本發(fā)明涉及一種皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞與組織工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，男性不育患者約占我國(guó)育齡人口的10%，而40%以上的男性不育是由于精子發(fā)生異常造成的。雖然輔助生殖技術(shù)給許多患者帶來(lái)了曙光，但是單靠輔助生殖和藥物治療還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。利用干細(xì)胞向生殖細(xì)胞的定向分化可以在體外建立生殖細(xì)胞發(fā)生的模型并最終獲得功能性配子，這對(duì)研究生殖細(xì)胞發(fā)生的調(diào)控機(jī)制以及治療男性不育癥等方面具有重要意義。

干細(xì)胞(stem cells，SC)是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(somatic stem cell)。成體干細(xì)胞是指存在于已分化組織中的未分化細(xì)胞，這些細(xì)胞多數(shù)處于休眠狀態(tài)且維持其多能性，一定條件下，它們能夠自我更新并且能夠分化形成特異組織的細(xì)胞類型，表現(xiàn)出其多向分化潛能。相對(duì)于其它成體干細(xì)胞，皮膚干細(xì)胞廣泛分布于人體最大的器官且取材更為方便，在臨床應(yīng)用上沒(méi)有免疫排斥和倫理性問(wèn)題，因此，皮膚來(lái)源的干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化備受關(guān)注。

然而，皮膚干細(xì)胞體外向精子誘導(dǎo)分化的報(bào)導(dǎo)很少，至今仍沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。其他成體干細(xì)胞體外向精子分化的研究也大多數(shù)來(lái)至精原干細(xì)胞。1994年，Hofmann等在體外建立了精原干細(xì)胞系，而且這些細(xì)胞系在特定的條件下能夠進(jìn)入減數(shù)分裂，但最終無(wú)法獲得單倍體細(xì)胞，表明這個(gè)細(xì)胞系在體外培養(yǎng)的條件下不能突破減數(shù)分裂期。2002年，F(xiàn)eng等在體外建立一種細(xì)胞系，而這些細(xì)胞在干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下能夠突破減數(shù)分裂并產(chǎn)生頂體樣結(jié)構(gòu)。但是由于后續(xù)沒(méi)有被其他實(shí)驗(yàn)室重復(fù)，所以至今仍未被廣泛利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷并發(fā)揚(yáng)優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明旨在提供一種首次采用皮膚干細(xì)胞作為原始細(xì)胞，對(duì)機(jī)體傷害小、無(wú)倫理問(wèn)題限制的小鼠皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，包括將皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞、將原始生殖細(xì)胞植入受體鼠睪丸獲得精子細(xì)胞兩個(gè)步驟，其中：

1）將皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞具體為：

①皮膚干細(xì)胞準(zhǔn)備：分別提取培養(yǎng)了1-2代綠色熒光轉(zhuǎn)移基因小鼠的皮膚干細(xì)胞與野生型小鼠成纖維細(xì)胞，并將野生型小鼠成纖維細(xì)胞采用絲裂霉素C處理，然后將皮膚干細(xì)胞與處理后的成纖維細(xì)胞按照質(zhì)量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養(yǎng)基作為原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基內(nèi)加入以DMEM高糖總質(zhì)量計(jì)8%~12%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計(jì)40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形態(tài)發(fā)生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子, 15ng/ml~25 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 30ng/ml~50ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)溫度35℃-38℃，濕度不低于80%，環(huán)境中CO₂濃度4%-6%；

③將步驟①獲得的待用混合細(xì)胞植入步驟②準(zhǔn)備的原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基放置在培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)8-10天，即獲得誘導(dǎo)分化出的原始生殖細(xì)胞；

2）將原始生殖細(xì)胞植入受體鼠睪丸獲得精子細(xì)胞具體為：

①準(zhǔn)備受體鼠；

②將1）中步驟③獲得的原始生殖細(xì)胞稀釋至0.8×10⁶個(gè)/L ~1.2×10⁶個(gè)/L，然后利用常規(guī)睪丸注射技術(shù)將其注射進(jìn)行受體睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，培育至通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)出現(xiàn)典型精子形態(tài)的細(xì)胞，則所述具有典型精子形態(tài)的細(xì)胞為所需精子細(xì)胞。

上述皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，其中：在步驟1）將皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞和將原始生殖細(xì)胞植入受體鼠睪丸獲得精子細(xì)胞之間還增加有原始生殖細(xì)胞專向培養(yǎng)步驟，具體為：將1）中步驟③獲得的原始生殖細(xì)胞放入專向培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，所述專向培養(yǎng)基具體為：以DMEM高糖培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，其內(nèi)添加以DMEM高糖總質(zhì)量計(jì)8%~12%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計(jì)15ng/ml~25 ng/ml骨形態(tài)發(fā)生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 15ng/ml~25ng/ml表皮生長(zhǎng)因子, 30ng/ml~50 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 30ng/ml~50ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)時(shí)間3-5天，溫度35℃-38℃，濕度不低于80%；環(huán)境中CO₂濃度4%-6%。

上述皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，其中：原始生殖細(xì)胞在受體鼠睪丸內(nèi)的培育周期為25天-40天。

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：采用小鼠皮膚干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞作為原細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，一方面對(duì)機(jī)體傷害小，另一方面，也無(wú)倫理問(wèn)題限制，具有更廣闊的應(yīng)用前景和重大的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)意義；采用的培養(yǎng)基成份配置更為合理、營(yíng)養(yǎng)更齊全且更專向，用于適用的皮膚干細(xì)胞定向培養(yǎng)精子細(xì)胞的效率高、再現(xiàn)率高、純度高、質(zhì)量好；清楚地劃分了初步誘導(dǎo)分化和最終體內(nèi)培養(yǎng)，一方面使本發(fā)明的專向性更強(qiáng)，另一方面也為實(shí)際應(yīng)用的步驟優(yōu)化提供了更大的空間和應(yīng)用價(jià)值，也大大降低了培養(yǎng)難度，提高了再現(xiàn)性；本發(fā)明方法建立了小鼠皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，以小鼠皮膚干細(xì)胞為材料，先在體外誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞，并通過(guò)睪丸注射技術(shù)利用體內(nèi)環(huán)境將原始生殖細(xì)胞分化有典型精子形態(tài)的精子，為皮膚干細(xì)胞向配子分化及研究應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1 為小鼠皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)及傳代圖片。

圖2 為小鼠皮膚干細(xì)胞分化的原始生殖細(xì)胞圖片。

圖3為正常小鼠和白消安處理小鼠的睪丸圖片。

圖4為小鼠皮膚干細(xì)胞分化的原始生殖細(xì)胞注射到受體鼠睪丸圖片。

圖5為受體鼠睪丸組織切片HE染色圖片。

圖6為受體鼠睪丸切片免疫熒光組織化學(xué)染色圖片。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明方法做進(jìn)一步闡述。

實(shí)施例1

一種皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，包括將皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞、將原始生殖細(xì)胞植入受體鼠睪丸獲得精子細(xì)胞兩個(gè)步驟，其中：

1）將皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞具體為：

①皮膚干細(xì)胞準(zhǔn)備：分別提取培養(yǎng)了1代綠色熒光轉(zhuǎn)移基因小鼠的皮膚干細(xì)胞與野生型小鼠成纖維細(xì)胞，并將野生型小鼠成纖維細(xì)胞采用絲裂霉素C處理，然后將皮膚干細(xì)胞與處理后的成纖維細(xì)胞按照質(zhì)量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養(yǎng)基作為原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基內(nèi)加入以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總質(zhì)量計(jì)8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胎牛血清、以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總體積計(jì)40 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml骨形態(tài)發(fā)生因子、0.20 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巰基乙醇, 8ng/ml表皮生長(zhǎng)因子, 15ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 30ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)溫度35℃，濕度80%；環(huán)境中CO2濃度4%；

③將步驟①獲得的待用混合細(xì)胞植入步驟②準(zhǔn)備的原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基放置在培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)8-10天，即獲得誘導(dǎo)分化出的原始生殖細(xì)胞；

2）將原始生殖細(xì)胞植入受體鼠睪丸獲得精子細(xì)胞具體為：

①準(zhǔn)備受體鼠；

②將1）中步驟③獲得的原始生殖細(xì)胞稀釋至0.8×10⁶個(gè)/L，然后利用常規(guī)睪丸注射技術(shù)將其注射進(jìn)行受體睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，40天后，通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)出現(xiàn)典型精子形態(tài)的細(xì)胞，則所述具有典型精子形態(tài)的細(xì)胞為所需精子細(xì)胞。

實(shí)施例2

一種皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，包括將皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞專向培養(yǎng)、將原始生殖細(xì)胞植入受體鼠睪丸獲得精子細(xì)胞三個(gè)步驟，其中：

1）將皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為原始生殖細(xì)胞具體為：

①皮膚干細(xì)胞準(zhǔn)備：分別提取培養(yǎng)了2代綠色熒光轉(zhuǎn)移基因小鼠的皮膚干細(xì)胞與野生型小鼠成纖維細(xì)胞，并將野生型小鼠成纖維細(xì)胞采用絲裂霉素C處理，然后將皮膚干細(xì)胞與處理后的成纖維細(xì)胞按照質(zhì)量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養(yǎng)基作為原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基內(nèi)加入以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總質(zhì)量計(jì)12%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胎牛血清、以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總體積計(jì)60 mIU/ml促卵泡素、120IU/ml白血病抑制因子、25ng/ml骨形態(tài)發(fā)生因子、0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.12 mmol/L非必需氨基酸，2.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 12ng/ml表皮生長(zhǎng)因子, 25ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 50ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)，溫度38℃，濕度85%；環(huán)境中CO2濃度6%；

③將步驟①獲得的待用混合細(xì)胞植入步驟②準(zhǔn)備的原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基放置在培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)8-10天，即獲得誘導(dǎo)分化出的原始生殖細(xì)胞；

2）原始生殖細(xì)胞專向培養(yǎng)，具體為：

將1）中步驟③獲得的原始生殖細(xì)胞放入專向培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，所述專向培養(yǎng)基具體為：以DMEM高糖培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，其內(nèi)添加以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總質(zhì)量計(jì)8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胎牛血清、以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總體積計(jì)15ng/ml骨形態(tài)發(fā)生因子、0.20 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巰基乙醇, 15ng/ml表皮生長(zhǎng)因子, 30ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 30ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)時(shí)間3天，溫度35℃，濕度80%；環(huán)境中CO₂濃度4%；經(jīng)過(guò)一定時(shí)間專向培養(yǎng)后可獲得更加純化、數(shù)量更多、形態(tài)更佳的原始生殖細(xì)胞。

3）將原始生殖細(xì)胞植入受體鼠睪丸獲得精子細(xì)胞具體為：

①準(zhǔn)備受體鼠；

②將2）中獲得的原始生殖細(xì)胞稀釋至1.2×10⁶個(gè)/L，然后利用常規(guī)睪丸注射技術(shù)將其注射進(jìn)行受體睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，25天后，通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)出現(xiàn)典型精子形態(tài)的細(xì)胞，則所述具有典型精子形態(tài)的細(xì)胞為所需精子細(xì)胞。

實(shí)施例3

大體與實(shí)施例2相同，其差別在于：

2）原始生殖細(xì)胞專向培養(yǎng)，具體為：

將1）中步驟③獲得的原始生殖細(xì)胞放入專向培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，所述專向培養(yǎng)基具體為：以DMEM高糖培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，其內(nèi)添加以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總質(zhì)量計(jì)12%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胎牛血清、以培養(yǎng)基內(nèi)DMEM高糖總體積計(jì)25 ng/ml骨形態(tài)發(fā)生因子、0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.12 mmol/L非必需氨基酸，2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 25ng/ml表皮生長(zhǎng)因子, 50 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 50ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)時(shí)間5天，溫度38℃，濕度85%；環(huán)境中CO₂濃度6%；經(jīng)過(guò)一定時(shí)間專向培養(yǎng)后可獲得更加純化、數(shù)量更多、形態(tài)更佳的原始生殖細(xì)胞。

實(shí)施例4

本實(shí)施例為了更詳細(xì)地闡述本發(fā)明的皮膚干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體內(nèi)發(fā)育分化為精子的方法，結(jié)合圖片、具體操作流程、用到的器具、具體藥品的來(lái)源等，將方法的步驟更加詳細(xì)地描述如下：

1、小鼠皮膚干細(xì)胞的分離

取當(dāng)天新生的綠色熒光轉(zhuǎn)基因CD1雄性小鼠，斷頸處死后用75%的酒精擦拭干凈，再用生理鹽水清洗一遍。用剪刀順著小鼠背部外側(cè)剪開(kāi)皮膚，用鑷子將背部皮膚撕下放入DMEM/F12中，用彎鑷子去掉皮膚上的脂肪和血液。將皮膚置于2-3 mL含有1%青鏈霉素（PS）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中清洗3次，然后每5-7只小鼠皮膚為一組轉(zhuǎn)移到6 cm培養(yǎng)皿中。用剪刀將小鼠皮膚剪成< 1 mm2的碎片，之后轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入PBS到10 mL，1200 rpm離心3 min，重復(fù)洗滌3次。棄上清，加1 mL的0.25%胰酶后，置于37℃、飽和濕度、5% CO₂培箱中消化20-30 min。取出離心管，每管加入1 mL 0.1% DNase I，室溫孵育1 min。加入9 mL PBS，重懸細(xì)胞，1200 rpm離心3 min。棄上清，加入10 mL PBS，重懸細(xì)胞，1200 rpm離心3 min。棄上清，加入10 mL DMEM/F12，重懸細(xì)胞，1200 rpm離心3 min，重復(fù)清洗3遍。棄上清，加入1 mL DMEM/F12，使用移液槍帶上槍頭敲打組織，直至組織懸液可以自由吸入槍頭。加入10 mL的DMEM/F12，重懸細(xì)胞，并使用40 um的一次性細(xì)胞篩過(guò)濾組織，將細(xì)胞收集到50 mL離心管中，1500 rpm離心5 min。棄上清，加10 mL干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至10 cm懸浮培養(yǎng)皿中。此時(shí)細(xì)胞記為P0代。小鼠皮膚干細(xì)胞干細(xì)胞培養(yǎng)基包含DMEM/F12；2% B27；20ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子；40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；1% 青鏈霉素；以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，每4天傳代一次。圖1中(1)是剛培養(yǎng)的皮膚干細(xì)胞懸液，培養(yǎng)的第二天會(huì)有類似細(xì)胞聚集物出現(xiàn)（圖1中（2）），第四天時(shí)皮膚干細(xì)胞克隆球邊緣清晰，結(jié)構(gòu)緊湊（圖1中（3）。傳代后雜細(xì)胞數(shù)目減少，皮膚干細(xì)胞克隆球數(shù)目也越來(lái)越多（圖1中（4））。

2、小鼠原始生殖細(xì)胞（PGC）的誘導(dǎo)

收集1-2代的皮膚干細(xì)胞克隆球，用0.25% Trypsin消化，室溫消化過(guò)程中用槍吹打至單細(xì)胞，用10%胎牛血清終止消化，收集細(xì)胞，1500rpm離心5min；棄上清，加入少量原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋到細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)/ml 原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基里；

取1-3代成纖維細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，加入4ml含有10μg絲裂霉素C的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中1.5-2小時(shí)，取出用磷酸鹽緩沖液洗5遍，用0.25% Trypsin將貼壁的成纖維細(xì)胞消化下來(lái)，洗滌后加入原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋至5×10⁴個(gè)/ml，將兩種細(xì)胞混合液1:1混合，加入到6cm原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并置于37℃、飽和濕度、5%CO₂中培養(yǎng)，原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：DMEM高糖, 10% 胎牛血清, 50 mIU/ml促卵泡素，100 IU/ml 白血病抑制因子，20 ng/ml 骨形態(tài)發(fā)生因子（BMP-4）， 0.23 mmol/L 丙酮酸鈉, 0.1 mmol/L 非必需氨基酸, 2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巰基乙醇, 10 ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子, 20 ng/ml 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 40 ng/ml 干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。細(xì)胞懸液開(kāi)始呈懸浮狀態(tài)（圖2中（1）），在第二天基本貼壁（圖2中（2）），在培養(yǎng)的8-10天，出現(xiàn)折光度大，“亮晶晶”的細(xì)胞（圖2中（3）），此時(shí)更換原始生殖細(xì)胞專向培養(yǎng)基，成分包括：DMEM高糖, 10% 胎牛血清, 0.23 mmol/L 丙酮酸鈉, 0.1 mmol/L 非必需氨基酸, 2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巰基乙醇, 20 ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子, 40 ng/ml 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，20 ng/ml 骨形態(tài)發(fā)生因子（BMP-4），40 ng/ml 干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）（加入原始生殖細(xì)胞專向培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基中原始生殖細(xì)胞數(shù)目隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，數(shù)目越來(lái)越多（圖2中（4））。

3、受體鼠睪丸注射

將原始生殖細(xì)胞收集并洗滌后加入0.1% 臺(tái)盼藍(lán)染色后，置于冰上。選取狀態(tài)好的受體鼠，受體鼠經(jīng)過(guò)白消安處理，與正常小鼠（圖3中（1））對(duì)比，其生精上皮已被摧毀（圖3中（2）），腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。劑量：240 mg/kg。待小鼠昏迷后，將其仰臥并用膠帶固定四肢于硬紙板上。用酒精濕潤(rùn)小鼠腹側(cè)皮膚，剪去小鼠腹側(cè)毛。在受體鼠腹部由下至上縱向依次剪開(kāi)皮膚、腹膜及腹肌，切口距離生殖器大約0.5cm左右，長(zhǎng)度大約1 cm左右。用鑷子將睪丸拉出腹腔：于膀胱旁邊尋找與睪丸相連的脂肪墊，輕輕拖出腹腔，小鼠的睪丸和附睪順勢(shì)被拖出腹腔。在體視鏡下找到受體鼠輸出小管，并調(diào)整輸出小管角度角度，使小鼠輸出小管的方向大約與注射針?lè)较蚱叫?。雙手操作，夾起輸出小管，將其中一段套入玻璃針頭部，并順勢(shì)平行將輸出管向玻璃針的方向移動(dòng)。進(jìn)針到位后，緩緩?fù)苿?dòng)活塞，將原始生殖細(xì)胞液注入受體鼠曲細(xì)精管。將睪丸、附睪及其脂肪緩慢送入腹腔并歸置原處，依次縫合腹肌和皮膚?？p合后依次用75%酒精和碘酊消毒，并將小鼠置于溫暖處，待其蘇醒后放回層流架進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。睪丸注射一個(gè)月后，受體鼠睪丸即可取出進(jìn)行下一步分析。圖4是小鼠皮膚干細(xì)胞分化的原始生殖細(xì)胞注射到受體鼠睪丸曲細(xì)精管中。

4、受體鼠睪丸HE切片染色觀察組織結(jié)構(gòu)

將受體鼠睪丸取出，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，經(jīng)洗滌--脫水—透明—石蠟包埋—組織切片，將切片經(jīng)兩次二甲苯每步10min將切片上的石蠟脫凈，經(jīng)無(wú)水酒精及各級(jí)酒精下行至水。蘇木精溶液染色約5分鐘。將片子放入自來(lái)水染缸中，換染缸至自來(lái)水不變色為止。放入0.5%鹽酸的70%酒精溶液（簡(jiǎn)稱1.5%鹽酸酒精）分色。分色時(shí)，邊分色邊鏡檢，至細(xì)胞核染色清楚，一般情況下，在鹽酸酒精中蘸三次即可，每次不超過(guò)1s。分色后用自來(lái)水洗堿化，直至細(xì)胞核變成藍(lán)色。這一步驟也可稱為“藍(lán)化”。放入蒸餾水洗去堿性成分。若切片中殘留過(guò)多的堿性物質(zhì)則對(duì)以后的伊紅染色不利。依次放入50%、70%及80%的酒精。放入1%伊紅酒精染液2分鐘。以95%酒精對(duì)伊紅分色，至胞漿、結(jié)締組織等呈桃紅色。一般1min即可。再放到95%酒精，無(wú)水酒精脫水。每步時(shí)間為20s。放入二甲苯透明（15min左右）。取出切片，將組織周圍多余的二甲苯擦去，滴樹(shù)膠后加蓋玻片封固。通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，受體鼠睪丸中仍有大部分曲細(xì)精管是精子發(fā)生缺失的，但有部分曲細(xì)精管已經(jīng)恢復(fù)了精子發(fā)生（圖5）。

5、受體鼠睪丸免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)特定基因表達(dá)

將受體鼠睪丸取出，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，經(jīng)洗滌--脫水—透明—石蠟包埋—組織切片，然后將切好的石蠟切片即白片放入60 ℃烘箱烘2 h。經(jīng)兩次二甲苯每次15 min將切片上的石蠟脫凈。脫蠟后經(jīng)無(wú)水酒精及各級(jí)酒精下行至水，將復(fù)水的切片放入檸檬酸抗原修復(fù)液中，96 ℃，修復(fù)15 min。修復(fù)液冷卻至室溫后，將片子取出后，放在水平濕盒內(nèi)，用鉛筆在組織切片的區(qū)域做好標(biāo)記，之后將片子放入TBS 中洗5 min，再轉(zhuǎn)入TBST 中洗5 min。加上BDT (3% BSA和10%山羊血清溶于TBS) 封閉，大約的量為每張片子100 μL。之后加封口膜在切片區(qū)域。室溫放置30 min。將封口膜揭掉，將片子上多余的封閉液倒在吸水紙上。加適量一抗于切片位置，一般為20 μL。用封口膜封一抗，注意不能有氣泡，尤其在組織切片位置。將載玻片放入濕盒內(nèi)，用封口袋封住，37 ℃孵育1 h。一抗孵育結(jié)束后，取出片子，將片子泡入TBST中。一共洗三次，每次10 min。將片子上的TBST倒在吸水紙上，加上熒光標(biāo)記的二抗，一般加20 μL的量。用封口膜封住二抗后，放入濕盒內(nèi)，用封口袋封住，37 ℃孵育15 min。孵育結(jié)束后，將片子取出，揭掉封口膜，TBST洗三次，分別為10 min，20 min，20 min。將片子上多余的TBST倒在吸水紙上，滴加適量的Hoechst 33342，一般為10 μL，在切片位置添加封口膜，常溫孵育3 min，染色時(shí)間要控制好，切片染色要明顯快于細(xì)胞染色。將封口膜揭掉，PBS洗3次，每次5 min。將多余的PBS倒在吸水紙上。加Vectashield封片，加的量視片子上組織的面積而定，一般情況下加5~10 μL即可。注意不要直接滴加在組織上，應(yīng)滴在組織切片邊上，再用蓋玻片蓋住片子。做好的切片置于干盒中，套上封口袋防止切片凝水，4 ℃保存，鏡檢觀察。注意不能置于濕盒中。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體睪丸中恢復(fù)精子發(fā)生的曲細(xì)精管內(nèi)，生精上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)GFP（圖6中（1-2））和MVH（圖6中（1-3）），說(shuō)明恢復(fù)精子發(fā)生的細(xì)胞來(lái)自小鼠皮膚干細(xì)胞分化的原始生殖細(xì)胞。

對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的上述說(shuō)明，僅為了使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。