本發(fā)明涉及家禽血液分離鑒定檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1981年I. Siegel發(fā)現(xiàn)了紅細(xì)胞的多種免疫功能，并預(yù)見(jiàn)了血清中存在著紅細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)及紅細(xì)胞殺傷病原的作用。20世紀(jì)50年代，Nelson首次發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞具有免疫粘附功能，粘附的復(fù)合物更易被白細(xì)胞吞噬。現(xiàn)已證實(shí)，紅細(xì)胞能自我調(diào)控和參與機(jī)體免疫調(diào)控，具有粘附、殺傷抗原、傳遞抗原信息和清除循環(huán)中免疫復(fù)合物的作用，是完整機(jī)體兔疫系統(tǒng)中的重要組成部分?！凹t細(xì)胞免疫系統(tǒng)”的新概念，更新了人們對(duì)紅細(xì)胞功能的認(rèn)識(shí)，使紅細(xì)胞免疫研究得到了迅速發(fā)展。

紅細(xì)胞與其他細(xì)胞均來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，以往認(rèn)為紅細(xì)胞的主要功能是運(yùn)輸氣體及調(diào)節(jié)酸堿平衡。目前的研究表明，紅細(xì)胞通過(guò)自身C3b受體去識(shí)別、粘附、濃縮、殺傷抗原和清除有害物質(zhì)，是整體兔疫系統(tǒng)不可缺少的組成成分。

紅細(xì)胞能清除循環(huán)兔疫復(fù)合物，促進(jìn)吞噬作用，類似兔疫細(xì)胞的功能紅細(xì)胞還具有識(shí)別、儲(chǔ)存、遞呈抗原的功能和效應(yīng)細(xì)胞樣作用。此外，紅細(xì)胞對(duì)免疫功能的還具有調(diào)控作用。紅細(xì)胞對(duì)吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有調(diào)控作用，并促進(jìn)T細(xì)胞分化。紅細(xì)胞還能直接增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，顯著提高淋巴因子激活殺傷(LAK)細(xì)胞的活性。影響紅細(xì)胞免疫功能的影響因素主要有，血清中紅細(xì)胞兔疫調(diào)節(jié)因子，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控以及溫度調(diào)控。

動(dòng)物紅細(xì)胞免疫研究起步較晚，郭峰等1982年建立的紅細(xì)胞免疫粘附能力測(cè)定方法，國(guó)內(nèi)張德成(1992)等率先測(cè)定了多種健康動(dòng)物的紅細(xì)胞C3b和IC花環(huán)率，其中包括對(duì)雞、鴨、鵝等家禽的測(cè)定，由此開(kāi)始了對(duì)家禽紅細(xì)胞免疫功能的研究。隨后，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)健康家禽、患病家禽及疫苗免疫家禽的紅細(xì)胞免疫功能等方而進(jìn)行了以下幾方面比較深入的研究。

1、正常家禽的紅細(xì)胞免疫功能：

研究表明，不僅馬、牛、羊、豬、驢等哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞具有免疫粘附功能，雞、鴨、鵝、鴿、鶴鶉等禽類的紅細(xì)胞同樣具有免疫粘附活性，證明紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)假說(shuō)不僅在哺乳動(dòng)物中成立，也同樣適用于禽類。

2、疾病對(duì)家禽紅細(xì)胞免疫功能的影響：

患病家禽的紅細(xì)胞免疫粘附活性有明顯改變。患雞霍亂、禽流感、雞傳染性囊病、雞傳染性喉氣管炎、雞傳染性支氣管炎、鴨病毒性肝炎、雞包涵體肝炎等病的家禽的紅細(xì)胞免疫粘附功能受損，C3b花環(huán)率明顯降低。球蟲(chóng)病雞紅細(xì)胞C3b花環(huán)率顯著降低，IC花環(huán)率升高。氟中毒病雞的紅細(xì)胞C3b花環(huán)率和IC花環(huán)率均降低，并有劑量一時(shí)間效應(yīng)。對(duì)馬立克氏病的研究相對(duì)較多，但結(jié)果不盡一致。高學(xué)軍(1999)研究表明，1日齡AA雛雞馬立克氏病強(qiáng)毒人工感染后，紅細(xì)胞C3b和IC花環(huán)率均先升高后降低。鮑恩東的研究顯示，馬立克氏病自然發(fā)病雞C3b花環(huán)率降低，IC花環(huán)率略有降低。筆者認(rèn)為，以上研究結(jié)果不一致的原因，可能與受試雞齡期及種屬不同有關(guān)，也可能與檢測(cè)方法不夠規(guī)范，標(biāo)準(zhǔn)不夠統(tǒng)一有關(guān)。

3、疫苗免疫對(duì)紅細(xì)胞免疫功能的影響：

李淑芳等(2002)研究表明，傳染性喉氣管炎疫苗免疫3天后，C3b和IC花環(huán)率顯著降低，免疫后9天，花環(huán)率恢復(fù)至正常水平，疫苗免疫的同時(shí)使用中藥增強(qiáng)劑能夠消除紅細(xì)胞免疫后功能短暫性降低的不良反應(yīng)。鮑恩東等(2000)比較研究了馬立克氏病18口齡胚胎免疫和1日齡雛雞免疫對(duì)雛雞紅細(xì)胞免疫粘附功能的影響，發(fā)現(xiàn)胚胎免疫及雛雞免疫均導(dǎo)致雞紅細(xì)胞C3b花環(huán)率升高，IC花環(huán)率降低，但胚免組C3b花環(huán)率升高幅度更大；IC花環(huán)率卜降幅度更大。作者認(rèn)為，胚免雞血清中紅細(xì)胞免疫粘附抑制因子活性卜降，使得紅細(xì)胞兔疫功能更好地發(fā)揮。

總體而言，國(guó)內(nèi)外對(duì)于動(dòng)物紅細(xì)胞免疫功能的研究還停留在初級(jí)階段，僅僅停留在紅細(xì)胞玫瑰花環(huán)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。主要限制紅細(xì)胞功能研究的因素是難以獲得高純度的紅細(xì)胞個(gè)體，排除血液中其他細(xì)胞的污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上研究現(xiàn)狀，本發(fā)明目的是提出一種快速、高效、高純度分離家禽紅細(xì)胞的方法，以利于對(duì)于家禽紅細(xì)胞功能的研究。

本發(fā)明方法是：將檸檬酸鈉或肝素抗凝的家禽血樣先與PBS或生理鹽水混合后再加到淋巴細(xì)胞分離液表面，經(jīng)水平離心機(jī)離心處理，棄去離心后的血漿、淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分離液和最上層的紅細(xì)胞，取得高純家禽紅細(xì)胞。

通過(guò)該發(fā)明的方法高效，得到的家禽紅細(xì)胞純度達(dá)到99.9%以上，沒(méi)有血液中其他細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞的污染，為研究家禽紅細(xì)胞的生物學(xué)功能提供了非常好的生物樣品。本發(fā)明建立了一種方便快速有效分離高純度家禽紅細(xì)胞的方法，便于顯微操作，能夠高效、準(zhǔn)確地獲取高純度家禽紅細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞鑒定及生物學(xué)功能研究。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述淋巴細(xì)胞分離液的密度為1.119。為了使分離的紅細(xì)胞污染淋血液中巴細(xì)胞的幾率降到最低，本發(fā)明選擇SIGMA公司密度為1.119的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行紅細(xì)胞的分離。

所述家禽血樣與PBS或生理鹽水的混合體積比為1:1。為了達(dá)到淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞分離的最佳效果，將家禽血樣與PBS或生理鹽水預(yù)先按此體積比混合。

所述水平離心機(jī)的離心率為200g，離心處理20分鐘后采用離心機(jī)自然停止的方式。該離心條件操作可以最大程度避免分離的紅細(xì)胞受到淋巴細(xì)胞的污染。

附圖說(shuō)明

圖1為高純度紅細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)。

圖2為高純度紅細(xì)胞瑞氏染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

一、高純度家禽紅細(xì)胞的分離：

利用檸檬酸鈉或肝素抗凝管靜脈采集家禽血液。

用密度梯度離心法，從取得的檸檬酸鈉或肝素抗凝的家禽血樣中分離紅細(xì)胞的具體步驟如下：

1、采集2mL家禽血樣與2mL的PBS或生理鹽水混合。

2、緩慢地將4ml混合血樣加到SIGMA公司銷售的密度為1.119的4mL淋巴細(xì)胞分離液上，血液與淋巴細(xì)胞分離液的界面保持清晰。

3、將具有血液與淋巴細(xì)胞分離液的試瓶置于水平離心機(jī)上進(jìn)行離心處理，調(diào)整水平離心機(jī)的離心率為200g，室溫離心20min，離心結(jié)束時(shí)不能使用離心機(jī)自帶的剎車系統(tǒng)，讓離心機(jī)離心結(jié)束后自然逐漸停止。

4、離心結(jié)束后棄去血漿、淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分離液以及最上層的紅細(xì)胞，取得剩余物質(zhì)。

5、將步驟4取得的剩余物質(zhì)加入PBS或生理鹽水至10mL，室溫下，在離心率為200g的水平離心機(jī)中離心處理20min，棄去上清，取沉淀以PBS或生理鹽水洗滌。

6、再將洗滌后的沉淀物經(jīng)過(guò)兩次與PBS或生理鹽水混合，經(jīng)離心，棄去上清的處理，取得洗滌三次的沉淀物。

7、將洗滌三次的沉淀物用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮。

二、分離紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：

將分離得到的家禽紅細(xì)胞，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，形態(tài)成橢圓形，如圖1所示，并肉眼可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核存在。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每1000個(gè)紅細(xì)胞才看見(jiàn)1-2個(gè)污染的淋巴細(xì)胞，因此利用本發(fā)明的方法分離的家禽紅細(xì)胞純度達(dá)到99.9%以上。

三、瑞氏染色法對(duì)家禽有核血細(xì)胞染色：

（1）玻片置于染片架上，滴加3～5滴瑞氏復(fù)合染色液，使其迅速覆蓋標(biāo)本1min。

（2）滴加緩沖液5～10滴，吸耳球?qū)?zhǔn)玻片吹氣，使緩沖液與染液充分混合，染色5-10 min。

（3）雙蒸水沖洗，晾干。

（4）光學(xué)顯微鏡觀察。

將染色的家禽紅細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡下觀察，如圖2所示：形態(tài)呈橢圓形，細(xì)胞核成藍(lán)紫色。同樣在顯微鏡不同的視野中，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每1000個(gè)紅細(xì)胞看見(jiàn)1-2個(gè)污染的淋巴細(xì)胞，因此利用本發(fā)明的方法分離的家禽紅細(xì)胞純度達(dá)到99.9%以上。