本發(fā)明涉及利用重組微生物制備肉桂醛的方法。

背景技術：

肉桂醛是呈現(xiàn)桂皮的香氣和味道的主要成分，占桂皮精油的90％。該肉桂醛主要通過在桂皮油或肉桂油中添加濃的亞硫酸氫鈉溶液，然后對所生成的添加物進行分離并用乙醇洗滌，在稀硫酸或碳酸鈉水溶液中進行分解，并經(jīng)過水蒸氣蒸餾后進行真空蒸餾來制備?；蛘撸撊夤鹑┩ㄟ^攪拌苯甲醛、水、氫氧化鈉的混合物，同時滴加乙醛并使其進行反應，用苯萃取并進行減壓分餾來制備。

肉桂醛用作多種用途。例如，韓國專利公開第2003-0033282號記載了肉桂醛的抗氧化活性，韓國授權專利第10-0683113號記載了肉桂醛的肥胖治療效果。韓國專利公開第2013-0038000號記載了從桂皮分離的反式肉桂醛的B型肝炎治療效果。

需要研究用于有效地制備已知具有上述各種有用效果的肉桂醛的方法。韓國授權專利第10-0624236號記載了在碳酸鉀和水的存在下在乙腈溶劑中對苯甲醛衍生物和乙酸乙烯酯進行加熱并回流以制備肉桂醛衍生物的方法。

技術實現(xiàn)要素：

技術問題

在上述背景下，本發(fā)明人不懈努力研究以開發(fā)用于有效地制備肉桂醛的方法，其結果確認到能夠利用源自海洋鏈霉菌(Streptomyces maritimus)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，pal)基因、源自天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4cl)基因和源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl Co-A reductase，ccr)基因，以高產(chǎn)率制備肉桂醛，從而完成了本發(fā)明。

技術方案

本發(fā)明的主要目的在于提供用于制備肉桂醛的表達盒，其包含源自海洋鏈霉菌的pal基因、源自天藍色鏈霉菌的4cl基因和源自擬南芥的ccr基因。

本發(fā)明的另一目的在于提供包含所述表達盒的用于制備肉桂醛的載體。

本發(fā)明的又一目的在于提供包含所述載體的用于制備肉桂醛的轉(zhuǎn)化子。

本發(fā)明的又一目的在于提供制備肉桂醛的方法，其包括培養(yǎng)所述菌株的步驟。

有益效果

當利用根據(jù)本發(fā)明的用于制備肉桂醛的表達盒、包含所述表達盒的載體、包含所述載體的轉(zhuǎn)化子、以及利用該轉(zhuǎn)化子制備肉桂醛的方法時，能夠以優(yōu)異的效率制備肉桂醛。

附圖說明

圖1示出根據(jù)本發(fā)明的一實施例的肉桂醛制備系統(tǒng)的示意圖。

圖2示出為了表達本發(fā)明的一實施例中所使用的PAL、4CL、CCL而構建的質(zhì)粒。

圖3是利用SDS-PAGE對純化的PAL、4CL、CCR蛋白質(zhì)進行量化而示出的圖。

圖4是對最終制備的肉桂酸(cinnamate，CA)的濃度進行量化而示出的圖，圖5是對肉桂醛(cinnamaldehyde，CAD)的濃度進行量化而示出的圖。

圖6示出在復合培養(yǎng)基1中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。

圖7示出在復合培養(yǎng)基2中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。

圖8示出在限制培養(yǎng)基1中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。

圖9示出在限制培養(yǎng)基2中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。

具體實施方式

作為用于實現(xiàn)上述目的的一個實施方式，本發(fā)明提供包含肉桂醛生物合成基因的用于制備肉桂醛的表達盒、包含所述表達盒的載體、包含所述載體的轉(zhuǎn)化子、或利用該轉(zhuǎn)化子制備肉桂醛的方法。

本發(fā)明人制備導入有作為肉桂醛生物合成基因的pal基因、4cl基因和ccr基因的微生物，其結果確認到，能夠從所述微生物以1.98mg/L的產(chǎn)率制備肉桂醛(圖6至圖9)。

此外，確認到，源自海洋鏈霉菌的PAL、源自天藍色鏈霉菌的4CL和源自擬南芥的CCR的組合相比源自其他微生物的基因示出優(yōu)異的活性(圖4和圖5)。

以下，將具體說明本發(fā)明中的用于制備肉桂醛的表達盒。

在本說明書中，“肉桂醛生物合成基因”指的是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，pal)基因、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4cl)基因和肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl Co-A reductase，ccr)基因。

所述pal基因可以源自海洋鏈霉菌(Streptomyces maritimus)。在本發(fā)明的一實施例中，確認到，源自海洋鏈霉菌的PAL酶相比擬南芥PAL酶活性優(yōu)異(圖4)。

作為一非限制性示例，所述pal基因可以包含由序列號1或序列號19表示的堿基序列。所述pal基因可以由與由序列號1或序列號19所表示的堿基序列的序列同源性為至少70％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更進一步優(yōu)選95％以上的序列表示。應當明白，所述pal基因也可以包含上述序列通過其中的一個以上的堿基的取代、缺失、插入或其組合所變異而成的序列。

作為一非限制性示例，所述pal基因可以對具有由序列號2表示的氨基酸序列的PAL蛋白質(zhì)進行編碼。只要所述PAL蛋白質(zhì)具有苯丙氨酸解氨酶的活性，所述PAL蛋白質(zhì)可以包括在序列號2的氨基酸序列的N末端或C末端附接各種氨基酸序列而成的所有肽。而且，所述PAL蛋白質(zhì)可以指將為了提高靶向序列、標簽(tag)、標記的殘基、半衰期、或肽的穩(wěn)定性的特定目的而研發(fā)的氨基酸序列附加地包含在由序列號2表示的肽的N末端或C末端而形成的肽。此外，所述PAL蛋白質(zhì)可以指所述序列號2的氨基酸序列通過其中的一部分氨基酸的添加、取代、缺失等方法而發(fā)生變異的變異蛋白質(zhì)。

所述4cl基因可以源自天藍色鏈霉菌。

作為一非限制性示例，所述4cl基因可以包含由序列號3表示的堿基序列。所述4cl基因可以由與由序列號3所表示的堿基序列的序列同源性為至少70％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更進一步優(yōu)選95％以上的序列表示。應當明白，所述4cl基因也可以包含上述序列通過其中的一個以上的堿基的取代、缺失、插入或其組合所變異而成的序列。

作為一非限制性示例，所述4cl基因可以對具有由序列號4表示的氨基酸序列的4CL蛋白質(zhì)進行編碼。只要所述4CL蛋白質(zhì)具有4-香豆酸輔酶A連接酶的活性，所述4CL蛋白質(zhì)可以包括在序列號4的氨基酸序列的N末端或C末端附接各種氨基酸序列而成的所有肽。而且，所述4CL蛋白質(zhì)可以指將為了提高靶向序列、標簽(tag)、標記的殘基、半衰期、或肽的穩(wěn)定性的特定目的而研發(fā)的氨基酸序列附加地包含在由序列號4表示的肽的N末端或C末端而形成的肽。此外，所述4CL蛋白質(zhì)可以指所述序列號4的氨基酸序列通過其中的一部分氨基酸的添加、取代、缺失等方法而發(fā)生變異的變異蛋白質(zhì)。

所述ccr基因可以源自擬南芥。

作為一非限制性示例，所述ccr基因可以包含由序列號5表示的堿基序列。所述ccr基因可以由與由序列號5所表示的堿基序列的序列同源性為至少70％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更進一步優(yōu)選95％以上的序列表示。應當明白，所述ccr基因也可以包含上述序列通過其中的一個以上的堿基的取代、缺失、插入或其組合所變異而成的序列。

作為一非限制性示例，所述ccr基因可以對具有由序列號6表示的氨基酸序列的CCR蛋白質(zhì)進行編碼。只要所述CCR蛋白質(zhì)具有肉桂酰輔酶A還原酶的活性，所述CCR蛋白質(zhì)可以包括在序列號6的氨基酸序列的N末端或C末端附接各種氨基酸序列而成的所有肽。而且，所述CCR蛋白質(zhì)可以指將為了提高靶向序列、標簽(tag)、標記的殘基、半衰期、或肽的穩(wěn)定性的特定目的而研發(fā)的氨基酸序列附加地包含在由序列號6表示的肽的N末端或C末端而形成的肽。此外，所述CCR蛋白質(zhì)可以指所述序列號6的氨基酸序列通過其中的一部分氨基酸的添加、取代、缺失等方法而發(fā)生變異的變異蛋白質(zhì)。

所述多核苷酸可以通過其中的一個以上堿基的取代、缺失、插入或其組合而發(fā)生變異。在以化學方式合成并制備核苷酸時，可以使用本領域中公知的合成方法，例如在文獻(Engels and Uhlmann,Angew Chem IntEd Engl.,37:73-127,1988)中記載的方法，也可以通過三酯、亞磷酸酯、亞磷酰胺和H-磷酸酯方法、聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)及其他自動引物(auto primer)法、固體載體上的寡核苷酸合成方法等來進行制備。

在本發(fā)明的一實施例中，確認到，在使用源自天藍色鏈霉菌的4CL和源自擬南芥的CCR的組合時，相比源自擬南芥的4CL和源自擬南芥的CCR的組合，酶活性優(yōu)異(圖5)。

在本說明書中，所使用的與序列相關的術語“同源性”指的是與所給定的氨基酸序列或堿基序列一致的程度，且可以以百分比表示。在本說明書中，具有與所給定的氨基酸序列或堿基序列相同或類似的活性的其同源性序列以“％同源性”表示。例如，可以通過利用計算分數(shù)(score)、同一性(identity)、相似性(similarity)等參數(shù)的標準軟件(具體地BLAST 2.0)，或通過在所定義的嚴格條件下所進行的雜交實驗比較序列來確認，所定義的合適的雜交條件可以通過相應的技術范圍內(nèi)(Sambrook等,1989,Infra)的本領域的技術人員公知的方法來確定。

所述基因可以是經(jīng)過針對轉(zhuǎn)化子的密碼子優(yōu)化的。所述密碼子優(yōu)化指的是為了使宿主中的所述基因更有效地表達而將基因的密碼子置換為在所述宿主基因中使用頻率高的密碼子。用于優(yōu)化的方法可以使用本領域中的為了提高轉(zhuǎn)化子中的蛋白質(zhì)的表達而使用的方法，而沒有限制。

在本說明書中，“表達盒”指的是包含肉桂醛生物合成基因以能夠使肉桂醛表達的單位盒。此外，在本發(fā)明中，表達盒可以與表達結構體混用。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)本發(fā)明的表達盒可以導入菌株以制備肉桂醛。

作為另一實施方式，本發(fā)明提供包含所述表達盒的用于制備肉桂醛的載體。

在本說明書中，“載體”或“表達載體”指的是含有為了使靶蛋白能夠在合適的宿主內(nèi)表達而對可操作地連接到合適的調(diào)節(jié)序列上的所述靶蛋白進行編碼的多核苷酸的堿基序列的DNA制品。所述調(diào)節(jié)序列包含能夠啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子、用于調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄的任意的操縱基因序列、對合適的mRNA核糖體結合位點進行編碼的序列、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和讀取的終止的序列。載體轉(zhuǎn)化至適當?shù)乃拗骷毎麅?nèi)，然后可以進行復制或發(fā)揮功能而與宿主基因組無關，且可以并入基因組自身中。

所述載體可以可操作地連接至并包含所述肉桂醛生物合成基因。在本發(fā)明中，“可操作地連接(operably linked)”指的是為了執(zhí)行一般的功能將核酸表達調(diào)節(jié)序列和對靶蛋白或RNA進行編碼的核酸序列功能性地連接。例如，將啟動子和對蛋白質(zhì)或RNA進行編碼的核酸序列可操作地連接，以影響編碼序列的表達。與重組載體可操作地連接可以利用本領域中熟知的基因重組技術來進行。定點DNA切割和連接可以使用本領域中公知的酶等。

本發(fā)明中使用的表達載體為在宿主細胞內(nèi)可復制的載體而沒有特別限制，可以使用本領域公知的任一載體。常用的載體的示例可以為天然狀態(tài)或重組狀態(tài)的質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。例如，噬菌體載體或粘粒載體可以使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A等，質(zhì)粒載體可以使用pET系列、pTrc系列、pBR系列、pUC系列、pBluescriptII系列、pGEM系列、pTZ系列、pCL系列、pMAL系列或pHT系列載體等。本發(fā)明中能夠使用的載體可以使用公知的表達載體而沒有特別的限制。具體地，可以使用pET22b、pTrc99a、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pMAL-p2x或pHT43載體等。

本發(fā)明的載體可以引起同源重組以插入染色體內(nèi)，因此還可以包括用于確認是否插入所述染色體內(nèi)的選擇標記(selection marker)。

除了啟動子、操縱基因、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號、增強子等表達調(diào)節(jié)元素，合適的表達載體還包括用于膜靶向或分泌的信號序列或前導序列，且可以根據(jù)目的而以各種方式制備。起始密碼子和終止密碼子被認為是通常對靶蛋白進行編碼的核苷酸序列的一部分，在給藥基因構建體時需要必須在個體中發(fā)揮作用，且可以包含在編碼序列或框內(nèi)(in frame)。載體的啟動子可以是組成型或誘導性。此外，表達載體包含用于選擇含有載體的宿主細胞的選擇標記，在表達載體是可復制的表達載體時，可包括復制起點。載體可自我復制或并入宿主DNA中。

此外，為了容易地檢測肉桂醛，所述表達載體還可以包括能夠通過使用任意的肽鏈內(nèi)切酶而去除的蛋白標簽。所述標簽指的是示出可量化的活性或特性的分子，可以為包含諸如熒光素的化學熒光物質(zhì)(fluoracer)、諸如熒光蛋白(GFP)或相關蛋白的多肽熒光物質(zhì)的熒光分子；也可以為諸如Myc標簽、Flag標簽、組氨酸標簽、亮氨酸標簽、IgG標簽、鏈酶親和素標簽的表位標簽。尤其是，在使用表位標簽時，優(yōu)選使用由6個以上氨基酸殘基構成的肽標簽、更優(yōu)選使用由8個至50個氨基酸殘基構成的肽標簽。

制備載體的方法可以使用本領域中常用的任一方法，而沒有特別限制。

作為另一實施方式，本發(fā)明提供一種包含所述載體的用于制備肉桂醛的轉(zhuǎn)化子。

在本發(fā)明中，“制備”不僅指在菌株內(nèi)制備肉桂醛，而且其概念還包括將肉桂醛排除細胞外(例如，排出至培養(yǎng)液中)。

在本說明書中，“轉(zhuǎn)化”可以指將包含對靶蛋白進行編碼的多核苷酸的載體導入宿主細胞內(nèi)，以使所述多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)能夠在宿主細胞內(nèi)表達。

所述轉(zhuǎn)化方法可以使用本領域中公知的方法而沒有限制，只要能夠制備肉桂醛則對該轉(zhuǎn)化方法沒有特別限制，但可以使用CaCl2沉淀法、在CaCl2沉淀法中使用稱為二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide)的還原物質(zhì)以提高效率的Hanahan方法、電穿孔法(electroporation)、磷酸鈣沉淀法、原生質(zhì)體融合法、用碳化硅纖維的攪拌法、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、使用聚乙二醇(PEG)的轉(zhuǎn)化法、硫酸葡聚糖、脂質(zhì)體和干燥/抑制介導轉(zhuǎn)化法等。

轉(zhuǎn)化成的多核苷酸只要能在宿主細胞內(nèi)表達，則可以插入并位于宿主細胞的染色體內(nèi)或位于染色體外。此外，所述多核苷酸包括對靶蛋白進行編碼的DNA和RNA。所述多核苷酸只要可以導入宿主細胞內(nèi)并表達，則與以何種形式導入無關。例如，所述多核苷酸可以以作為包含自己表達所需的所有要素的基因結構體的表達盒的形式導入宿主細胞內(nèi)。

可以用作所述轉(zhuǎn)化子的微生物可以為屬于埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、志賀氏菌屬(Shigella sp.)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp.)、沙門氏菌屬(Salmonella sp.)、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、耶爾森菌屬(Yersinia sp.)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)、短桿菌屬(Brevibacterium sp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp.)、月形單胞菌屬(Selenomanas sp.)、弧菌屬(Vibrio sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)、隱秘桿菌屬(Arcanobacterium sp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp)的微生物，但不限于此。具體地，可以用作所述轉(zhuǎn)化子的微生物可以為埃希氏菌屬微生物。

作為另一實施方式，本發(fā)明提供一種制備肉桂醛的方法，其包括培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子的步驟。

在本發(fā)明的一具體實施方式中，培養(yǎng)具有所述肉桂醛制備能力的轉(zhuǎn)化子，然后測量包含在所述培養(yǎng)物中的肉桂醛的產(chǎn)量，其結果確認到，可以以1.98mg/L的產(chǎn)量從所述微生物制備肉桂醛(圖6至圖8)。

本發(fā)明的術語“培養(yǎng)”指的是在適當?shù)厝斯ふ{(diào)節(jié)的環(huán)境條件下使微生物生長的方法。在本發(fā)明中，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子的方法可以使用本領域中公知的方法。具體地，只要能使本發(fā)明的肉桂醛表達以制備該肉桂醛，對所述培養(yǎng)沒有特別限制，然而，可以通過公知的分批培養(yǎng)方法、連續(xù)培養(yǎng)方法、補料分批培養(yǎng)方法等來執(zhí)行。

對培養(yǎng)條件沒有特別限制，但可以利用堿性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)調(diào)節(jié)合適的pH(例如pH5至9、優(yōu)選pH6至8、更優(yōu)選Ph6.8)，將氧氣或含氧氣的氣體混合物導入培養(yǎng)物中以維持有氧條件，培養(yǎng)溫度維持在20°至45°、優(yōu)選25°至40°，優(yōu)選培養(yǎng)約10小時至160小時。

針對用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基，在含有適當?shù)奶荚础⒌?、氨基酸、維生素等的通常的培養(yǎng)基內(nèi)調(diào)節(jié)溫度、pH等同時以適當?shù)姆绞綕M足特定菌株的要求。

可以使用的碳源可以單獨使用或混合使用糖和碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素)、油脂和脂肪(如豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸)、醇(例如，甘油、乙醇等)和有機酸(例如乙酸)等。

氮源可以單獨使用或混合使用含氮的有機化合物(例如：蛋白胨、酵母提取液、肉汁、麥芽提取液、玉米漿、大豆份和尿素)、或者無機化合物(例如：硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨)等。

磷源可以單獨使用或組合使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、相應的鈉鹽等；可以包括其他金屬鹽(例如硫酸鎂或硫酸鐵)、諸如氨基酸和維生素的必須促生長物質(zhì)。

此外，在培養(yǎng)基中可以使用合適的前驅(qū)體。在培養(yǎng)過程中可以以合適方式(分批式、補料分批式、連續(xù)式)向培養(yǎng)物中添加上述原料，但對其沒有特別限制。可以以合適的方式使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等堿性化合物或者磷酸或硫酸等酸性化合物，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。

在本說明書中，所述培養(yǎng)基可以以與培養(yǎng)液相同的含義使用。

作為一示例，所述制備方法還可以包括如下步驟：從所培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子或其培養(yǎng)物中回收肉桂醛。

在本說明書中，“培養(yǎng)物”是培養(yǎng)微生物而獲得的物質(zhì)，可以包含所述培養(yǎng)基、所培養(yǎng)的微生物、和從所培養(yǎng)的微生物所分泌的物質(zhì)。例如，可以包含培養(yǎng)菌體所需的營養(yǎng)源，例如，除了碳源、氮源等以外，還有無機鹽成分、氨基酸、維生素、核酸和/或其他通常在培養(yǎng)基(或培養(yǎng)液)中含有的成分。此外，例如，還可以包含用于制備和分泌菌體的酶。

通過培養(yǎng)而制備的肉桂醛在培養(yǎng)中分泌或殘留在細胞內(nèi)，因此所述培養(yǎng)物可以包含通過微生物培養(yǎng)而制備的肉桂醛。

針對用于回收在本發(fā)明的所述培養(yǎng)步驟中制備的肉桂醛的方法，可以根據(jù)培養(yǎng)方法(例如分批培養(yǎng)方法、連續(xù)培養(yǎng)方法、補料分批培養(yǎng)方法)等利用本領域中公知的合適方法，以從培養(yǎng)液收集肉桂醛。具體地，所述回收方法可以使用例如離心分離、過濾、萃取、噴霧、干燥、蒸發(fā)、沉淀、結晶、電泳、分級溶解(例如，硫酸銨沉淀)、層析(例如離子交換、親和、疏水和大小排阻)等方法。

作為一示例，所述制備方法還可以包括純化所回收的肉桂醛的步驟。所述純化步驟可以通過現(xiàn)有的層析法來執(zhí)行，所述層析法包括免疫親和層析、受體親和層析、疏水作用層析、凝集素親和層析、大小排阻層析、陽離子或陰離子交換層析、高效液相色譜(HPLC)、反相HPLC。此外，所需的蛋白為具有特性性標簽、標記或螯合部分的融合蛋白，因此存在通過特異性結合伙伴或制劑來識別并純化的方法。將純化的蛋白質(zhì)切割為所需的蛋白質(zhì)部分，或保留其自身。通過融合蛋白的切斷可以在切斷過程中制備具有附加的氨基酸的所需的蛋白質(zhì)形式。

作為一示例，所述轉(zhuǎn)化子可以在含有苯丙氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。包含在所述轉(zhuǎn)化子中的pal基因可以將苯丙氨酸用作基質(zhì)，因此在含有苯丙氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，可以以優(yōu)異的效率制備肉桂醛。

作為一示例，所述轉(zhuǎn)化子可以在含有酪蛋白氨基酸(casamino acid)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在本發(fā)明的一實施例中，將包含肉桂醛生物合成基因的轉(zhuǎn)化子在包含酪蛋白氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的結果示出最高產(chǎn)量為1.98mg/L，相反，在不包含酪蛋白氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的結果示出最高產(chǎn)量為1.23mg/L。

實施例

以下，通過下列實施例詳細說明本發(fā)明。然而，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不受限于下列實施例。

實施例1.用于重組基因表達的菌株和質(zhì)粒制備

首先，利用下表1中記載的序列的BHB 22-F和BHB 22-R、BHB 20-F和BHB 20-R、BHB 19-F和BHB 19-R通過聚合酶鏈反應從擬南芥cDNA獲得pal(序列號17)基因、4cl(序列號18)基因、ccr(序列號5)基因。

此外，利用下表1中記載的序列的BHB 31-F和BHB 31-R，通過聚合酶鏈反應，從進行密碼子優(yōu)化而合成的海洋鏈霉菌pal基因獲得pal基因(序列號19)。此外，利用下表1中記載的序列的BHB 21-F和BHB 21-R，通過聚合酶鏈反應，從天藍色鏈霉基因組DNA獲得4cl基因(序列號3)。

[表1]

利用限制酶XbaI和HindIII切割各個聚合酶鏈反應產(chǎn)物，且連接(ligation)在下表2和圖2所示的各載體上。

[表2]

在連接完成后的pHB-I01、pHB-I02、pHB-I03、pHB-I04或pHB-I05載體經(jīng)由大腸桿菌菌株MG1655最終轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)。pHB-P01載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株NST74。

實施例2.PAL,4CL,CCR蛋白質(zhì)的分離和純化

在包含2％的葡萄糖和100μg/mL氨芐青霉素的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中接種大腸桿菌菌株BL21(DE3)和NST74菌株。將其在37℃、200rpm的條件下培養(yǎng)12小時，然后以1/100體積傳送到新的LB培養(yǎng)基。然后，在相同的條件下培養(yǎng)，直到OD600到達0.6。

此后，為了制備蛋白質(zhì)，將BL21(DE3)菌株在25℃、200rpm的條件下馴化30分鐘，然后添加1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，并附加地培養(yǎng)6小時。此外，NST74菌株在37℃、200rpm的條件下添加1mM IPTG后進行培養(yǎng)。

然后，在4℃、6000rpm的條件下將上述培養(yǎng)液離心分離10分鐘，并去除上清液。利用緩沖液(50mM磷酸鉀，300mM的氯化鈉，pH7.0)使其再懸浮(resuspension)，并且用超聲波細胞粉碎機進行粉碎以獲得細胞懸浮液。然后，在4℃、10000rpm的條件下將上述細胞懸浮液離心分離10分鐘，獲得水溶性的上清液部分。

然后，利用固相金屬親和色譜(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)從上述細胞懸浮液純化具有8X組氨酸標簽(Histidine tag)的PAL、4CL、CCR蛋白質(zhì)。

此外，以0.45μm過濾上述水溶性的上清液部分，然后加入用結合緩沖液(binding buffer:50mM磷酸鉀,300mM氯化鈉,pH 7.0)預處理后的金屬親和樹脂。然后，利用10mL的洗滌緩沖液(washing buffer:50mM磷酸鉀,300mM氯化鈉,15mM咪唑,pH 7.0)洗滌上述樹脂，然后利用1mM的洗脫緩沖液(elution buffer:50mM磷酸鉀，300mM氯化鈉,150mM咪唑,pH 7.0)最后純化蛋白質(zhì)。

實驗例1.PAL、4CL、CCR蛋白質(zhì)的量化

通過利用12％(w/v)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)的密度定量(densitometry)方法和利用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的總蛋白定量法對所純化的蛋白質(zhì)進行量化，并在圖3中示出。

在圖3中，泳道M表示蛋白質(zhì)大小，泳道1至3表示擬南芥PAL酶的整體部分、水溶性部分、純化后洗脫(elution)部分，泳道4至6表示擬南芥4CL酶的整體部分、水溶性部分、純化后洗脫(elution)部分,泳道7至9表示擬南芥CCR酶的整體部分、水溶性部分、純化后洗脫(elution)部分,泳道10至12表示海洋鏈霉菌PAL酶的整體部分、水溶性部分、純化后洗脫(elution)部分，以及泳道13至15表示天藍色鏈霉菌4CL酶的整體部分、水溶性部分、純化后洗脫(elution)部分。

針對各蛋白質(zhì)的大小，擬南芥PAL為78kDa(實線箭頭)，擬南芥4CL為61kDa(虛線箭頭)，擬南芥CCR為37kDa(實心三角形)，海洋鏈霉菌PAL為56kDa(空心箭頭)，天藍色鏈霉菌4CL為55kDa(空心箭頭)，從而確認到很好地制備了PAL、4CL、CCR蛋白質(zhì)。

實驗例2.酶的活性分析

通過細胞外反應分析在所述實施例2中純化的PAL、4CL、CCR蛋白質(zhì)的活性。

首先，為了分析PAL的活性，使100mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、0.2mM苯丙氨酸、純化的PAL酶200μg/mL反應。此外，為了分析4CL和CCR的活性，使400mM Tris-HCl、5mM三磷酸腺苷(ATP)、5mM氯化鎂、0.3mM輔酶A(Coenzyme A)、0.5mM反式肉桂酸(trans-cinnamate)、和各50μg/mL純化的4CL和CCR反應。

在30℃下使所述反應進行1小時后，通過反相高效液相色譜法(reverse-phase high-performance liquid chromatography,reverse-phase HPLC)分析由PAL酶制備的肉桂酸、以及由4CL和CCR制備的肉桂醛。具體地，在ZORBAX Eclipse AAA柱(150X 4.6mm；3.5μm；Agilent公司,美國加利福尼亞州)中,流動相A(mobile phase A)使用0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid)，流動相B(mobile phase B)使用乙腈(acetonitrile)。乙腈的比例在初始1分鐘內(nèi)為10％，此后9分鐘內(nèi)逐漸變更為70％。柱的溫度固定為40℃，流速固定為1mL/min。

使用標準溶液(standard solution；1,10,50,100,200mg/L肉桂酸和0.41,4.1,41,82,136.7mg/L肉桂醛)制作標準曲線(standard curve)，利用其對最終制備的肉桂酸(cinnamate,在圖4中表示為CA)和肉桂醛(cinnamaldehyde，在圖5中表示為CAD)進行量化。

其結果示出，如圖4所示，源自海洋鏈霉菌的PAL的活性比源自擬南芥的PAL的活性優(yōu)異。此外，如圖5所示，源自海洋鏈霉菌的4CL與源自擬南芥的CCR的組合的酶活性比源自擬南芥的4CL和源自擬南芥的CCR的組合的酶活性優(yōu)異。

實驗例3.高細胞濃度培養(yǎng)(High-cell density cultivation)

首先，在37℃、200rpm的條件下將馴化的包含pHB-P01的大腸桿菌菌株NST74以200mL的量在R/2半組合培養(yǎng)基(6.75g/L磷酸二氫鉀、2g/L磷酸氫二銨、0.85g/L檸檬酸、0.7g/L七水硫酸鎂、5mL/L微量金屬溶液(TMS；10g/L七水硫酸鐵、2.2g/L七水硫酸鋅、2g/L二水氯化鈣、1g/L五水硫酸銅、0.58g/L五水硫酸錳、0.1g/L四水七鉬酸銨、0.02g/L十水四硼酸鈉,pH 6.8))中培養(yǎng)12小時。

然后，在相同的培養(yǎng)基中接種1.8L大腸桿菌菌株NST74，從而以總2L的量在5L大小的生物反應器中進行高濃度培養(yǎng)。在PH小于6.77時，供給50％(v/v)的氨，且在PH大于6.86時，供給補料培養(yǎng)基(feeding solution)。補料培養(yǎng)基使用復合培養(yǎng)基1(complex feeding solution 1；500g/L葡萄糖、75g/L酵母提取物、20g/L七水硫酸鎂)、復合培養(yǎng)基2(complex feeding solution 2；500g/L葡萄糖、100g/L酪蛋白氨基酸(casamino acid)、20g/L七水硫酸鎂)、限制培養(yǎng)基1(defined feeding solution；700g/L葡萄糖、20g/L七水硫酸鎂)、或者限制培養(yǎng)基2(defined feeding solution；500g/L葡萄糖、20g/L七水硫酸鎂、0.81g/L苯丙氨酸)。

在將溫度保持在37℃且將溶解氧(DO)的攪拌速度升高至1000rpm后，供給氧氣并保持40％。如果光密度(optical density,OD₆₀₀)達到60，則為了制備蛋白質(zhì)(酶)，供給1mM的IPTG。在滅菌后手動供給泡沫抑制劑。

分時間段地以光密度達到4的方式分別收集所培養(yǎng)的大腸桿菌，以用于蛋白質(zhì)分析。以0.22μm過濾培養(yǎng)液的上清液，通過反相高效液相色譜法分析對肉桂醛量化。

圖6示出在使用復合培養(yǎng)基1作為所述補料培養(yǎng)基后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。最高產(chǎn)量示出為1.23mg/L。

圖7示出在使用復合培養(yǎng)基2作為所述補料培養(yǎng)基后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。最高產(chǎn)量示出為1.98mg/L。

圖8示出在使用限制培養(yǎng)基1作為所述補料培養(yǎng)基后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。最高產(chǎn)量示出為0.71mg/L。

圖9示出在使用限制培養(yǎng)基2作為所述補料培養(yǎng)基后分時間段測量的光密度(OD600；空心環(huán))和依據(jù)其的肉桂醛濃度(CAD濃度；實心環(huán))。最高產(chǎn)量示出為1.05mg/L。

根據(jù)上述說明，本領域技術人員能夠理解在不脫離本發(fā)明的技術思想或必要特征的情況下，可以以其他具體實施方式實施本發(fā)明。在這方面，應當理解上述實施方式在所有方面為示例性的而不是限制性的。本發(fā)明的范圍由所附權利要求書的含義和范圍而不是上述詳細說明來限定，并且從與所附權利要求書的等同概念所得出的所有變更或變型的實施方式應解釋為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

工業(yè)實用性

因此，本發(fā)明能夠提供用于制備肉桂醛的表達盒、包含所述表達盒的用于制備肉桂醛的載體、包含所述載體的用于制備肉桂醛的轉(zhuǎn)化子以及利用該轉(zhuǎn)化子制備肉桂醛的方法。

<110> 智能合成生物中心

韓國科學技術院

<120> 制備肉桂醛的方法

<130> OPA16080

<150> KR 10-2015-0067557

<151> 2015-05-14

<160> 19

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 1569

<212> DNA

<213> 海洋鏈霉菌

<400> 1

atgaccttcg tcatagagct cgacatgaac gtcacgctcg accaacttga ggacgcggcg 60

cgacagcgca cgcccgtgga gctgtccgca cccgtccgct cccgcgtccg cgcctcgcgc 120

gacgtgttgg tgaagttcgt gcaggacgaa cgtgtcatct acggggtcaa caccagcatg 180

gggggcttcg tcgaccacct cgtcccggtg tcccaggccc ggcagctcca ggagaacctg 240

atcaacgcgg tcgccaccaa cgtgggggcg tatctggacg acacgaccgc ccggaccatc 300

atgctgtccc gcatcgtgtc gctggcgcgc gggaactccg cgatcacccc ggcgaatctg 360

gacaagctgg tggccgtact caacgccggg atcgtgccgt gcatcccgga gaagggctct 420

ttgggcacca gcggtgacct cggcccgctg gccgcgatcg ccctggtgtg cgcggggcag 480

tggaaggccc gctacaacgg tcagatcatg cccgggcggc aggccctgtc cgaggccggc 540

gtcgagccga tggagctgag ctacaaggat ggcctggccc tgatcaacgg cacgtcaggc 600

atggtcggcc tgggcaccat ggtcctccag gccgcgcgcc ggctcgtgga ccgctacctg 660

caggtgtccg cgttgtcggt cgagggcctg gcaggcatga cgaaaccgtt cgaccctcgc 720

gtgcacggcg tcaagccgca ccgcgggcag cgtcaggtgg cctcgcggtt gtgggagggg 780

cttgccgact cgcacctggc ggtcaacgaa ctggacaccg agcagaccct ggccggagag 840

atgggcacgg tcgccaaggc cggttcgctg gcgatcgagg acgcctactc catccggtgc 900

acgccgcaga tcctcggtcc cgtggtcgat gtgctggacc ggatcggggc gaccctgcag 960

gacgagctga actcctccaa cgacaacccg atcgtcctgc cggaggaggc ggaggtgttc 1020

cacaacgggc acttccacgg ccagtacgtg gccatggcca tggaccacct gaacatggcc 1080

ctggccaccg tgaccaatct cgccaaccgg cgcgtggacc gcttcctgga caagagcaac 1140

agcaacgggc tgcccgcctt cctgtgccgg gaagatccgg gactgcgcct gggcctgatg 1200

ggcggccagt tcatgaccgc gtcgatcacc gcggagaccc gcaccctgac cattccgatg 1260

tcggtgcagt ccctcacgag tacggcggac ttccaggaca tcgtgtcctt cggattcgtc 1320

gccgcccgcc gcgcccggga ggtactcacc aacgctgcct acgtggtggc cttcgagctg 1380

ctgtgcgcct gccaggccgt cgacatccgc ggcgcggaca aactgtcctc cttcacccgc 1440

ccgctctatg agcgcacccg caagatcgtg ccgttcttcg accgggacga gaccatcacc 1500

gactacgtcg agaagctggc ggccgacctg atcgcgggcg agcccgtcga cgctgccgtg 1560

gcggcgcac 1569

<210> 2

<211> 523

<212> PRT

<213> 海洋鏈霉菌

<400> 2

Met Thr Phe Val Ile Glu Leu Asp Met Asn Val Thr Leu Asp Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asp Ala Ala Arg Gln Arg Thr Pro Val Glu Leu Ser Ala Pro Val

20 25 30

Arg Ser Arg Val Arg Ala Ser Arg Asp Val Leu Val Lys Phe Val Gln

35 40 45

Asp Glu Arg Val Ile Tyr Gly Val Asn Thr Ser Met Gly Gly Phe Val

50 55 60

Asp His Leu Val Pro Val Ser Gln Ala Arg Gln Leu Gln Glu Asn Leu

65 70 75 80

Ile Asn Ala Val Ala Thr Asn Val Gly Ala Tyr Leu Asp Asp Thr Thr

85 90 95

Ala Arg Thr Ile Met Leu Ser Arg Ile Val Ser Leu Ala Arg Gly Asn

100 105 110

Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asn Leu Asp Lys Leu Val Ala Val Leu Asn

115 120 125

Ala Gly Ile Val Pro Cys Ile Pro Glu Lys Gly Ser Leu Gly Thr Ser

130 135 140

Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ile Ala Leu Val Cys Ala Gly Gln

145 150 155 160

Trp Lys Ala Arg Tyr Asn Gly Gln Ile Met Pro Gly Arg Gln Ala Leu

165 170 175

Ser Glu Ala Gly Val Glu Pro Met Glu Leu Ser Tyr Lys Asp Gly Leu

180 185 190

Ala Leu Ile Asn Gly Thr Ser Gly Met Val Gly Leu Gly Thr Met Val

195 200 205

Leu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Val Asp Arg Tyr Leu Gln Val Ser Ala

210 215 220

Leu Ser Val Glu Gly Leu Ala Gly Met Thr Lys Pro Phe Asp Pro Arg

225 230 235 240

Val His Gly Val Lys Pro His Arg Gly Gln Arg Gln Val Ala Ser Arg

245 250 255

Leu Trp Glu Gly Leu Ala Asp Ser His Leu Ala Val Asn Glu Leu Asp

260 265 270

Thr Glu Gln Thr Leu Ala Gly Glu Met Gly Thr Val Ala Lys Ala Gly

275 280 285

Ser Leu Ala Ile Glu Asp Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Thr Pro Gln Ile

290 295 300

Leu Gly Pro Val Val Asp Val Leu Asp Arg Ile Gly Ala Thr Leu Gln

305 310 315 320

Asp Glu Leu Asn Ser Ser Asn Asp Asn Pro Ile Val Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Ala Glu Val Phe His Asn Gly His Phe His Gly Gln Tyr Val Ala Met

340 345 350

Ala Met Asp His Leu Asn Met Ala Leu Ala Thr Val Thr Asn Leu Ala

355 360 365

Asn Arg Arg Val Asp Arg Phe Leu Asp Lys Ser Asn Ser Asn Gly Leu

370 375 380

Pro Ala Phe Leu Cys Arg Glu Asp Pro Gly Leu Arg Leu Gly Leu Met

385 390 395 400

Gly Gly Gln Phe Met Thr Ala Ser Ile Thr Ala Glu Thr Arg Thr Leu

405 410 415

Thr Ile Pro Met Ser Val Gln Ser Leu Thr Ser Thr Ala Asp Phe Gln

420 425 430

Asp Ile Val Ser Phe Gly Phe Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Glu Val

435 440 445

Leu Thr Asn Ala Ala Tyr Val Val Ala Phe Glu Leu Leu Cys Ala Cys

450 455 460

Gln Ala Val Asp Ile Arg Gly Ala Asp Lys Leu Ser Ser Phe Thr Arg

465 470 475 480

Pro Leu Tyr Glu Arg Thr Arg Lys Ile Val Pro Phe Phe Asp Arg Asp

485 490 495

Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Glu Lys Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala

500 505 510

Gly Glu Pro Val Asp Ala Ala Val Ala Ala His

515 520

<210> 3

<211> 1566

<212> DNA

<213> 天藍色鏈霉菌

<400> 3

atgttccgca gcgagtacgc agacgtcccg cccgtcgacc tgcccatcca cgacgccgtg 60

ctcggcgggg ccgccgcctt cgggagcacc ccggcgctga tcgacggcac cgacggcacc 120

accctcacct acgagcaggt ggaccggttc caccggcgcg tcgccgccgc cctcgccgag 180

accggcgtgc gcaagggcga cgtcctcgcc ctgcacagcc ccaacaccgt cgccttcccc 240

ctggccttct acgccgccac ccgcgcgggc gcctccgtca ccacggtgca tccgctcgcg 300

acggcggagg agttcgccaa gcagctgaag gacagcgcgg cccgctggat cgtcaccgtc 360

tcaccgctcc tgtccaccgc ccgccgggcc gccgaactcg cgggcggcgt ccaggagatc 420

ctggtctgcg acagcgcgcc cggtcaccgc tccctcgtcg acatgctggc ctcgaccgcg 480

cccgaaccgt ccgtcgccat cgacccggcc gaggacgtcg ccgccctgcc gtactcctcg 540

ggcaccaccg gcacccccaa gggcgtcatg ctcacacacc ggcagatcgc caccaacctc 600

gcccagctcg aaccgtcgat gccgtccgcg cccggcgacc gcgtcctcgc cgtgctgccg 660

ttcttccaca tctacggcct gaccgccctg atgaacgccc cgctccggct cggcgccacc 720

gtcgtggtcc tgccccgctt cgacctggag cagttcctcg ccgccatcca gaaccaccgc 780

atcaccagcc tgtacgtcgc cccgccgatc gtcctggccc tcgccaaaca ccccctggtc 840

gccgactacg acctctcctc gctgaggtac atcgtcagcg ccgccgcccc gctcgacgcg 900

cgtctcgccg ccgcctgctc gcagcggctc ggcctgccgc ccgtcggcca ggcctacggc 960

atgaccgaac tgtccccggg cacccacgtc gtccccctgg acgcgatggc cgacgcgccg 1020

cccggcaccg tcggcaggct catcgcgggc accgagatgc gcatcgtctc cctcaccgac 1080

ccgggcacgg acctccccgc cggagagtcc ggggagatcc tcatccgcgg cccccagatc 1140

atgaagggct acctgggccg ccccgacgcc accgccgcca tgatcgacga ggagggctgg 1200

ctgcacaccg gggacgtcgg acacgtcgac gccgacggct ggctgttcgt cgtcgaccgc 1260

gtcaaggaac tgatcaagta caagggcttc caggtggccc ccgccgaact ggaggcccac 1320

ctgctcaccc accccggcgt cgccgacgcg gccgtcgtcg gcgcctacga cgacgacggc 1380

aacgaggtac cgcacgcctt cgtcgtccgc cagccggccg cacccggcct cgcggagagc 1440

gagatcatga tgtacgtcgc cgaacgcgtc gccccctaca aacgcgtccg ccgggtcacc 1500

ttcgtcgacg ccgtcccccg cgccgcctcc ggcaagatcc tccgccgaca gctcagggag 1560

ccgcga 1566

<210> 4

<211> 522

<212> PRT

<213> 天藍色鏈霉菌

<400> 4

Met Phe Arg Ser Glu Tyr Ala Asp Val Pro Pro Val Asp Leu Pro Ile

1 5 10 15

His Asp Ala Val Leu Gly Gly Ala Ala Ala Phe Gly Ser Thr Pro Ala

20 25 30

Leu Ile Asp Gly Thr Asp Gly Thr Thr Leu Thr Tyr Glu Gln Val Asp

35 40 45

Arg Phe His Arg Arg Val Ala Ala Ala Leu Ala Glu Thr Gly Val Arg

50 55 60

Lys Gly Asp Val Leu Ala Leu His Ser Pro Asn Thr Val Ala Phe Pro

65 70 75 80

Leu Ala Phe Tyr Ala Ala Thr Arg Ala Gly Ala Ser Val Thr Thr Val

85 90 95

His Pro Leu Ala Thr Ala Glu Glu Phe Ala Lys Gln Leu Lys Asp Ser

100 105 110

Ala Ala Arg Trp Ile Val Thr Val Ser Pro Leu Leu Ser Thr Ala Arg

115 120 125

Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gly Gly Val Gln Glu Ile Leu Val Cys Asp

130 135 140

Ser Ala Pro Gly His Arg Ser Leu Val Asp Met Leu Ala Ser Thr Ala

145 150 155 160

Pro Glu Pro Ser Val Ala Ile Asp Pro Ala Glu Asp Val Ala Ala Leu

165 170 175

Pro Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Thr Pro Lys Gly Val Met Leu Thr

180 185 190

His Arg Gln Ile Ala Thr Asn Leu Ala Gln Leu Glu Pro Ser Met Pro

195 200 205

Ser Ala Pro Gly Asp Arg Val Leu Ala Val Leu Pro Phe Phe His Ile

210 215 220

Tyr Gly Leu Thr Ala Leu Met Asn Ala Pro Leu Arg Leu Gly Ala Thr

225 230 235 240

Val Val Val Leu Pro Arg Phe Asp Leu Glu Gln Phe Leu Ala Ala Ile

245 250 255

Gln Asn His Arg Ile Thr Ser Leu Tyr Val Ala Pro Pro Ile Val Leu

260 265 270

Ala Leu Ala Lys His Pro Leu Val Ala Asp Tyr Asp Leu Ser Ser Leu

275 280 285

Arg Tyr Ile Val Ser Ala Ala Ala Pro Leu Asp Ala Arg Leu Ala Ala

290 295 300

Ala Cys Ser Gln Arg Leu Gly Leu Pro Pro Val Gly Gln Ala Tyr Gly

305 310 315 320

Met Thr Glu Leu Ser Pro Gly Thr His Val Val Pro Leu Asp Ala Met

325 330 335

Ala Asp Ala Pro Pro Gly Thr Val Gly Arg Leu Ile Ala Gly Thr Glu

340 345 350

Met Arg Ile Val Ser Leu Thr Asp Pro Gly Thr Asp Leu Pro Ala Gly

355 360 365

Glu Ser Gly Glu Ile Leu Ile Arg Gly Pro Gln Ile Met Lys Gly Tyr

370 375 380

Leu Gly Arg Pro Asp Ala Thr Ala Ala Met Ile Asp Glu Glu Gly Trp

385 390 395 400

Leu His Thr Gly Asp Val Gly His Val Asp Ala Asp Gly Trp Leu Phe

405 410 415

Val Val Asp Arg Val Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Phe Gln Val

420 425 430

Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ala His Leu Leu Thr His Pro Gly Val Ala

435 440 445

Asp Ala Ala Val Val Gly Ala Tyr Asp Asp Asp Gly Asn Glu Val Pro

450 455 460

His Ala Phe Val Val Arg Gln Pro Ala Ala Pro Gly Leu Ala Glu Ser

465 470 475 480

Glu Ile Met Met Tyr Val Ala Glu Arg Val Ala Pro Tyr Lys Arg Val

485 490 495

Arg Arg Val Thr Phe Val Asp Ala Val Pro Arg Ala Ala Ser Gly Lys

500 505 510

Ile Leu Arg Arg Gln Leu Arg Glu Pro Arg

515 520

<210> 5

<211> 1032

<212> DNA

<213> 擬南芥

<400> 5

atgccagtcg acgtagcctc accggccgga aaaaccgtct gcgtcaccgg agctggtgga 60

tacatcgctt cttggattgt taagatactt ctcgagagag gttacacagt caaaggaacc 120

gtacggaatc cagatgatcc gaagaacaca catttgagag aactagaagg aggaaaggag 180

agactgattc tgtgcaaagc agatcttcag gactacgagg ctcttaaggc ggcgattgat 240

ggttgcgacg gcgtctttca cacggcttct cctgtcaccg acgatccgga acaaatggtg 300

gagccggccg tgaatggagc caagtttgta attaatgctg cggctgaggc caaggtcaag 360

cgcgtggtca tcacctcctc cattggtgcc gtctacatgg acccgaaccg tgaccctgag 420

gctgtcgttg acgaaagttg ttggagtgat cttgacttct gcaaaaacac caagaattgg 480

tattgttacg gcaagatggt ggcggaacaa gcggcgtggg agacagcaaa ggagaaaggt 540

gttgacttgg tggtgttgaa tccggtgctg gttcttggac cgccgttaca gccgacgatc 600

aacgccagtc tttaccacgt cctcaaatat ctaaccggct cggctaagac ttatgctaat 660

ttgactcaag cttatgtgga tgttcgcgat gtcgcgctgg ctcatgttct ggtctatgag 720

gcaccctcgg cctccggacg ttatctccta gccgagagtg ctcgccaccg cggggaagtt 780

gttgagattc tggctaagct attcccggag tatcctcttc cgaccaagtg caaggacgag 840

aagaacccta gagccaagcc atacaaattc actaaccaga agattaagga cttaggctta 900

gagttcactt ccaccaagca aagcctctac gacacagtca agagcttaca agagaaaggc 960

catcttgctc ctcctcctcc tcctccttca gcatcgcaag aatccgtgga aaatggcatt 1020

aagatcgggt ct 1032

<210> 6

<211> 344

<212> PRT

<213> 擬南芥

<400> 6

Met Pro Val Asp Val Ala Ser Pro Ala Gly Lys Thr Val Cys Val Thr

1 5 10 15

Gly Ala Gly Gly Tyr Ile Ala Ser Trp Ile Val Lys Ile Leu Leu Glu

20 25 30

Arg Gly Tyr Thr Val Lys Gly Thr Val Arg Asn Pro Asp Asp Pro Lys

35 40 45

Asn Thr His Leu Arg Glu Leu Glu Gly Gly Lys Glu Arg Leu Ile Leu

50 55 60

Cys Lys Ala Asp Leu Gln Asp Tyr Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Asp

65 70 75 80

Gly Cys Asp Gly Val Phe His Thr Ala Ser Pro Val Thr Asp Asp Pro

85 90 95

Glu Gln Met Val Glu Pro Ala Val Asn Gly Ala Lys Phe Val Ile Asn

100 105 110

Ala Ala Ala Glu Ala Lys Val Lys Arg Val Val Ile Thr Ser Ser Ile

115 120 125

Gly Ala Val Tyr Met Asp Pro Asn Arg Asp Pro Glu Ala Val Val Asp

130 135 140

Glu Ser Cys Trp Ser Asp Leu Asp Phe Cys Lys Asn Thr Lys Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Cys Tyr Gly Lys Met Val Ala Glu Gln Ala Ala Trp Glu Thr Ala

165 170 175

Lys Glu Lys Gly Val Asp Leu Val Val Leu Asn Pro Val Leu Val Leu

180 185 190

Gly Pro Pro Leu Gln Pro Thr Ile Asn Ala Ser Leu Tyr His Val Leu

195 200 205

Lys Tyr Leu Thr Gly Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Asn Leu Thr Gln Ala

210 215 220

Tyr Val Asp Val Arg Asp Val Ala Leu Ala His Val Leu Val Tyr Glu

225 230 235 240

Ala Pro Ser Ala Ser Gly Arg Tyr Leu Leu Ala Glu Ser Ala Arg His

245 250 255

Arg Gly Glu Val Val Glu Ile Leu Ala Lys Leu Phe Pro Glu Tyr Pro

260 265 270

Leu Pro Thr Lys Cys Lys Asp Glu Lys Asn Pro Arg Ala Lys Pro Tyr

275 280 285

Lys Phe Thr Asn Gln Lys Ile Lys Asp Leu Gly Leu Glu Phe Thr Ser

290 295 300

Thr Lys Gln Ser Leu Tyr Asp Thr Val Lys Ser Leu Gln Glu Lys Gly

305 310 315 320

His Leu Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ala Ser Gln Glu Ser Val

325 330 335

Glu Asn Gly Ile Lys Ile Gly Ser

340

<210> 7

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 19-F

<400> 7

gcatctagaa acacaaacaa ggaaggaaga taaatgcacc accaccacca ccaccaccac 60

atgccagtcg acgtagcc 78

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 19-R

<400> 8

atgcgcggcc gcttatcaag acccgatctt aatgccattt tc 42

<210> 9

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 20-F

<400> 9

gcatctagac cgaaatcaaa aggaacacca acgtatgcac caccaccacc accaccacca 60

catggcgcca caagaacaag 80

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 20-R

<400> 10

atgcgcggcc gcttatcaca atccatttgc tagttttgcc c 41

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 21-F

<400> 11

atgcgcggcc gcttatcaca atccatttgc tagttttgcc c 41

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 21-R

<400> 12

atgcgcggcc gcttatcatc gcggctccct gagct 35

<210> 13

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 22-F

<400> 13

gcatctagac accttaagga ggtctatctt tcatatgcac caccaccacc accaccacca 60

catggagatt aacggggcac 80

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 22-R

<400> 14

atgcgcggcc gcttatcaac atattggaat gggagctcc 39

<210> 15

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 31-F

<400> 15

gcattctaga cccaacgaag ggggaaccac acaatatgca ccaccaccac caccaccacc 60

acaccttcgt tattgaactg gatatgaatg ttaccc 96

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BHB 31-R

<400> 16

atgcgcggcc gcttatcagt gtgctgccac ggctg 35

<210> 17

<211> 2175

<212> DNA

<213> 擬南芥

<400> 17

atggagatta acggggcaca caagagcaac ggaggaggag tggacgctat gttatgcggc 60

ggagacatca agacaaagaa catggtgatc aacgcggagg atcctctcaa ctggggagct 120

gcagcggagc aaatgaaagg tagccatttg gatgaagtga agagaatggt tgctgagttt 180

aggaagccag ttgtgaatct tggtggtgag actctgacca ttggacaagt ggctgcgatc 240

tcaactattg gtaacagtgt gaaggtggag ctatcggaga cagctagagc cggtgtgaat 300

gctagtagtg attgggttat ggagagtatg aacaaaggca ctgatagtta tggtgttact 360

actggttttg gtgctacttc tcatcggaga accaaaaacg gtgtcgcact tcagaaggaa 420

cttattagat tccttaacgc cggaatattc ggaagcacga aagaaacaag ccacacattg 480

ccacactccg ccacaagagc cgccatgctt gtacgaatca acactctcct ccaaggattt 540

tccggtatcc gatttgagat tctcgaagca attaccagtt tcctcaacaa caacatcact 600

ccatctctcc ccctccgtgg tacaatcacc gcctccggag atctcgttcc tctctcctac 660

atcgccggac ttctcaccgg tcgtcccaat tccaaagcta ctggtcccaa cggtgaagct 720

ttaacagcag aggaagcttt caaattagca ggaatcagct ccggattctt tgatctccag 780

cctaaggaag gtctcgcgct agtcaatggc acggcggttg gatctggaat ggcgtcaatg 840

gtgttattcg aaacgaatgt tctctctgtt ttggctgaga ttttgtcggc ggttttcgca 900

gaggtgatga gtggtaagcc tgagttcacc gatcatctca ctcacagact taaacatcat 960

cccggtcaaa tcgaagcggc ggcgataatg gagcatatcc tcgacggaag ctcgtacatg 1020

aaattagctc agaagcttca cgagatggat ccgttacaga aacctaaaca agatcgttac 1080

gctcttcgta cttctcctca atggttaggt cctcaaatcg aagtgatccg ttacgcaacg 1140

aaatcgatcg agcgtgagat taactccgtc aacgataatc cgttgatcga tgtttcgagg 1200

aacaaggcga ttcacggtgg taacttccaa ggaacaccaa tcggagtttc aatggataac 1260

acgagattgg cgatagcagc gattggtaaa ctcatgtttg ctcaattctc agagcttgtg 1320

aatgatttct acaacaatgg tttaccctcg aatctaaccg cttcgaggaa tccaagtttg 1380

gattatggat tcaagggagc tgagattgca atggcttctt attgttcaga gcttcaatac 1440

ttagctaatc ctgtgactag ccatgttcaa tcagcagagc aacataacca agatgtcaac 1500

tctttgggac taatctcgtc tcgcaaaact tctgaagctg ttgatattct caagcttatg 1560

tcaacaacgt tcctcgttgc gatttgtcaa gctgtggatt tgagacattt ggaggagaat 1620

ttgagacaga ctgtgaagaa cactgtctct caagtggcga agaaagttct tactactgga 1680

gtcaatggtg agcttcatcc ttctcgcttc tgcgaaaagg atttactcaa agttgtagac 1740

cgtgaacaag tctacacata cgcggatgat ccttgtagcg caacgtaccc gttgattcag 1800

aagctgagac aagttattgt tgaccatgct ttgatcaatg gtgagagtga gaagaatgca 1860

gtgacttcaa tcttccataa gattggagct ttcgaggagg agcttaaggc agtgctaccg 1920

aaagaagtgg aagcagcaag agcagcctac gataacggaa catcggctat cccgaacagg 1980

atcaaggaat gtaggtcgta tccattgtat agattcgtga gggaagagct tggaacagag 2040

cttttgaccg gagagaaagt gacgtcgcct ggagaagagt tcgacaaggt tttcacggcg 2100

atttgtgaag gtaaaatcat tgatccgatg atggaatgtc tcaacgagtg gaacggagct 2160

cccattccaa tatgt 2175

<210> 18

<211> 1683

<212> DNA

<213> 擬南芥

<400> 18

atggcgccac aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac 60

agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg gatatttaca tcccgaacca cctatctctc 120

cacgactaca tcttccaaaa catctccgag ttcgccacta agccttgcct aatcaacgga 180

ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac gtccacgtca tctcccgcca aatcgccgcc 240

aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac gacgtcgtca tgctcctcct cccaaactgt 300

cccgagttcg tcctctcttt cctcgccgcc tccttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca 360

aaccctttct tcactccggc ggagatagct aaacaagcca aagcctccaa caccaaactc 420

ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa atcaaaccac ttcaaaacga cgacggagta 480

gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc gtgccaatcc ctgaaggctg cctccgcttc 540

accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca tcagaagtca tcgactcggt ggagatttca 600

ccggacgacg tggtggcact accttactcc tctggcacga cgggattacc aaaaggagtg 660

atgctgactc acaagggtct agtcacgagc gttgctcagc aagtcgacgg cgagaacccg 720

aatctttatt tccacagcga tgacgtcata ctctgtgttt tgcccatgtt tcatatctac 780

gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt agagttggtg cggcgattct gataatgccg 840

aagtttgaga tcaatctgct attggagctg atccagaggt gtaaagtgac ggtggctccg 900

atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg aagtcttcgg agacggagaa gtatgatttg 960

agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct gctcctcttg gtaaagaact tgaagatgcc 1020

gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc ggtcagggat acggaatgac ggaagcaggt 1080

ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca aaggaacctt ttccggttaa gtcaggagct 1140

tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg aaaatagttg atccagacac cggagattct 1200

ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt attcgtggtc accagatcat gaaaggttac 1260

ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc attgataaag acggttggct tcatactgga 1320

gatattggat tgatcgatga cgatgacgag cttttcatcg ttgatcgatt gaaagaactt 1380

atcaagtata aaggttttca ggtagctccg gctgagctag aggctttgct catcggtcat 1440

cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca atgaaagaag aagcagctgg tgaagttcct 1500

gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg gagttatcag aagatgatgt gaagcaattc 1560

gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga atcaacaaag tgttcttcac tgaatccatt 1620

cctaaagctc catcagggaa gatattgagg aaagatctga gggcaaaact agcaaatgga 1680

ttg 1683

<210> 19

<211> 1569

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 苯丙氨酸解氨酶 (密碼子優(yōu)化)

<400> 19

atgaccttcg ttattgaact ggatatgaat gttaccctgg accaactgga agatgcggcc 60

cgtcagcgta ccccggtgga actgtctgcc ccggtgcgtt cccgcgtgcg tgcctcacgt 120

gatgttctgg tcaaatttgt tcaggacgaa cgcgtgatct atggcgttaa cacctcgatg 180

ggcggtttcg tggatcatct ggtgccggtt tcacaagcgc gtcagctgca agaaaacctg 240

attaatgcgg cggcaacgaa tgtgggtgcc tacctggatg acaccacggc acgcaccatt 300

atgctgtcgc gtatcgttag cctggcgcgc ggcaacagcg ctatcacgcc ggcgaatctg 360

gataaactgg tcgccgtgct gaacgcaggt attgtgccgt gcatcccgga aaaaggctct 420

ctgggcacca gcggcgacct gggtccgctg gctgcgatcg ctctggtttg tgcgggccag 480

tggaaagccc gttataacgg ccagattatg ccgggtcgcc aagccctgtc cgaagcaggc 540

gtggaaccga tggaactgtc atacaaagat ggtctggcgc tgattaatgg cacgagcggt 600

atggtgggtc tgggcacgat ggtgctgcaa gcagcacgtc gcctggttga tcgctatctg 660

caagtcagcg ctctgtctgt ggaaggcctg gcgggtatga ccaaaccgtt tgacccgcgt 720

gttcatggcg tcaaaccgca ccgcggtcag cgtcaagttg cctctcgcct gtgggaaggc 780

ctggctgata gtcacctggc ggtcaacgaa ctggacacgg aacagaccct ggcaggcgaa 840

atgggcaccg tggctaaagc gggttcgctg gctattgaag atgcgtatag catccgttgc 900

acgccgcaga ttctgggtcc ggtggttgat gttctggacc gcatcggtgc aaccctgcaa 960

gatgaactga atagctctaa cgacaatccg attgtcctgc cggaagaagc ggaagtgttt 1020

cataacggcc atttccacgg tcaatacgtg gcgatggcga tggatcacct gaatatggct 1080

ctggcgaccg ttacgaacct ggctaatcgt cgcgtcgatc gttttctgga caaatcaaac 1140

tcgaatggtc tgccggcctt cctgtgtcgt gaagatccgg gtctgcgtct gggtctgatg 1200

ggcggtcaat ttatgacggc ctctatcacc gcagaaaccc gtacgctgac cattccgatg 1260

agtgtgcagt ccctgacgtc aaccgcggat ttccaagaca tcgttagttt tggtttcgtc 1320

gctgcacgtc gcgcccgcga agtcctgacc aatgccgcat acgtcgtggc atttgaactg 1380

ctgtgcgcct gtcaggcagt tgatattcgt ggtgcggaca aactgagttc cttcacgcgc 1440

ccgctgtatg aacgcacccg taaaatcgtc ccgtttttcg atcgcgacga aacgattacc 1500

gattacgtgg aaaaactggc agccgacctg attgcgggtg aaccggtgga tgcagccgtg 1560

gcagcacac 1569