針AH-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝酸根離子檢測的效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

<實(shí)例1>

一種過氧亞硝酸根離子檢測探針，所述過氧亞硝酸根離子檢測探針的結(jié)構(gòu)式如下：

上述過氧亞硝酸根離子檢測探針的制備方的合成路線如下：

所述制備方法的具體步驟包括：

步驟i冰水浴下，將2-碘苯甲酸(12.4g,50mmol)溶于50mL 98％硫酸中。將過硫酸鉀(27.1g,100mmol)分批加到上述體系中，然后繼續(xù)攪拌30分鐘；加入苯(17.8mL,200mmol)；室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后將反應(yīng)物倒在200g碎冰上，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH>10，然后用二氯甲烷萃?。挥袡C(jī)相用300mL二氯甲烷萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑，得到化合物1為13.0g白色固體，產(chǎn)率80％；

步驟ii將化合物1(10.7g,33mmol)，2-氨基二苯甲酮(5.9g,30mmol)和醋酸銅(0.6g,3mmol)加到30mL DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱到120℃，然后繼續(xù)攪拌5小時(shí)；減壓蒸餾除去溶劑，殘留物溶于30mL冰醋酸和10mL98％硫酸的混合溶劑中，加熱至100℃，繼續(xù)攪拌1小時(shí)；冷卻，將反應(yīng)物倒入200mL冰水中；抽濾，向?yàn)V液中加入30mL吡啶，抽濾，濾渣以石油醚：乙酸乙酯＝3:1為洗脫劑，通過硅膠柱純化，得到化合物A-1為1.6g黃色固體，產(chǎn)率19％；

步驟iii將化合物A-1(598mg,2mmol)溶于10mL乙醇中，加入硼氫化鈉(152mg,4mmol)；氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢?小時(shí)；向反應(yīng)體系中加入0.5mL 2M HCl淬滅反應(yīng)，再加入0.5mL吡啶除去殘余的鹽酸，然后將反應(yīng)物倒入50mL水中；抽濾，濾渣用丙酮/正己烷重結(jié)晶，得到化合物AH-1為572mg淡黃色固體，產(chǎn)率95％；

化合物1的結(jié)構(gòu)式及表征如下：

Mp.229～230℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.42(d,J＝6.4Hz,1H),8.00(d,J＝7.0Hz,2H),7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.57(dt,J＝14.8,7.5Hz,3H),7.37(d,J＝7.1Hz,1H),6.74(d,J＝8.3Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ165.84,137.26,134.49,133.52,132.19,131.57,130.31,127.38,116.86,115.97；ESI-MS:m/z C₁₃H₁₀IO₂[M+H]⁺,calcd.324.98,found 324.98.

化合物A-1的結(jié)構(gòu)式及表征如下：

Mp.183～184℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.77(dd,J＝7.0,1.5Hz,1H),8.42–8.35(m,1H),8.11–8.02(m,1H),7.95(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.82–7.67(m,6H),7.60–7.51(m,2H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ166.57,151.15,145.40,145.24,136.50,134.24,133.27,132.36,130.23,129.35,128.89,127.58,127.53,127.00,126.18,124.76,124.74,123.83；ESI-HRMS:m/zC₂₀H₁₄NO₂[M+H]⁺,calcd.300.1019,found 300.1021.

化合物AH-1的結(jié)構(gòu)式及表征如下：

Mp.236～238℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.17(s,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),7.38(d,J＝7.4Hz,1H),7.28–7.06(m,7H),7.01(d,J＝8.1Hz,1H),6.85(dt,J＝12.5,7.5Hz,2H),5.41(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ169.99,147.64,141.69,137.59,134.69,129.92,129.16,128.72,127.65,127.10,126.37,125.02,123.24,121.61,119.16,115.18,111.49,46.25；ESI-HRMS:m/zC₂₀H₁₆NO₂[M+H]⁺,calcd.302.1175,found 302.1179.

<實(shí)例2>

與實(shí)施例1的不同之處是，在制備方法步驟ii中，氬氣氣氛下加熱溫度為90℃，加入冰醋酸和濃硫酸后，加熱溫度為90℃，其余與實(shí)施例1相同，在此不再贅述。

<實(shí)例3>

與實(shí)施例1的不同之處是，在制備方法步驟ii中，氬氣氣氛下加熱溫度為140℃，加入冰醋酸和濃硫酸后，加熱溫度為110℃，其余與實(shí)施例1相同，在此不再贅述。

<實(shí)例4>

過氧亞硝酸根離子儲(chǔ)備液的制備：

將50mL堿性過氧化氫溶液(pH≈12)與等摩爾亞硝酸異戊酯混合，冰浴下攪拌4小時(shí)，然后將反應(yīng)液用正己烷萃取2次，去除有機(jī)相，水相中加入二氧化錳除去殘余的過氧化氫，抽濾，得到的濾液即為過氧亞硝酸根濃溶液，其濃度利用其在302nm處的吸光度與摩爾吸光系數(shù)(ε₃₀₂＝1670M^-1cm^-1)計(jì)算。濃溶液用10mM氫氧化鈉溶液稀釋至過氧亞硝酸根濃度為20mM，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

<實(shí)例5>

由實(shí)施例1中過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1及其代謝產(chǎn)物A-1的紫外和熒光光譜測定：

分別配制化合物AH-1和A-1的DMSO溶液(2mM)。用PBS緩沖溶液(pH 7.4,50mM)稀釋至10μM，分別測定其紫外光譜。再將化合物AH-1和A-1稀釋至2μM，分別測定其熒光光譜，如圖1所示。以358nm為激發(fā)波長，化合物A-1的最大發(fā)射波長為496nm。而探針在此波長光束激發(fā)下幾乎沒有熒光發(fā)射，說明探針AH-1符合“點(diǎn)亮型”探針特點(diǎn)。

<實(shí)例6>

由實(shí)施例1中過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1在體外環(huán)境對(duì)過氧亞硝酸根離子的檢測：

向AH-1的PBS溶液(2μM)中加入1當(dāng)量過氧亞硝酸根離子，熒光動(dòng)力學(xué)測試發(fā)現(xiàn)496nm處熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，在約幾秒鐘后熒光不再增強(qiáng)，如圖2所示。這說明探針AH-1對(duì)過氧亞硝酸根離子響應(yīng)速度很快，可以在幾秒鐘內(nèi)完成。

向AH-1的PBS溶液(2μM)中加入不同濃度過氧亞硝酸根離子溶液(0～4μM)，體系熒光光譜如圖3所示。可以觀察到，隨著過氧亞硝酸根離子濃度增加，體系熒光逐漸增強(qiáng)。體系熒光發(fā)射光譜在496nm處熒光強(qiáng)度隨過氧亞硝酸根離子濃度變化的曲線如圖4所示。從圖中可以看出，過氧亞硝酸根離子濃度在0～2μM(0～1當(dāng)量)變化時(shí)，該濃度與體系熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系(R²＝0.999)。由此擬合直線的斜率，通過公式3s/k可以計(jì)算出探針對(duì)過氧亞硝酸根離子的檢出限約為16nM，說明探針AH-1對(duì)過氧亞硝酸根離子的檢測具有極高的靈敏度。

<實(shí)例7>

由實(shí)施例1中過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1在體外環(huán)境對(duì)不同活性氧化物(ROS)的選擇性實(shí)驗(yàn)：

向AH-1的PBS溶液(2μM)中加入不同活性氧化物(第10組為過氧亞硝酸根，2μM,1當(dāng)量；2～9為加入其他活性氧化物的對(duì)照組，20μM,10當(dāng)量；第1組為空白對(duì)照組)，作用30分鐘后，各實(shí)驗(yàn)組在496nm處熒光強(qiáng)度如圖5所示。說明探針AH-1對(duì)過氧亞硝酸根離子具有很好的選擇性。

<實(shí)例8>

實(shí)施例1中過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1在不同pH條件下對(duì)過氧亞硝酸根離子的檢測：

不同pH條件下，分別測定1)探針AH-1，2)代謝產(chǎn)物A-1以及3)探針AH-1與1當(dāng)量過氧亞硝酸根離子反應(yīng)后的溶液熒光強(qiáng)度，各實(shí)驗(yàn)組在496nm處熒光強(qiáng)度隨pH變化曲線如圖6所示，說明探針在生理pH條件下有較好的適用性，尤其是在酸性條件下具有很好的適用性，這可以賦予探針檢測癌細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝酸根離子的能力。

<實(shí)例9>

實(shí)施例1中過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1及其代謝產(chǎn)物A-1的細(xì)胞毒性分析：

為了測定型過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1及其代謝產(chǎn)物A-1的生物相容性，我們利用Raw264.7小鼠巨噬細(xì)胞，通過MTT法測定其細(xì)胞毒性。細(xì)胞在每孔10⁴數(shù)量級(jí)的96孔板中進(jìn)行種植培養(yǎng)。生長環(huán)境為含有5％二氧化碳的空氣氣氛，溫度為37℃。在對(duì)數(shù)級(jí)增長階段進(jìn)行收割，然后將細(xì)胞分組，分別用2μM,10μM,20μM,40μM濃度的AH-1及A-1與細(xì)胞作用，培養(yǎng)12小時(shí)后，加入MTT的PBS溶液(20μL,5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。除去殘留的培養(yǎng)基，向每組中加入100μL DMSO，通過酶標(biāo)儀在490nm處對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行檢測。

各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞毒性分析見圖7。可見，即使在較高濃度下，細(xì)胞存活性依然很高，可以達(dá)到80％以上，說明探針AH-1及其代謝產(chǎn)物A-1細(xì)胞毒性均很低，具有很好的生物相容性。

<實(shí)例10>

實(shí)施例1中過氧亞硝酸根離子檢測探針AH-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝酸根離子的檢測：

為了測定新型過氧亞硝酸根離子檢測針AH-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝酸根離子的檢測，選取生長良好的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞在含有5％二氧化碳的空氣氣氛，溫度為37℃的環(huán)境下培養(yǎng)24h，然后分為以下四組：

1)對(duì)照組(A-1+DOPE)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8A；

2)對(duì)照組(AH-1+DOPE)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8B；

3)加入過氧亞硝酸根離子供體SIN-1(1mM)作用30分鐘，作為外源型過氧亞硝酸根離子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8C；

4)加入脂多糖(LPS，1μg/mL)和γ-干擾素(IFN-γ，50ng/mL)作用4小時(shí)，刺激產(chǎn)生內(nèi)源型過氧亞硝酸根離子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8D；

5)加入脂多糖(LPS，1μg/mL)和γ-干擾素(IFN-γ，50ng/mL)，同時(shí)加入氨基胍(AG，1mM)作用4小時(shí)，阻斷內(nèi)源型過氧亞硝酸根離子產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8E；

6)加入雙氧水(50μL)作用30分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8F；

7)加入次氯酸鈉(50μL)作用30分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8G；

8)加入一氧化氮儲(chǔ)備液(50μL)作用30分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8H；

9)加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA，10nM)作用30分鐘，刺激產(chǎn)生內(nèi)源型羥基自由基，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8I；

然后向上述各實(shí)驗(yàn)組中分別加入探針AH-1(5μM)和等當(dāng)量的DOPE，繼續(xù)作用15分鐘。無論細(xì)胞中有內(nèi)源型或外源型過氧亞硝酸根離子，都可以在綠色通道下觀察到較強(qiáng)的熒光。而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無外界刺激產(chǎn)生過氧亞硝酸根離子，或者產(chǎn)生過氧亞硝酸根離子的過程被阻斷時(shí)，只能觀察到微弱的熒光。作為對(duì)照組加入其它內(nèi)源型或外源型氧化物，如雙氧水、次氯酸鈉、一氧化氮和羥基自由基時(shí)，也不能在綠色通道下觀察到熒光，如圖8所示。說明該新型過氧亞硝酸根離子檢測針AH-1可用于檢測細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝酸根離子，同時(shí)仍具有很好的選擇性。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種過氧亞硝酸根離子檢測針，其合成方法簡單，且該方法拓展性強(qiáng)，同時(shí)本發(fā)明也提供了該探針檢測體外或細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝酸根離子的具體方法，且通過系列實(shí)驗(yàn)證明該探針對(duì)過氧亞硝酸根離子的響應(yīng)迅速，具有極好的靈敏度和選擇性，并且可在較寬的pH范圍內(nèi)使用。同時(shí)，該探針在生物體內(nèi)過氧亞硝酸根離子檢測領(lǐng)域也有很好的應(yīng)用前景。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用。它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域。對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。