本發(fā)明涉及藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種拉科酰胺的制備方法。

背景技術(shù)：

拉科酰胺的化學(xué)名為(R)-2-乙酰胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺，結(jié)構(gòu)式如下式Ⅰ所示，臨床上用于治療癲癇和神經(jīng)性疼痛。

目前拉科酰胺的制備方法一般以D-絲氨酸為起始原料。

例如，美國專利US5773475第一次描述了三種拉科酰胺的制備方法，制備路線如路線1所示，方法一：用D-絲氨酸先做成甲酯，再和芐胺反應(yīng)生成(2R)-2-氨基-N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物2)，然后乙酰化得到(2R)-2-乙酰氨基-N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物3)，最后和碘甲烷，在氧化銀催化，乙腈做溶劑條件下甲基化得到拉科酰胺(化合物1)；方法二：D-絲氨酸用氯甲酸芐酯保護(hù)得到化合物4，然后和碘甲烷，在氧化銀催化，乙腈做溶劑條件下甲基化得到(2R)-2-芐氧羰基氨基-3-羥基丙酸甲酯(化合物5)，式V經(jīng)柱層析純化后水解得到化合物6，再在-78℃條件下，氯甲酸異丁酯反應(yīng)做成混合酸酐，再與芐胺發(fā)生反應(yīng)得到化合物7，化合物7氫化脫去保護(hù)得到化合物8，再乙?；?jīng)柱層析純化得到拉科酰胺；方法三：D-絲氨酸先乙?；玫絅-乙?；?D-絲氨酸，然后冷卻到-78℃，和氯甲酸異丁酯做成混合酸酐，再與芐胺發(fā)生反應(yīng)得到(2R)-2-乙酰氨基--N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物3)，柱層析純化后，與碘甲烷，氧化銀在乙腈中反應(yīng)得到拉科酰胺。

美國專利US2009143472報道了一種制備拉科酰胺的方法，其制備路線如路線2所示，D-絲氨酸用三甲基氯硅烷保護(hù)末端羥基，然后用三苯基氯甲烷保護(hù)氨基，再脫去三甲基硅保護(hù)基得到N-三苯甲基-D-絲氨酸(化合物9)，化合物9用氫化鈉做堿，和碘甲烷在-15℃到-5℃溫度范圍內(nèi)發(fā)生羥甲基化反應(yīng)得到O-甲基-N-三苯甲基-D-絲氨酸(化合物10)，再與氯甲酸異丁酯和芐胺在-78℃條件下，反應(yīng)得到(2R)-2-三苯甲氨基--N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物11)，化合物11脫保護(hù)，得到化合物8，最后和醋酐發(fā)生乙?；磻?yīng)得到拉科酰胺(化合物1)。

美國專利US2008027137報道了一種制備拉科酰胺的方法，其制備路線如圖3所示，D-絲氨酸先用Boc保護(hù)，然后和硫酸二甲酯，在相轉(zhuǎn)移催化劑和NaOH溶液中，或者丁基鋰做堿反應(yīng)得到N-Boc-O-甲基-D-絲氨酸(化合物12)，然后與氯甲酸異丁酯和芐胺在-78℃條件下，反應(yīng)得到(2R)-2-叔丁氧羰基氨基--N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物13)，再在酸性條件下脫掉保護(hù)基，得到化合物8，最后乙?；玫嚼契０?化合物1)。

上述拉科酰胺制備方法具有很多局限性：

1、D-絲氨酸作為起始原料較貴；

2、甲基化用到碘甲烷和氧化銀，比較昂貴；

3、用到劇毒的硫酸二甲酯作為甲基化試劑，而且有少量消旋現(xiàn)象；

4、和芐胺反應(yīng)做酰胺反應(yīng)用到超低溫反應(yīng)；

5、中間體用到柱層析手段，無法工業(yè)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施例的目的在于提供一種拉科酰胺的制備方法，用于解決以D-絲氨酸作為起始原料較貴問題。具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種式Ⅰ所示的拉科酰胺的制備方法，包括以下步驟：

(a1)使式II所示的5-甲氧甲基海因與D-海因酶、海因消旋酶及D-氨甲?；饷附佑|，制得式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；

或

(a2)使式II所示的5-甲氧甲基海因與D-海因酶、海因消旋酶接觸，制得式Ⅲ所示的(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸，再將(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸脫去氨甲?；?，得到式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；

(b)由步驟(a1)或(a2)制得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制備拉科酰胺。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，5-甲氧甲基海因的成本明顯低于D-絲氨酸，顯而易見，本發(fā)明的技術(shù)方案，以5-甲氧甲基海因代替D-絲氨酸作為起始原料，能夠降低拉科酰胺的制備成本。另外，以，5-甲氧甲基海因作為起始原料，無需進(jìn)行甲基化，因此，本發(fā)明的技術(shù)方案可以避免使用昂貴或劇毒的甲基化試劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案，部分步驟采用酶促反應(yīng)，更加綠色環(huán)保。

本文中，所說的術(shù)語“D-海因酶”(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)是一類催化海因、5'取代海因及其衍生物開環(huán)生成N-氨甲?；?D-氨基酸的酰胺水解酶。其可以選自來自放射形土壤桿菌的D-海因酶、來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌的D-海因酶、來自根癌土壤桿菌的D-海因酶、來自糞腸球菌的D-海因酶、來自皮氏伯克霍爾德氏菌的D-海因酶、來自惡臭假單胞菌的D-海因酶，來自黃桿菌的D-海因酶等。其中優(yōu)選來自放射形土壤桿菌D-海因酶。

本文中，所說的術(shù)語“海因消旋酶”(hydantoin racemase,EC 5.1.99.5)是一類催化海因發(fā)生消旋，生產(chǎn)L-海因和D-海因的酶。其可以選自來自放射形土壤桿菌的海因消旋酶、來自根癌土壤桿菌的海因消旋酶和來自黃桿菌的海因消旋酶等。其中優(yōu)選放射形土壤桿菌的海因消旋酶。

本文中，所說的術(shù)語“D-氨甲酰基水解酶”(D-carbamoylase,EC 3.5.1.77)是能高度專一性的脫氨甲?；?，形成游離氨基酸的水解酶。其可以選自放射形土壤桿菌的D-氨甲?；饷?、來自根癌土壤桿菌的D-氨甲酰基水解酶、來自糞腸球菌的D-氨甲酰基水解酶、來自皮氏伯克霍爾德氏菌的D-氨甲酰基水解酶、來自惡臭假單胞菌的D-氨甲酰基水解酶，來自黃桿菌的D-氨甲?；饷傅?。其中優(yōu)選來自放射形土壤桿菌的D-氨甲?；饷浮?/p>

需要說明的是，本發(fā)明的技術(shù)方案中所用到的5-甲氧甲基海因可以通過市售途徑獲得，也可以采用現(xiàn)有的合成方法自行合成。其來源本發(fā)明在此不進(jìn)行限定。

另外，本發(fā)明中所涉及到的D-海因酶、海因消旋酶及D-氨甲酰基水解酶等，既可以通過市售途徑獲得相關(guān)產(chǎn)品，也可以采用基因工程技術(shù)來制備。

可選的，步驟(a1)包括：

獲得表達(dá)D-海因酶的濕菌體、表達(dá)海因消旋酶的濕菌體和表達(dá)D-氨甲酰基水解酶的濕菌體；

將各濕菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎后，制取粗酶液；

使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。

需要說明的是，獲得表達(dá)各酶的濕菌體，以及對濕菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，從而制得粗酶液，均可以采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的技術(shù)手段來實現(xiàn)，本發(fā)明在此不進(jìn)行限定。

在上述可選的技術(shù)方案中，粗酶液的使用量以制備粗酶液所用的各濕菌體計為：0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達(dá)D-海因酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達(dá)海因消旋酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因；0.02-2g，優(yōu)選為0.2-2g表達(dá)D-氨甲?；饷傅臐窬w/1g 5-甲氧甲基海因。硫酸錳的加入量與表達(dá)D-海因酶的濕菌體的質(zhì)量比可以為1：(1-100)，優(yōu)選為1：(20-60)。采用此限定組成的粗酶液，既可以實現(xiàn)低成本、高效率地制得(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。

在具體實施過程中，使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的步驟可以在pH值在7-10的緩沖溶液中進(jìn)行，優(yōu)選在pH值在7-8的緩沖溶液中進(jìn)行，更優(yōu)選在0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中進(jìn)行。

更為具體地，可以將5-甲氧甲基海因加入到pH值在6-10的緩沖溶液，優(yōu)選pH值在7-9的緩沖溶液，更優(yōu)選0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中；再將所制備的粗酶液與之混合，在合適的溫度下，例如30-40℃下反應(yīng)，在反應(yīng)過程中，用無機酸，例如鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，使其維持在6-10，優(yōu)選在7-9左右。利用薄層層析法檢測底物5-甲氧甲基海因完全消耗后，反應(yīng)結(jié)束，一般地，反應(yīng)20-40小時，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液。在后續(xù)的反應(yīng)步驟(b)中，既可以直接利用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液進(jìn)行反應(yīng)，制備拉科酰胺，也可以將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液，濃縮結(jié)晶，提純(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，再利用高純度的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制備拉科酰胺。顯然，考慮到成本，優(yōu)選采用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。對所得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸進(jìn)行旋光度測試，出人意料的發(fā)現(xiàn)，(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的ee(Enantiomeric excess，對映體過量)值不小于99％，優(yōu)選地，不小于99.7％，更優(yōu)選地，不小于99.9％。手性純度極高。使得采用本發(fā)明的技術(shù)方案，中間體(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸不需要采用柱層析等手段進(jìn)行異構(gòu)體的拆分，更有利于拉科酰按制備的工業(yè)化。

可選地，在步驟(a2)中：制取(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸的步驟包括：

獲得表達(dá)D-海因酶的濕菌體及表達(dá)海因消旋酶的濕菌體；

將各濕菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎后，制取粗酶液；

使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸。

如前所述，獲得表達(dá)各酶的濕菌體，以及對濕菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，從而制得粗酶液，均可以采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的技術(shù)手段來實現(xiàn)，本發(fā)明在此不進(jìn)行限定。

在該可選的方案中，粗酶液的使用量以制備粗酶液所用的各濕菌體計為：0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達(dá)D-海因酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達(dá)海因消旋酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因。硫酸錳的加入量與表達(dá)D-海因酶的濕菌體的質(zhì)量比可以為1：(1-100)，優(yōu)選為1：(20-60)。采用此限定組成的粗酶液，既可以實現(xiàn)低成本、高效率地制得(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸。

在具體實施過程中，使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸的步驟可以在pH值在7-10的緩沖溶液中進(jìn)行，優(yōu)選在pH值在7-8的緩沖溶液中進(jìn)行，更優(yōu)選在0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中進(jìn)行。

更為具體地，可以將5-甲氧甲基海因加入到pH值在6-10的緩沖溶液，優(yōu)選pH值在7-9的緩沖溶液，更優(yōu)選0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中；再將所制備的粗酶液與之混合，在合適的溫度下，例如30-45℃下反應(yīng)，在反應(yīng)過程中，用堿，例如氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，使其維持在7-10，優(yōu)選在7-8左右。利用薄層層析法檢測底物5-甲氧甲基海因完全消耗后，反應(yīng)結(jié)束，一般地反應(yīng)20-40小時，得到(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液。在后續(xù)的生成(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的步驟中，既可以直接利用(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液進(jìn)行反應(yīng)制備(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，也可以將(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液，濃縮結(jié)晶，提純(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸，利用高純度的(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸制備(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。

在通過上述的酶促反應(yīng)制得(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸后，可以繼續(xù)采用D-氨甲?；饷高M(jìn)行酶促反應(yīng)，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。也可以在步驟(a2)中：將(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸與亞硝酸鹽，優(yōu)選為亞硝酸鈉反應(yīng)，脫去氨甲?；?，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。對所得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸進(jìn)行旋光度測試，(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸的ee值不小于99％，優(yōu)選地，不小于99.7％，更優(yōu)選地，不小于99.9％。使得采用本發(fā)明的技術(shù)方案，中間體(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸不需要采用柱層析等手段進(jìn)行異構(gòu)體的拆分，更有利于拉科酰按制備的工業(yè)化。

在具體實施過程中，可以將(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸分散于水中，加入濃鹽酸后，再加入亞硝酸鹽水溶液，優(yōu)選加入亞硝酸鈉水溶液，更優(yōu)選滴加亞硝酸鈉水溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。在后續(xù)的反應(yīng)步驟(b)中，既可以直接利用上述用亞硝酸鹽制得的含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，制備拉科酰胺，也可以將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應(yīng)液濃縮結(jié)晶，提純(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，再利用高純度的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制備拉科酰胺。顯然，考慮到成本，優(yōu)選采用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應(yīng)液進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，可選地，步驟(a1)和/或(a2)所用到的D-海因酶、海因消旋酶和/或D-氨甲?；饷笧榻?jīng)過純化處理的酶。也就是說，再得到表達(dá)本發(fā)明的技術(shù)方案所用的酶的菌體后，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)對其進(jìn)行破碎及提純處理，從而獲得高純度，例如純度為95％以上的D-海因酶、海因消旋酶和D-氨甲?；饷福贿M(jìn)而再與5-甲氧甲基海因進(jìn)行酶促反應(yīng)。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，可選地，步驟(b)包括：

(b1)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸與乙酰化試劑反應(yīng)，生成式Ⅴ所示的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸；優(yōu)選地，所述乙酰化試劑選自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴；

具體實施過程中，可以將含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的溶液，例如(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液或提純后的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸重新配制成的溶液，用堿調(diào)節(jié)pH值到8～9，加入乙?；噭?，室溫反應(yīng)8-24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系調(diào)至酸性，并用有機溶劑萃取，將有機萃取相濃縮后，用石油醚打漿，過濾得到(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸。

(b2)使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸與芐胺反應(yīng)生成拉科酰胺。

優(yōu)選地，步驟(b2)包括：

使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在堿和芐胺存在條件下與鹵甲酸烷基酯反應(yīng)生成拉科酰胺；

具體地，可以將(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸溶于有機溶劑中，在低溫的條件下，例如0到-20℃，加入鹵甲酸烷基酯、氮甲基嗎啡啉及芐胺溶液，自然升溫到室溫反應(yīng)2-8小時，反應(yīng)結(jié)束，采用常規(guī)的后處理方法，對制備的拉科酰胺進(jìn)行提純處理。

或

可替代地，使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在縮合劑的存在下，和芐胺反應(yīng)生成拉科酰胺；優(yōu)選地，所述縮合劑選自碳二亞胺類縮合劑，更優(yōu)選地，選自N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)?？梢岳斫獾氖牵褂每s合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，其反應(yīng)條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來是容易實現(xiàn)的，本發(fā)明在此不進(jìn)行贅述。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，可選地，步驟(b)包括：

(b3)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸與氨基保護(hù)試劑反應(yīng)生成式Ⅵ所示的化合物，其中，PG代表氨基保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地，PG代表叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基、芐氧羰基或三苯甲基；

具體實施過程中，可以將含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的溶液，例如(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液或提純后的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸重新配制成的溶液，用堿調(diào)節(jié)pH值到8～9，加入氨基保護(hù)試劑，室溫反應(yīng)8-24小時，反應(yīng)結(jié)束后，采用常規(guī)手段進(jìn)行提純處理，得到式Ⅵ所示的化合物。

(b4)使式Ⅵ所示的化合物與芐胺反應(yīng)，得到式Ⅶ所示的化合物；

優(yōu)選地，步驟(b4)包括：

使式Ⅵ所示的化合物在堿和芐胺存在條件下與鹵甲酸烷基酯反應(yīng)生成式Ⅶ所示的化合物；

具體地，可以將Ⅵ所示的化合物溶于有機溶劑中，在低溫的條件下，例如0到-20℃，加入鹵甲酸烷基酯、氮甲基嗎啡啉及芐胺溶液，自然升溫到室溫反應(yīng)2-8小時，反應(yīng)結(jié)束，采用常規(guī)的后處理方法，對制備的式Ⅶ所示的化合物進(jìn)行提純處理。

或

使式Ⅵ所示的化合物在縮合劑的存在下，和芐胺反應(yīng)生成式Ⅶ所示的化合物。優(yōu)選地，所述縮合劑選自碳二亞胺類縮合劑，更優(yōu)選地，選自N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。

(b5)使式Ⅶ所示的化合物脫保護(hù)基生成式Ⅷ所示的化合物，(R)-2-胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺；

具體實施過程中，可以將Ⅶ所示的化合物溶于有機溶劑中，并向其中加入濃鹽酸，室溫反應(yīng)1-5小時，反應(yīng)完畢，采用常規(guī)的后處理方法，對式Ⅷ所示的化合物進(jìn)行提純處理。

(b6)式Ⅷ所示的化合物與乙?；噭┓磻?yīng)生成拉科酰胺，優(yōu)選地，所述乙?；噭┻x自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴。

具體實施過程中，將式Ⅷ所示的化合物溶于有機溶劑中，加入堿，例如三乙胺，在低溫條件下，例如0～5℃下加乙?；噭覝?，例如25度反應(yīng)1-5個小時，反應(yīng)完畢，采用常規(guī)的后處理方法，對合成出的拉科酰胺進(jìn)行提純處理。

綜上可知，本發(fā)明的技術(shù)方案，以5-甲氧甲基海因代替D-絲氨酸作為起始原料，能夠降低拉科酰胺的制備成本。

不僅如此，以5-甲氧甲基海因作為起始原料，無需進(jìn)行甲基化，可以避免使用昂貴或劇毒的甲基化試劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案，部分步驟采用酶促反應(yīng)，更加綠色環(huán)保。而且，與芐胺的反應(yīng)溫度相對現(xiàn)有技術(shù)也更加溫和。

更為重要的是，本發(fā)明的技術(shù)方案所制備的中間體(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的ee值不小于99％，優(yōu)選地，不小于99.9％，手性純度極高。因此，其不需要采用柱層析等手段進(jìn)行異構(gòu)體的拆分，進(jìn)而使整個拉科酰按的制備過程無需進(jìn)行異構(gòu)體的拆分，工業(yè)化前景好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為2-氨基-3-甲氧基丙酸消旋體的高效液相譜圖；

圖2為實施例2制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的高效液相譜圖；

圖3為實施例5制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的高效液相譜圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行描述，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

首先對表達(dá)D-海因酶的濕菌體、表達(dá)海因消旋酶的濕菌體和表達(dá)D-氨甲?；饷傅臐窬w的制備過程進(jìn)行說明。

(1)D-海因酶原始基因的合成：根據(jù)放射形土壤桿菌的D-海因酶的原始基因序列進(jìn)行目的基因的全合成，合成后的全基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達(dá)載體pET26b-AA-hyd。放射形土壤桿菌D-海因酶氨基酸序列參見GenBank Accession:Q44184。

(2)海因消旋酶原始基因的合成：根據(jù)放射形土壤桿菌的海因消旋酶的原始基因序列進(jìn)行目的基因的全合成，合成后的全基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達(dá)載體pET26b-AA-RA。放射形土壤桿菌的海因消旋酶的氨基酸序列參見GenBank Accession:WP_012650408。

(3)D-氨甲酰基水解酶原始基因的合成：根據(jù)放射形土壤桿菌D-氨甲?；饷傅脑蓟蛐蛄羞M(jìn)行目的基因的全合成，合成后的全基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達(dá)載體pET26b-AA-Car。放射形土壤桿菌D-氨甲?；饷赴被嵝蛄袇⒁奊enBank Accession:Q44185。

(4)濕菌體的制備：將上述重組表達(dá)載體分別通過熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到表達(dá)菌株BL21(DE3)中。分別挑取單菌落，將單菌落接入到5mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，振蕩培養(yǎng)過夜，次日取1mL菌液加入到含卡那霉素的100mL TB培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀至3.0，然后添加IPTG至終濃度為0.1mM，25℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。5000g離心10min后收集菌體，即得到表達(dá)D-海因酶的濕菌體、表達(dá)海因消旋酶的濕菌體和表達(dá)D-氨甲酰基水解酶的濕菌體。

拉科酰胺的制備路線一

實施例1

5-甲氧甲基海因(式II化合物)的制備

溴乙醛縮二乙醇(39.4g，0.2mol)溶于甲醇鈉(10.8g，0.2mol溶于100mL甲醇)溶液中，置于高壓釜內(nèi)，加熱到105～110℃，反應(yīng)1小時，然后冷卻，倒入500mL冰水中，乙醚萃取(200mL×3)，無水硫酸鈉干燥，蒸去乙醚，殘余物減壓蒸餾，收集48～50℃/19mmHg產(chǎn)品，得到甲氧基乙醛縮二乙醇23g，收率78％。¹H NMR(CHCl₃):δ1.182(t,J＝6.8Hz,6H,(CH₂CH₃)₂),δ3.350(s,3H,OCH₃),δ3.402(d,J＝5.2Hz,2H,OCH₂),δ3.533(dd,J＝7.2,9.2Hz,2H,CH₂CH₃),δ3.661(dd,J＝7.2,9.6Hz,2H,CH₂CH₃),δ4.587(t,J＝5.2Hz,1H,CH)。

甲氧基乙醛縮二乙醇(14.8g，0.1mol)加入20mL 5N的鹽酸，室溫攪拌24小時，然后冷卻，加入Na₂SO₃(12.6g，0.1mol)，加入KCN(6.5g，0.1mol溶于50mL水)水溶液，室溫攪拌2小時，加入50mL乙醇和碳酸銨(19.2g，0.2mol)，混合物55℃加熱2小時，活性炭脫色，濃縮掉大部分溶劑，加入3倍體積乙醇，降溫緩慢析晶，固體過濾得5-甲氧甲基海因7.5g，收率52.1％，熔點167～170℃(升華)。¹H NMR(DMSO):δ3.262(s,3H,OCH₃),δ3.496(dd,J＝2.1,10.4Hz,1H,CHH’O),δ3.571(dd,J＝4,10.4Hz,1H,CHH’O),δ4.147(t,J＝3.2Hz,1H,CH),δ7.926(br,1H,NH),δ10.585(br,1H,NH)。

實施例2

(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸(化合物Ⅳ)的制備

將按前述方法獲得的表達(dá)D-海因酶的濕菌體2g、表達(dá)海因消旋酶的濕菌體2g和表達(dá)D-氨甲酰基水解酶的濕菌體4g重懸于20mL 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，超聲破碎后得到粗酶液。

將按照實施例1的方法制備的5g底物5-甲氧甲基海因加入到80mL0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，隨后，將所制的粗酶液溶解0.05g硫酸錳后，加入底物的緩沖液中。在40℃下磁力攪拌反應(yīng)25小時，并用4M鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，使其維持在7.5左右。利用薄層層析法(TLC)檢測底物完全消耗，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液。

將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液濃縮結(jié)晶得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，收率77％，¹H NMR(D₂O):δ3.182(s,3H,OCH₃),δ3.427(m,1H,CH),δ3.493(m,2H,CH₂O)。手性ee值100％。

其中，薄層層析法：薄層板：硅膠G；展開劑：正丁醇/醋酸/水＝4:1:1，Rf＝0.5，茚三酮顯色。

手性ee值采用高效液相色譜法測定：色譜條件：儀器：Aglient(安捷倫)1260高效液相色譜儀，紫外檢測器；色譜柱:CROWNPAK CR+,4.0*150mm,5um；流速:0.2mL/min；柱溫:5℃；檢測波長:200nm；流動相：稱取16.3g 70％高氯酸溶液至1L水中；進(jìn)樣量:10μL；該高效液相色譜譜圖如圖2所示(圖1為2-氨基-3-甲氧基丙酸消旋體的測定譜圖，用于確定兩個異構(gòu)體的出峰位置)，根據(jù)圖2中(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸和其異構(gòu)體的峰面積之比可以確定手性ee值100％。

實施例3

(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(化合物V)的制備

將按照實施例2的方法制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液(約含20g化合物Ⅳ，0.12mol)用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8～9，20℃滴加乙酸酐(19g，0.18mol)，室溫反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH4左右，乙酸乙酯萃取(60mL×3)三次，有機相合并，濃縮得到淺黃色油狀物，石油醚打漿得黃色固體粉末，收率74％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.142(s,3H,C(O)CH₃),δ3.462(s,3H,OCH₃),δ3.477(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.889(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.543(m,1H,CH),δ6.217(d,1H,J＝5.7Hz,NH).

實施例4

(R)-2-乙酰胺基--N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(拉科酰胺)的制備將按照實施例3的方法制備的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(48.3g，0.3mol)溶于二氯甲烷溶液中，降溫至-10℃，加入氯甲酸異丁酯(37g，0.3mol)，-5℃以下滴加氮甲基嗎啡啉(30g，0.3mol)，放熱，滴畢，-5℃下攪拌反應(yīng)半個小時，然后在-5℃以下滴加芐胺(25g，0.3mol溶于25g二氯甲烷)溶液，滴畢，自然升溫到室溫反應(yīng)5小時，反應(yīng)結(jié)束，依次用120mL水，120mL 4％鹽酸，120mL 8％NaHCO₃溶液和120ml水洗，有機相濃縮，用375mL乙酸乙酯/正己烷(1:3)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品61g，收率81％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.042(s,3H,C(O)CH₃),δ3.372(s,3H,OCH₃),δ3.441(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.816(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.478(d,2H,J＝5.7Hz,PhCH₂),δ4.517(m,1H,CH),δ6.462(d,1H,J＝5.7Hz,NH),δ6.776(br,1H,NH),δ7.264(m,5H,PhH).

拉科酰胺的制備路線二

實施例5

(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸(化合物Ⅳ)的制備

將按前述方法獲得的表達(dá)D-海因酶的濕菌體2g和表達(dá)海因消旋酶的濕菌體2g重懸于20mL 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，超聲破碎后得到粗酶液。

將按照實施例1的方法制備的5g底物5-甲氧甲基海因加入到80mL0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，隨后將所制的粗酶液溶解0.05g硫酸錳后，加入底物的緩沖液中。在40℃下磁力攪拌反應(yīng)25小時，并用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，使其維持在7.5左右。利用薄層層析法檢測底物完全消耗(薄層層析法參照實施例2)，用4M鹽酸調(diào)ph至2.5析出固體，得到(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸。

將(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸(14g，0.086mol)懸浮于250mL水中，加熱到10℃，加入34.7g濃鹽酸，滴加亞硝酸鈉水溶液(31.3g，含有6.26g亞硝酸鈉)，滴畢，10℃攪拌8小時，反應(yīng)完畢，得到含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應(yīng)液。

將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶反應(yīng)液濃縮結(jié)晶得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，收率77％，¹H NMR(D₂O):δ3.182(s,3H,OCH₃),δ3.427(m,1H,CH),δ3.493(m,2H,CH₂O)。手性ee值99.72％。

檢測手性ee值的高效液相色譜譜圖如圖3所示(手性ee值的檢測方法同實施例2)，根據(jù)圖3中(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸和其異構(gòu)體的峰面積之比可以確定手性ee值99.72％。

實施例6

(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(化合物V)的制備

將按照實施例5的方法制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應(yīng)液用30％NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH10.5，滴加醋酐(17.6g，0.172mol)，加熱到40度反應(yīng)5小時，TLC(正丁醇/醋酸/水＝4:1:1，茚三酮顯色)顯示原料消耗完畢，弄4M的鹽酸調(diào)pH1～2，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次60mL，合并有機相，濃縮至干，石油醚打漿得到10.5g白色固體，收率76％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.142(s,3H,C(O)CH₃),δ3.462(s,3H,OCH₃),δ3.477(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.889(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.543(m,1H,CH),δ6.217(d,1H,J＝5.7Hz,NH)。

實施例7

拉科酰胺的制備

將按照實施例6的方法制備的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸按照實施例4的方法制得拉科酰胺。

拉科酰胺的制備路線三

實施例8

N-Boc-O-甲基-D-絲氨酸(化合物Ⅵ)的制備

將按照實施例2的方法制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液(約含35.7g化合物Ⅳ，0.3mol)用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH10～11，20℃滴加Boc酸酐(二碳酸二叔丁酯)(78.5g，0.36mol)，室溫反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后，用100mL甲基叔丁基醚萃取過量的Boc酸酐，水相用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH5左右，二氯甲烷萃取(100mL×3)三次，有機相合并，無水硫酸鈉干燥，濃縮至干，石油醚打漿，過濾得白色固體粉末56.5g，收率86％。¹H NMR(CDCl₃):δ1.472(s,9H,(CH₃)₃O),δ3.393(s,3H,OCH₃),δ3.653(m,1H,NH),δ3.885(m,1H,CHH’O),δ4.294,4.461(t,J＝1.5Hz,1H,CH),δ452,5.927(m,1H,CHH’O),δ9.282(br,1H,COOH)。

實施例9

(R)-2-Boc胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(化合物Ⅶ)的制備

將按照實施例8的方法制備的N-Boc-O-甲基-D-絲氨酸(50g，0.23mol)溶于二氯甲烷溶液中，降溫至-10℃，加入氯甲酸異丁酯(28.4g，0.23mol)，-5℃以下滴加氮甲基嗎啡啉(23g，0.23mol)，放熱，滴畢，-5℃下攪拌反應(yīng)半個小時，然后在-5℃以下滴加芐胺(19.2g，0.23mol溶于20g二氯甲烷)溶液，滴畢，自然升溫到室溫反應(yīng)5小時，反應(yīng)結(jié)束，依次用90mL水，90mL 4％鹽酸，90mL8％NaHCO₃溶液和90ml水洗，有機相濃縮的黃色油狀物，用350mL乙酸乙酯/正己烷(1:5)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品45.5g，收率64％。¹H NMR(CDCl₃):δ1.424(s,9H,(CH₃)₃O),δ3.344(s,3H,OCH₃),δ3.505(dd,J＝6,9.2Hz,1H,CHH’O),δ3.806(dd,J＝4,9.2Hz,1H,CHH’O),δ4.290(m,1H,CH),δ4.464(m,2H,CH₂Ph),δ5.504(br,1H,BocNH),δ6.892(br,1H,BnNH),δ7.289(m,5H,PhH)。

實施例10

(R)-2-胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(化合物Ⅷ)的制備

將按照實施例9的方法制備的(R)-2-Boc胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(40g，0.13mol)溶于125mL二氯甲烷，反應(yīng)液中加入75mL濃鹽酸，室溫攪拌反應(yīng)2.5小時，反應(yīng)完畢，有機相用35ml×2水洗，水相合并，用甲叔醚50mL提取雜質(zhì)，水層用30％NaOH調(diào)pH到10～12，二氯甲烷(50mL×2)提取，有機相合并，用30mL飽和食鹽水洗一次，有機相濃縮得淺黃色油狀物25g，收率92％，放置會固化。¹H NMR(CDCl₃):δ3.232(s,3H,OCH₃),δ3.431(m,1H,CH),δ3.498(m,2H,CH₂O),δ4.325(m,2H,CH₂Ph),δ7.199(m,5H,PhH),δ7.841(br,1H,NH)。

實施例11

拉科酰胺的制備

將按照實施例10的方法制備的(R)-2-胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(21g，0.1mol)溶于100mL二氯甲烷溶液，加入三乙胺(14g，0.14mol)，在0～5℃滴加乙酸酐(12.2g，0.12mol)，滴畢，室溫25℃反應(yīng)3個小時，反應(yīng)完畢，用40mL水洗，二氯甲烷濃縮干，加200mL乙酸乙酯/正己烷1:1溶劑70℃溶解，然后緩慢降溫至室溫，大量固體析出，過濾，少量乙酸乙酯/正己烷1:1溶劑淋洗，干燥的拉科酰胺21.3g，收率85％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.042(s,3H,C(O)CH₃),δ3.372(s,3H,OCH₃),δ3.441(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.816(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.478(d,2H,J＝5.7Hz,PhCH₂),δ4.517(m,1H,CH),δ6.462(d,1H,J＝5.7Hz,NH),δ6.776(br,1H,NH),δ7.264(m,5H,PhH).

以上對本發(fā)明所提供的拉科酰胺的制備方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹。本文中應(yīng)用了具體實施例對本發(fā)明的原理及實施方式進(jìn)行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)。