本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用復(fù)雜的體系提取獲取金銀花中綠原酸粗品的方法。具體的，涉及離子液體超聲酶解提取金銀花中綠原酸的方法。
背景技術(shù)：
金銀花是忍冬科植物的花蕾，性味甘寒，具有清熱解毒、 抗菌消炎、 消癰散腫和保肝利膽之功效。金銀花在我國分布較廣，藥用歷史悠久，是國家衛(wèi)生部首批頒布的既是食品又是藥品的60種中藥材之一。
金銀花中含有綠原酸、黃酮化合物和芳樟醇等活性成分，其中，綠原酸是金銀花中的主要活性成分，被國際公認(rèn)為“植物黃金”。而且，綠原酸因具有抗菌消炎、保肝利膽、延緩衰老等多種作用，被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)，所以從植物中提取分離綠原酸具有重大意義。
離子液體是由無機(jī)酸根陰離子和體積較大的有機(jī)陽離子組成的液體。其具有優(yōu)良的化學(xué)性質(zhì)，如蒸汽壓低，在較寬的溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性好，可調(diào)的物理化學(xué)性質(zhì)等，因為在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)，又稱室溫離子液體，是近年來興起的一類綠色溶劑。
綠原酸的分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個不穩(wěn)定部分。在現(xiàn)有提取技術(shù)中，通常采用的提取技術(shù)手段為水提法與有機(jī)溶劑提取法。王茜等[王茜, 李智, 何琦, 等. 杜仲葉中綠原酸提取分離工藝條件的研究[J]. 離子交換與吸附, 2008, 24(1): 73-80.]將水作為提取溶劑，并對水提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，綠原酸的提取率為1.48%。肖文平等[肖文平, 李娟. 金銀花中綠原酸的提取和含量測定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(35): 21675-21676.]采用乙醇回流法考察影響金銀花中綠原酸提取率的因素，并優(yōu)化了提取工藝參數(shù)，結(jié)果表明，綠原酸的提取率為3.81%。傳統(tǒng)的綠原酸提取法表現(xiàn)出了提取率較低的問題，另外，長時間相對較高的溫度有可能會導(dǎo)致綠原酸的分解，從而造成分離純化成本的增加。因此，新的提取分離方法也亟需出現(xiàn)，近年來新興起了各種新型的提取方法。例如，梅林等[梅林. 金銀花中綠原酸的酶法提取工藝優(yōu)化[J]. 廣州化學(xué), 2007, 32(4): 30-34.]采用酶法優(yōu)化金銀花中的綠原酸的提取工藝并得出了最佳提取條件，結(jié)果顯示，綠原酸提取率為3.57%。劉亞敏等人[劉亞敏, 劉玉民, 李瓊, 等. 超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝及其抗氧化性研究[J]. Xu Wenjing等人[Xu W J, Zhai J W, Cui Q, et al. Ultra-turrax based ultrasound-assisted extraction of five organic acids from honeysuckle (Lonicera japonica Thunb.) and optimization of extraction process[J]. Separation and Purification Technology, 2016, 166: 73-82.]采用超聲輔助提取金銀花中的綠原酸，優(yōu)化了提取提取工藝，并得出了最優(yōu)參數(shù)，結(jié)果表明，綠原酸的提取率達(dá)到了5.26%。Zhang Lijin等人[Zhang L J, Liu J F, Zhang P P, et al. Ionic liquid-based ultrasound-assisted extraction of chlorogenic acid from Lonicera japonica Thunb[J]. Chromatographia, 2011, 73(1-2): 129-133.]利用親水性離子液體[BMIM][BF4]超聲提取金銀花中的綠原酸，考察了粒徑，[BMIM][BF4]濃度，pH，提取溫度，超聲功率，超聲時間等6個因素并得出最優(yōu)工藝參數(shù)，結(jié)果表明：該方法下的綠原酸提取率為5.29%，較單一超聲法提高了37.9%，較乙醇回流法提高了18.8%。強(qiáng)極性的離子液體對天然產(chǎn)物具有較強(qiáng)的溶解和提取能力，而且很多種類的離子液體對酶具有穩(wěn)定和活化作用，本發(fā)明將離子液體、酶與超聲三者結(jié)合，用于金銀花中綠原酸的提取，發(fā)展一種更加高效的提取新方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提升現(xiàn)有技術(shù)中金銀花提取綠原酸的提取率，降低提取的成本，降低提取過程中的污染。
為了解決該技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
一種從金銀花中提取綠原酸的方法，其中，該方法的具體步驟為：
（1）將金銀花粉粹，加入離子液體中，混勻得到混合物；
（2）在混合物中加入乙醇、0.5-2%（占金銀花的比重）的酶，并調(diào)節(jié)混合物的pH值為3-5；
（3）超聲至提取結(jié)束；
（4）過濾獲取濾液；
（5）先減壓濃縮并回收乙醇，再用乙酸乙酯反萃取綠原酸并回收離子液體，濃縮得到綠原酸粗提物。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述離子液體為甲基咪唑氯鹽，1-丁基-3-乙基咪唑氯鹽，1-丁基-3-乙基咪唑甲酸鹽，1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽中的一種。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述離子液體在萃取體系中的濃度為0.1-1.5mol/L。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述乙醇濃度為70%。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述酶用量為金銀花干重的0.5%-2%。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述的超聲溫度為45℃，超聲時間為30-60min，超聲功率為60-100W。
本發(fā)明所述的方法，其中，步驟（5）中，先減壓濃縮回收乙醇，再將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層之后分別回收處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮得綠原酸粗提物。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述酶為果膠酶或者纖維素酶。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述金銀花干重與乙醇體積的比為1:30-50。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中：
采用離子液體超聲提取金銀花中綠原酸的方法，包括如下步驟：將金銀花粉碎成粉末放置平底燒瓶，加入料液比為1:30-1:50的體積濃度為70%的乙醇，質(zhì)量濃度為0.5-2%（金銀花干重）的果膠酶或者纖維素酶，并加入離子液體，使得離子液體在最終的萃取體系中的濃度為0.1-1.5mol/L，調(diào)節(jié)體系pH為3-5；超聲溫度45℃，超聲功率為60-100 W的設(shè)備中超聲時間30min-60min，過濾提取液，濃縮回收乙醇，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層之后分別回收處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即得綠原酸粗提物。
本發(fā)明的有益效果在于
（1）本發(fā)明采用離子液體輔助超聲酶法提取金銀花中的綠原酸，提取時間較短，提取效率較已報道文獻(xiàn)有所提高。
（2）本發(fā)明工藝簡單、條件溫和、節(jié)能環(huán)保、溶劑可回收利用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：超聲法提取綠原酸
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，稱取金銀花粉末2g，在料液比為1:50，乙醇濃度為70%，體系pH為5，超聲溫度為45℃，超聲功率為180W，超聲時間為60min的條件下提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該條件下綠原酸提取率可以達(dá)到4.73%。
實(shí)施例2：果膠酶法提取綠原酸
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，在料液比為1:50，乙醇濃度為70%，果膠酶用量為1%，體系pH為5，加熱溫度為50℃的條件下回流60min提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該條件下綠原酸提取率可以達(dá)到4.20%。
實(shí)施例3超聲-纖維素酶法提取綠原酸
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在料液比為1:50，纖維素酶用量為0.8%，體系pH為5，超聲功率為150W，超聲時間為50min的條件下提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該條件下綠原酸提取率可以達(dá)到5.73%。
實(shí)施例4 超聲-果膠酶酶法提取綠原酸
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在料液比為1:50，果膠酶用量為1.2%，體系pH為4，超聲功率為120W，超聲時間為40min的條件下提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該條件下綠原酸提取率可以達(dá)到6.01%。
實(shí)施例5 超聲-果膠酶法提取綠原酸（甲基咪唑氯鹽）
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體甲基咪唑氯鹽為0.6mol/L，料液比為1:40，果膠酶用量為0.5%，體系pH為4，超聲功率為90W的條件下，超聲50min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，該條件下綠原酸提取率可以達(dá)到6.51%。重復(fù)使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.23%。
實(shí)施例6 超聲-果膠酶法提取綠原酸（1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽）
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽為0.5mol/L，料液比為1:50，果膠酶用量為0.8%，體系pH為4，超聲功率為80W的條件下，超聲40min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在該條件下，綠原酸提取率可以達(dá)到6.42%。重復(fù)使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.39%。
實(shí)施例7 超聲-果膠酶法提取綠原酸（1-丁基-3-乙基咪唑甲酸鹽）
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體1-丁基-3-乙基咪唑甲酸鹽為0.6mol/L，料液比為1:40，果膠酶用量為0.5%，體系pH為4，超聲功率為90W的條件下，超聲40min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在該條件下綠原酸提取率可以達(dá)到6.50%。重復(fù)使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.48%。
實(shí)施例8 超聲-果膠酶法提取綠原酸（1-丁基-3-乙基咪唑氯鹽）
金銀花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體1-丁基-3-乙基咪唑氯鹽為0.9mol/L，料液比為1:30，果膠酶用量為1.0%，體系pH為4，超聲功率為70W的條件下，超聲30min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，該條件下原酸提取率可以達(dá)到6.83%。重復(fù)使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.82%。