本發(fā)明屬于生物免疫領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種全人源cd19單克隆抗體。

背景技術(shù)：

cd19是重要的b細胞惡性腫瘤的靶點。cd19幾乎表達在b細胞發(fā)育的所有時期，以及各種b細胞腫瘤中，但是，重要的是cd19并不表達在多能性造血干細胞上。這些特點使得cd19成為了很好的b細胞腫瘤的靶點。雖然靶向cd19會摧毀正常b細胞，但是，這一缺陷能夠被患者很好的耐受。當前靶向cd19的單抗，嵌合抗原受體或者是雙特異性抗體均采用的是鼠源或者人源化的序列。但是鼠源或者人源化的序列中含有的鼠源成分可能會引起引起人抗鼠抗體(hama，humanantimouseantibody)反應(yīng)，導(dǎo)致抗體效力的降低，甚至帶來嚴重的副反應(yīng)。因此開發(fā)新型的全人源cd19抗體或者是scfv有迫切需要。

單鏈抗體(single—chainantibodyfragment，scfv)是單克隆抗體的一種形式，通過將抗體的可變區(qū)通過鉸鏈區(qū)相連接，形成了單鏈可變區(qū)，也稱為單鏈抗體。scfv保留了抗體的抗原結(jié)合能力的最小單位。由于其結(jié)構(gòu)更小，更利于基因工程操作，所以被廣泛用于人源抗體的構(gòu)建、篩選和應(yīng)用。例如car-t技術(shù)就采用scfv結(jié)構(gòu)的抗體做為嵌合受體識別抗原的區(qū)域；也可以通過兩個scfv串聯(lián)形成雙特異性抗體。另外由于scfv包含了抗體結(jié)合抗原的所有序列，可以輕易的通過基因工程手段將其改造為傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)的抗體，例如通過加入cl,ch1，ch2，ch3等區(qū)域改造為不同類型的igg抗體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種全人源抗cd19單克隆抗體，包括人來源的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其特征在于：所述輕鏈可變區(qū)包含序列表seqidno:2所示的cdrl1，seqidno:4所示的cdrl2及seqidno:6所示的cdrl3；所述重鏈可變區(qū)序列包含seqidno:10所示的cdrh1，seqidno:12所示的cdrh2及seqidno:14所示的cdrh3。

優(yōu)選地，所述的全人源抗cd19單克隆抗體包含如序列表seqidno:8所示的vh序列及seqidno:16所示的vl序列。

優(yōu)選地，所述全人源抗cd19單克隆抗體為單鏈抗體，其序列由一段linker序列將vh,vl連接，連接方式為vh-linker-vl，或vl-linker-vh。

優(yōu)選地，所述linker序列為ggggsggggsggggs。

優(yōu)選地，所述linker序列為為(ggggs)n，其中n為自然數(shù)。

優(yōu)選地，所述的全人源抗cd19單克隆抗體的cd19單鏈抗體(scfv)2a3序列如序列表seqidno:20所示。2a3序列通過全人源scfv噬菌體展示文庫篩選獲得。通過imgtv-quest分析其人源胚系序列的來源見表1。

表1：cd19scfv2a3胚系基因來源

一種編碼上述cd19全人源抗體的核苷酸序列，其特征在于，編碼該抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列包含seqidno:1所示的cdrl1，seqidno:3所示的cdrl2，seqidno:5所示的cdrl3,編碼該抗體的重鏈可變區(qū)核苷酸包含seqidno:9所示的cdrh1，seqidno:11所示的cdrh2及seqidno:13所示的cdrh3。

一種全人源抗cd19單克隆抗體的制備方法：包括如下步驟：

重組質(zhì)粒pef-2a3轉(zhuǎn)染hek293t細胞

轉(zhuǎn)染前一天向t175瓶中接種hek293t細胞，第二天在細胞密度大約為80％時進行轉(zhuǎn)染。首先取無血清培養(yǎng)1.5ml中加入質(zhì)粒60ug；其次再取無血清培養(yǎng)基1.5ml加入120ullipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑；將質(zhì)粒和脂質(zhì)體溶液混合均勻，室溫靜置15分鐘后加入細胞培養(yǎng)基中；6小時后培養(yǎng)基換為新鮮的dmem+10％fbs培養(yǎng)基；72小時后收取培養(yǎng)上清。上清中即含單鏈抗體。

優(yōu)選地，所述的全人源抗cd19單克隆抗體的制備方法進一步包括單鏈抗體純化：首先向重力柱中加入500ul鎳填料懸濁液，待液體流干后向其中加入10mlpbs平衡體系；將培養(yǎng)基上清加入到重力柱中，使其自然流出；隨后使用10mm，20mm,50mm咪唑的pbs進行洗滌，以洗去雜蛋白；最后用500ul含200mm咪唑的pbs洗脫單鏈抗體；之后將所得單鏈抗體加入脫鹽柱中，離心以除去咪唑，最終得到純化的全人源cd19單鏈抗體。

優(yōu)選地，所述的全人源抗cd19單克隆抗體的制備方法進一步包括全人源cd19單鏈抗體的檢測：使用考馬斯亮藍染色以及免疫印跡分別檢測目的蛋白的表達。樣品：pef空載體轉(zhuǎn)染細胞上清，pef-2a3轉(zhuǎn)染細胞上清，純化后的單鏈抗體上樣并進行sds-page電泳，電泳之后進行考馬斯亮藍染色或者進行免疫印跡，使用ha抗體檢測單鏈抗體的表達。

有益效果：本發(fā)明的cd19單克隆抗體為全人源序列，其序列完全來自人源基因，因此相對于傳統(tǒng)的鼠源單抗，嵌合單抗，人源化單抗具有免疫原性低，不引起hama反應(yīng)等優(yōu)點，具有更好的穩(wěn)定性和安全性。

本發(fā)明的這些目的，特點將會在下面的具體實施方式，附圖，和權(quán)利要求中詳細的揭露。

附圖說明

圖1為根據(jù)本發(fā)明實施例一的pef-2a3結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為根據(jù)本發(fā)明實施例二單鏈抗體檢測中sds-page電泳及考馬斯亮藍染色結(jié)果。

圖3為根據(jù)本發(fā)明實施例三的抗原結(jié)合能力檢測結(jié)果。

圖4為根據(jù)本發(fā)明實施例四的抗原結(jié)合特異性檢測結(jié)果。

具體實施方式

請參見圖1和圖2，本發(fā)明為一種全人源抗cd19單克隆抗體，包括人來源的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含序列表seqidno:2所示的cdrl1，seqidno:4所示的cdrl2及seqidno:6所示的cdrl3；所述重鏈可變區(qū)序列包含seqidno:10所示的cdrh1，seqidno:12所示的cdrh2及seqidno:14所示的cdrh3。

其具體實施方式如下。

實施例一：cd19單鏈抗體2a3的序列以及載體構(gòu)建

本發(fā)明中cd19單鏈抗體2a3序列由vl和vh，通過一段linker序列連接而成，結(jié)構(gòu)為vl-linker-vh。其linker氨基酸序列為ggggsggggsggggs。

vl的序列特征在于含有表一所示的三個輕鏈互補決定區(qū)cdrl1，cdrl2，cdrl3。vl完整序列見序列表。該序列來源于人胚系基因

vh的序列特征在于含有表一所示的三個重鏈互補決定區(qū)vhcdr1,cdr2，cdr3。vh完整序列如序列表所示。該序列來源于人胚系基因

完整的2a3序列由vl,linker,vh順序排列組成，如序列表所示。需特別提出的是，雖然本實施例中僅提供了vl-linker-vh一種結(jié)構(gòu)的scfv序列的實驗結(jié)果，但是通過常規(guī)的分子生物學方法，可以快速的構(gòu)建出結(jié)構(gòu)為vh-linker-vl的scfv序列。linker序列可以替換為(ggggs)n。以上所指出的替換不會影響單鏈抗體對于cd19的識別，故這些結(jié)構(gòu)的單鏈抗體也應(yīng)該在本專利的保護范圍之內(nèi)。

為了方便單鏈抗體的檢測以及純化，我們在2a3之后加入了ha和6*his標簽，結(jié)構(gòu)為2a3-ha-his，由于ha和his標簽很小，一般認為其不會影響scfv結(jié)合抗原的能力。為了便于單鏈抗體在哺乳動物細胞中的分泌性表達，我們在2a3的c端加入了信號肽序列，該信號肽會在蛋白質(zhì)合成過程中被剪切掉，從而并不會影響scfv的正常功能，但是可以促進單鏈抗體的分泌表達。故完整的2a3-ha-hi序列為:

蛋白序列

myrmqllscialslalvtnsqsvltqppsasgtpgqrvtiscsgrksnigsktvnwyqqlpgtapklliynnyerpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycaawddslhgpvfgggtkltvlgggggsggggsggggsqvqlqesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakdlrrwggsqtdafdiwgqgtmvtvspgsasaptlsgypydvpdyahhhhhh

dna序列

atgtaccggatgcagctgctgagctgtatcgccctgagcctggctctggttaccaactctcagagcgtgctgacccagcctccttctgcttctggaacccctggacagcgtgtgacaatcagctgcagcggaagaaaatccaacatcggatccaagactgtgaactggtaccagcagctgcccggaactgcacctaaactcctcatctacaataactacgagaggccctctggcgtgcccgacaggttcagcggaagcaagtcaggaaccagcgcctctctggctatcagcggactgcaatctgaagacgaggccgactactactgcgccgcttgggacgactctctccatggacctgtgtttggcggagggacaaagctgacagtgctgggaggtggaggaggatcaggaggaggaggatctggaggaggaggttctcaggtgcagctgcaagagagcggaggaggactggttcagcctggaggaagtctgagactgagctgtgccgcaagtggattcacattcagcagctacgcaatgtcatgggtgaggcaggcacccggaaagggactggagtgggtgagcgctataagcggaagcggaggaagcacatactacgccgattctgtgaagggccggttcacaatttccagagacaatagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacacagctgtgtactactgcgcaaaggacctgagacggtggggaggatcacagacagacgctttcgacatctggggacaaggcaccatggtgaccgtgtcaccaggaagtgccagcgctcctacactgtccggatacccttacgacgtgcccgattacgcccatcaccaccatcaccac

完整編碼框由奧吉生物公司合成，并且通過nhei和noti酶切位點克隆到載體pef-ires-puro上。重組質(zhì)粒pef-2a3-ha-his-ires-puro(簡寫為pef-2a3)使用qiagen中提試劑盒抽提，并經(jīng)過酶切和測序驗證序列正確。在該克隆中，scfv編碼框位于ef-1a啟動子的下游，scfv的下游分別為核糖體內(nèi)部進入位點ires，嘌呤霉素抗性基因，sv40polya轉(zhuǎn)錄終止元件。嘌呤霉素抗性基因可以用于構(gòu)建穩(wěn)定表達單鏈抗體的細胞系，在大量制備單鏈抗體時使用。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示。

實施例二：cd19單鏈抗體的制備

重組質(zhì)粒pef-2a3轉(zhuǎn)染hek293t細胞:轉(zhuǎn)染前一天向t175瓶中接種hek293t細胞，第二天在細胞密度大約為80％時進行轉(zhuǎn)染。首先取無血清培養(yǎng)1.5ml中加入質(zhì)粒60ug；其次再取無血清培養(yǎng)基1.5ml加入120ullipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑；將質(zhì)粒和脂質(zhì)體溶液混合均勻，室溫靜置15分鐘后加入細胞培養(yǎng)基中；6小時后培養(yǎng)基換為新鮮的dmem+10％fbs培養(yǎng)基；72小時后收取培養(yǎng)上清。上清中即含單鏈抗體。

單鏈抗體2a3的純化：首先向重力柱中加入500ul鎳填料懸濁液，待液體流干后向其中加入10mlpbs平衡體系；將培養(yǎng)基上清加入重力柱中，使其自然流出；隨后使用10mm，20mm,50mm咪唑的pbs進行洗滌，以洗去雜蛋白；最后用500ul含200mm咪唑的pbs洗脫單鏈抗體；之后將所得單鏈抗體加入脫鹽柱中，離心以除去咪唑，最終得到目的蛋白。

單鏈抗體的檢測：使用考馬斯亮藍染色以及免疫印跡分別檢測目的蛋白的表達。樣品：pef空載體轉(zhuǎn)染細胞上清，pef-2a3轉(zhuǎn)染細胞上清，純化后的單鏈抗體2a3上樣并進行sds-page電泳，電泳之后進行考馬斯亮藍染色或者進行免疫印跡，使用ha抗體檢測單鏈抗體2a3的表達。結(jié)果參見圖2。

實施例三：cd19抗原結(jié)合能力檢測

使用elisa法檢測cd19單鏈抗體2a3于cd19抗原的結(jié)合能力。首先使用cd19抗原包被酶標板，抗原濃度為2ug/ml，包被液為碳酸鈉緩沖液，4℃包被過夜。用2％mpbs封閉酶標板和單鏈抗體2a3，室溫2小時。將100ul封閉后的2a3加入封閉后的酶標板中，對照孔中加入bsa做為對照，室溫孵育1小時。使用pbst洗板5次，pbs洗板2次；加入anti-ha-hrp抗體孵育1小時；使用pbst洗板5次，pbs洗板2次；加入tmb顯色液，100微升/孔；室溫顯色5-30分鐘，直至孔中顯示出適當程度的藍色，加入50ul濃硫酸以終止反應(yīng)，立即在酶標儀讀取450nm處的吸光度值。檢測結(jié)果參見圖3。結(jié)果表明2a3單抗能夠有效結(jié)合cd19抗原。

實施例四：cd19結(jié)合特異性分析

使用elisa法檢測抗體2a3對于cd19，cd20，cd30，cd33，cd138,pd-1，pd-l1等多個抗原的結(jié)合能力以分析2a3結(jié)合cd19的能力是否具有特異性。首先使用上述7個抗原分別包被酶標板，抗原濃度均為2ug/ml，4℃包被過夜。第二天用2％mpbs封閉酶標板和單鏈抗體2a3，室溫2小時。將100ul封閉后的2a3加入封閉后的酶標板中，室溫孵育2小時。使用pbst洗板5次，pbs洗板2次；加入anti-ha-hrp抗體孵育1小時；使用pbst洗板5次，pbs洗板2次；加入tmb顯色液，100微升/孔；室溫顯色5-30分鐘，直至孔中顯示出適當程度的藍色，加入50ul終止液以終止反應(yīng)，立即在酶標儀讀取450nm處的吸光度值。檢測結(jié)果參見圖4。結(jié)果說明單抗2a3能夠有效結(jié)合cd19，但是不能結(jié)合其它6種抗原，證明了單抗2a3對于cd19結(jié)合的特異性。

通過上述實施例，本發(fā)明的目的已經(jīng)被完全有效的達到了。熟悉該項技藝的人士應(yīng)該明白本發(fā)明包括但不限于附圖和上面具體實施方式中描述的內(nèi)容。任何不偏離本發(fā)明的功能和結(jié)構(gòu)原理的修改都將包括在權(quán)利要求書的范圍中。