本發(fā)明屬于間充質干細胞的制備技術領域，具體涉及一種人脂肪間充質干細胞庫的構建方法。

背景技術：

脂肪組織大量存在于人體，是一種容易獲得的良好的組織工程材料，對軟組織缺損填充、豐胸、除皺具有較好的美容醫(yī)學治療效果，但脂肪組織移植的存活率較低，容易被吸收，脂肪液化及壞死等缺點極大地限制了脂肪組織的應用。研究表明，脂肪間充質干細胞能夠顯著促進脂肪組織移植的存活率。

脂肪間充質干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)是一類存在于脂肪組織且具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。脂肪間充質干細胞作為一種理想的種子細胞具有以下優(yōu)勢：1)脂肪組織中含有大量的間充質干細胞，而且脂肪組織的獲取容易，來源豐富，給患者帶來的痛苦較?。?)脂肪間充質干細胞具有較強的免疫調節(jié)能力，即使進行異體移植也不會引起強烈的抑制抗宿主疾病；3)脂肪間充質干細胞在增殖活性、細胞因子分泌能力、歸巢能力、遺傳背景穩(wěn)定等方面都具有較強的生物學特性，這些特性有助于促進組織再生和疤痕修復，在醫(yī)學美容都具有廣闊的應用前景。

目前，脂肪間充質干細胞的提取及建庫方法存在諸多缺點，如中國專利CN103074298A公開了一種人脂肪間充質干細胞庫及其構建方法，該方法包括以下步驟：1)無菌采集人體脂肪；2)油脂去除；3)膠原酶消化；4)紅細胞的裂解；5)擴大培養(yǎng)；6)凍存。中國專利CN104357387A公開了一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，首先用含低分子肝素鈣的生理鹽水反復沖洗脂肪組織，然后用Ⅰ型膠原酶溶液消化脂肪組織提取脂肪間充質干細胞。

上述兩種方法都采用了膠原酶消化法提取間充質干細胞，使得間充質干細胞提取的操作時間較長、工藝變復雜；膠原酶消化獲得的細胞懸液存在大量的紅細胞，上述第一種方法采用紅細胞裂解液去除紅細胞，第二種方法采用低分子肝素鈣去除紅細胞，這些方法不僅會對間充質干細胞的質量造成潛在的危險，而且還增加了生產成本，也不適合于臨床級脂肪間充質干細胞的應用。

綜上所述，現(xiàn)有技術中提取人脂肪間充質干細胞存在以下缺點：細胞純度不高、操作繁瑣、耗時耗力、生產成本較高等。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中存在的上述不足，本發(fā)明提供一種人脂肪間充質干細胞庫的構建方法，可有效解決現(xiàn)有技術中操作過程復雜，細胞純度低以及紅細胞去除繁瑣的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種人脂肪間充質干細胞庫的構建方法，包括以下步驟：

(1)采集供者的脂肪組織，將其剪成1-5mm³大小，裝于離心管(Corning)中，然后加入3倍體積的無菌生理鹽水(科倫藥業(yè))，于20℃、2000-5000r/min條件下離心10-20min；其中，供者年齡為18-30歲，脂肪組織采集部位為腹部、臀部、大腿兩側；

(2)離心完畢后，去除上層的油層，然后將處于中間層的脂肪組織轉入新的離心管，加入生理鹽水清洗1-2次；

(3)將清洗后的脂肪組織接種于完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO₂條件下進行培養(yǎng)；其中完全培養(yǎng)基成分為：無血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、30ng/mL bFGF(Cellgenix)、10ng/mL胰島素(Gibco)和體積濃度為2％的GlutaMAX(Gibco)；

(4)每隔5-8天更換一次培養(yǎng)基，待細胞融合度為70-80％時，用TrypLE^TM Select(Gibco)消化細胞；

(5)傳代培養(yǎng)：消化后進行離心處理，2000r/min離心3-5min，收集細胞，按照1×10⁴-2×10⁴個細胞/cm²的密度(此處密度為細胞個數與培養(yǎng)瓶底表面積的比計算得來)接種于T175培養(yǎng)瓶中，然后添加20mL完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，得脂肪間充質干細胞；

(6)針對步驟(5)所得的脂肪間充質干細胞，檢測以下項目中的至少一項：細胞活性、無菌檢測、細胞表面標志物檢測、核型檢測、HLA-ABC/DR配型、遺傳病檢測、支原體檢測、內毒素檢測；

(7)凍存：將傳代培養(yǎng)后符合檢測指標的脂肪間充質干細胞按照4×10⁶-8×10⁶個細胞/mL密度凍存于1mL凍存液中，凍存細胞經程序降溫至-80℃后轉入液氮罐中長期保存；

(8)建立包含以上信息的脂肪間充質干細胞的數據庫，并使該數據庫與步驟(7)的凍存細胞進行關聯(lián)。

進一步地，步驟(1)中對脂肪組織的處理需要在采集后48h內進行。

進一步地，步驟(3)中脂肪組織塊與完全培養(yǎng)基的重量體積比為(1-2:10-15)g/mL。

進一步地，步驟(7)中凍存時細胞密度為4×10⁶個細胞/mL。

進一步地，步驟(7)中凍存液由以下組分組成且各組分的質量分數為：80％無血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、10％人血白蛋白(Sigma)和10％二甲基砜(Origen)。

本發(fā)明提供的一種人脂肪間充質干細胞庫的構建方法，具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明使用的提取方法，步驟簡單，脂肪組織沒有使用膠原酶消化，只需直接貼壁培養(yǎng)即可得到純度高的脂肪間充質干細胞，不僅簡化了工藝流程，而且避免引入較多的外援干擾因素，使得工藝穩(wěn)定性較易控制。

(2)本發(fā)明采用離心法去除油脂和紅細胞，不會產生大量紅細胞，不需要采用紅細胞裂解液或低分子肝素鈣去除紅細胞，不會對人脂肪間充質干細胞造成潛在風險，同時還節(jié)約了成本。

(3)本發(fā)明方法采用完全無血清培養(yǎng)技術，避免了動物源血清成分的干擾，安全性高，達到臨床級別建庫工藝，有利于后期的臨床應用。

(4)該庫為健康成年人儲存脂肪間充質干細胞，為其本人及家庭成員或許可第三方在需要采用脂肪間充質干細胞移植治療各種疾病或進行醫(yī)療美容時，提供臨床適用的脂肪間充質干細胞和干細胞制劑。

附圖說明

圖1為脂肪組織凍存2個月、6個月、12個月后復蘇培養(yǎng)的細胞生長情況；其中圖1-1至1-4分別為未經凍存的脂肪組織培養(yǎng)的P0代細胞生長情況，脂肪組織凍存2個月后復蘇培養(yǎng)的P0代細胞生長情況，脂肪組織凍存6個月后復蘇培養(yǎng)的P0代細胞生長情況，脂肪組織凍存12個月后復蘇培養(yǎng)的P0代細胞生長情況；圖1-5至1-8分別為未經凍存的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞生長情況，脂肪組織凍存2個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞生長情況，脂肪組織凍存6個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞生長情況，脂肪組織凍存12個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞生長情況。

圖2為脂肪間充質干細胞多向誘導分化圖；其中圖2-1為對照圖；其中圖2-2為成脂誘導分化；圖2-3為成軟骨誘導分化；圖2-4為成骨誘導分化。

圖3為脂肪間充質干細胞陰性細胞表面標志物檢測結果圖；其中圖3-1至3-5為未經凍存的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果；圖3-6至3-10為脂肪組織凍存2個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果；圖3-11至3-15為脂肪組織凍存6個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果；圖3-16至3-20為脂肪組織凍存12個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果。

圖4為脂肪間充質干細胞陽性細胞表面標志物檢測結果圖；其中圖4-1至4-3為未經凍存的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果；圖4-4至4-6為脂肪組織凍存2個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果；圖4-7至4-9為脂肪組織凍存6個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果；圖4-10至4-12為脂肪組織凍存12個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞表面標志物檢測結果。

圖5為脂肪間充質干細胞核型分析圖；其中圖5-1為未經凍存的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞核型分析；圖5-2為脂肪組織凍存2個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞核型分析；圖5-3為脂肪組織凍存6個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞核型分析；圖5-4為脂肪組織凍存12個月后復蘇培養(yǎng)的P3代細胞核型分析。

圖6為脂肪間充質干細胞分泌的細胞因子檢測結果圖。

具體實施方式

實施例1脂肪間充質干細胞的分離

(1)與供者簽訂知情同意書，采集30mL女性(25歲)腹部脂肪組織，同時采集10mL供者血樣并檢測供者血型、HLA-ABC/DR配型、傳染病(乙肝兩對半、丙肝、巨細胞病毒、EB病毒、梅毒、艾滋病病毒)，保證其各項指標正常，然后將供者的脂肪組織剪成1-5mm³大小并將其平均分成3份，分別裝于50mL離心管中，加入30mL無菌生理鹽水，于20℃、4000r/min條件下離心15min，目的是進行脂肪組織脫油和去除脂肪組織中的紅細胞；

(2)離心完畢后，去除上層的油層，然后將處于中間層的脂肪組織轉入新的離心管，加入生理鹽水清洗1-2次；

(3)收集步驟(2)中的脂肪組織塊，稱取2g接種于T175培養(yǎng)瓶(Corning)中，加入12mL完全培養(yǎng)基，然后置于37℃、5％CO₂潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；其中完全培養(yǎng)基成分為：無血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、30ng/mL bFGF(Cellgenix)、10ng/mL胰島素(Gibco)和體積濃度為2％的GlutaMAX(Gibco)；細胞生長情況見圖1-1；

(4)收集步驟(2)中的脂肪組織塊，稱取6g凍存于6mL凍存液中，凍存液由以下組分組成且各組分的質量分數為：80％無血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、10％人血白蛋白(Sigma)和10％二甲基砜(Origen)，凍存的脂肪組織經程序降溫至-80℃后轉入液氮罐中，凍存時間分別為2個月、6個月、12個月。

實施例2脂肪組織的復蘇、傳代培養(yǎng)及凍存

(1)將凍存時間達到2個月、6個月、12個月的脂肪組織分別經37℃水浴復蘇；

(2)取出脂肪組織加入到50mL離心管中，加入30mL無菌生理鹽水，于4℃、1200r/min條件下離心3min；

(3)收集步驟(2)中的脂肪組織塊，稱取2g接種于T175培養(yǎng)瓶(Corning)中，加入12mL完全培養(yǎng)基，然后置于37℃、5％CO₂潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每7天更換一次培養(yǎng)基；凍存2個月、6個月、12個月的脂肪組織經復蘇培養(yǎng)的P0代細胞生長情況見圖1-2、1-3、1-4；

(4)待細胞融合度為70％時，用TrypLE^TM Select(Gibco)消化細胞，消化后進行離心處理，1200r/min離心3min，收集細胞，按照1×10⁴個細胞/cm²的密度接種于T175培養(yǎng)瓶中，然后添加20mL完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞融合度達到70％～90％。未經凍存、凍存2個月、凍存6個月、凍存12個月的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞生長情況見圖1-5、1-6、1-7、1-8；

(5)將P3代細胞按密度4×10⁶個細胞/mL重懸于凍存液(成分及質量分數：80％無血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、10％人血白蛋白(Sigma)、10％二甲基砜(Origen))中，凍存體積為1mL，然后經程序降溫到-80℃后放置于液氮罐中長期保存。

由圖1可得，未經凍存、凍存2個月、凍存6個月、凍存12個月的脂肪組織培養(yǎng)的P0代細胞培養(yǎng)物中均含有脂肪油滴，呈圓形發(fā)亮斑點，當細胞傳代培養(yǎng)至P3代時，細胞培養(yǎng)物中的脂肪油滴消失。

實施例3脂肪間充質干細胞生物學特性鑒定

1、多向誘導分化潛能的鑒定

將P3代脂肪間充質干細胞接種于六孔板中，每孔接種1×10⁵個細胞，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，每個樣本設置3個重復，每兩天更換一次培養(yǎng)基，待細胞融合度為70％時分別加入成骨、成脂、成軟骨誘導培養(yǎng)基(Cyagen)各2mL，以添加完全培養(yǎng)基作為空白對照，每2-3天更換一次誘導培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2-3周后，去除誘導培養(yǎng)基并用PBS清洗一次，加入2mL多聚甲醛溶液(4％，v/v)固定30min，然后去除多聚甲醛溶液并用PBS清洗兩次，采用染色液染色，成骨誘導、成軟骨誘導染色時間為2-3min；成脂誘導染色時間為30min，然后移除染色液并加入1mL PBS溶液清洗一次，最后置于倒置顯微鏡下觀察、拍攝照片，結果見圖2。

由圖2可知，經過2-3周的誘導培養(yǎng)，脂肪間充質干細胞能夠進行成脂、成骨、成軟骨誘導分化。

2、表面標志物檢測

將融合度為90％的P3代脂肪間充質干細胞用TrypLE^TMSelect消化處理后，計數并調節(jié)密度為1×10⁶個細胞/mL的細胞懸浮液，100μm細胞篩網過濾后，分別加入10μL熒光標記的細胞表面標志物抗體于1mL細胞懸液中，置于4℃、避光條件下孵育20min，并以未進行抗體標記的等量細胞懸液作為空白對照；所使用的抗體有：CD11b-FITC、CD19-ECD、CD34-PE、CD45-PC7、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PC7；孵育完成后，用冷的生理鹽水(4℃)清洗一次，1200r/min離心5min，棄上清，加入250μL生理鹽水混勻，并加入250μL的1％多聚甲醛固定，標記后的細胞采用Beckman公司的流式細胞分析儀進行檢測分析，檢測的細胞分4種：未經凍存的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞；凍存2個月后復蘇的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞；凍存6個月后復蘇的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞；凍存12個月后復蘇的脂肪組織培養(yǎng)的P3代細胞；結果見圖3和4。

由圖3和4可知，表面含標志物的細胞率分別為：

未凍存：CD11b：0.03％；CD19：0.90％；CD34：1.98％；CD45：0.42％；HLA-DR：0.16％；CD73：99.39％；CD90：99.98％；CD105：83.63％；

凍存2個月：CD11b：1.29％；CD19：0.98％；CD34：0.40％；CD45：0.87％；HLA-DR：1.06％；CD73：97.51％；CD90：99.99％；CD105：99.91％；

凍存6個月：CD11b：0.41％；CD19：1.15％；CD34：1.38％；CD45：0.41％；HLA-DR：0.59％；CD73：97.44％；CD90：99.91％；CD105：99.92％；

凍存12個月：CD11b：0.44％；CD19：1.91％；CD34：1.40％；CD45：0.38％；HLA-DR：0.54％；CD73：99.39％；CD90：99.89％；CD105：98.78％。

經流式檢測分析發(fā)現(xiàn)脂肪間充質干細胞幾乎不表達造血細胞表面標志如CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；表達間充質干細胞陽性標志物如CD73、CD90、CD105。

3、脂肪間充質干細胞核型分析

將1×10⁶個P3代細胞分別接種于T75培養(yǎng)瓶中，然后加入10mL完全培養(yǎng)基，放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)48-72小時后收獲，收獲前加入0.2％濃度的秋水仙素，37℃，孵育4小時后收獲，收獲后通過離心、棄上清、低滲、固定、滴片，最后染色顯帶；此外將收獲的細胞凍存2個月、6個月、12個月后分別復蘇，進行核型分析，分析結果見圖5。

經核型分析，脂肪間充質干細胞在傳代后均未出現(xiàn)明顯的染色體異常。

4、脂肪間充質干細胞分泌的細胞因子檢測

按每個T175培養(yǎng)瓶接種2×10⁶個P3代脂肪間充質干細胞，加入20mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到80％時去除培養(yǎng)基，加入10mL DMEM(Hyclone)并放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)液，20℃、4000r/min離心20min，吸取上清液，參照ELISA檢測試劑盒說明書(R&D)檢測各個細胞因子(IGF-1、PDGF、HGF、EGF、FGF、VEGF)的表達量，結果見圖6。

由結果可知，脂肪間充質干細胞分泌較高的VEGF(血管內皮生長因子)、HGF(肝細胞因子)，F(xiàn)GF(成纖維細胞生長因子)，分泌少量PDGF(血小板生長因子)、IGF-1(胰島素樣生長因子)和EGF(表皮生長因子)。

實施例4脂肪間充質干細胞數據庫的建立

1、細胞活性的檢測

利用臺盼藍染色法計數凍存前后活細胞的數目。

2、細胞感染的檢測

利用少量細胞培養(yǎng)，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。利用病原學方法，檢測細胞是否受到乙肝兩對半(HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb)、丙肝(HCVAb)、艾滋(HIV-1/2Ab)、巨細胞病毒(CMV-IgA)、EB病毒和梅毒感染。

3、遺傳病的檢測

利用分子遺傳學的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。

4、HLA-ABC/DR配型

檢測細胞HLA-ABC/DR表型，并記錄在案。

5、細胞來源的調查

記錄供者詳細資料，并記錄在案。

6、脂肪間充質干細胞數據庫的建立

在保存正常的脂肪間充質干細胞后，建立脂肪間充質干細胞的數據庫，其中包括前五項資料，并建立與凍存細胞的關聯(lián)。